蛋白質(zhì)檢測方法

1、整理ppt1蛋白質(zhì)檢測研究進展蛋白質(zhì)檢測研究進展整理ppt2Contents1、蛋白質(zhì)簡介2、蛋白質(zhì)的檢測方法3、蛋白質(zhì)與疾病的關(guān)系整理ppt3蛋白質(zhì)簡介 蛋白質(zhì)是由氨基酸脫水縮合形成的空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子有機物，其主要化學(xué)元素為 C（約 50%）、O（約23%）、N（約16%）、H（約7%）、S（約 03%）。氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位，蛋白質(zhì)既具有氨基酸的部分理化特性，也具有其它有機物的一些共性以及眾多的自身獨有特點與性質(zhì)： 高分子、兩性解離及等電點、水合作用、變性作用、顯色反應(yīng)（雙縮脲反應(yīng)、Folin-酚反應(yīng)、茚三酮反應(yīng)、米倫反應(yīng)、黃蛋白反應(yīng)、乙醛酸反應(yīng)、坂口反應(yīng)、偶氮反應(yīng)、考馬斯亮藍

2、反應(yīng)、氨基酸的-氨基及-羧基反應(yīng)、）蛋白質(zhì)的異常表達與體內(nèi)多種疾病的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān) 整理ppt4蛋白質(zhì)的檢測方法傳統(tǒng)蛋白質(zhì)檢測方法：免疫印跡法；酶聯(lián)免疫吸附試驗常規(guī)方法： 物理法：紫外吸收法 化學(xué)法：凱氏定氮法；比色法高效液相色譜法毛細管凝膠電泳法近紅外光譜法質(zhì)譜法熒光法整理ppt5免疫印跡法（ Western blot）原理：蛋白樣品經(jīng)過電泳分離后，轉(zhuǎn)移并固定于膜上，然后應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)進行特異性檢測的方法。 Western 雜交是將蛋白質(zhì)電泳、印跡、免疫測定相結(jié)合的特異性蛋白質(zhì)的檢測方法免疫印跡法是檢測蛋白質(zhì)混合溶液中某種特定目的蛋白的定性方法，也可以作為確定同一種蛋白質(zhì)在不同細胞或同一

3、種細胞在不同條件下的相對含量的半定量方法。整理ppt6免疫印跡法檢免疫印跡法檢測樣品中特異測樣品中特異蛋白質(zhì)的基本蛋白質(zhì)的基本流程流程樣品的凝膠電泳樣品的凝膠電泳蛋白印跡蛋白印跡封閉反應(yīng)封閉反應(yīng)與特異性抗體（一抗）孵育與特異性抗體（一抗）孵育與酶耦聯(lián)的二抗孵育與酶耦聯(lián)的二抗孵育顯色或化學(xué)發(fā)光顯影顯色或化學(xué)發(fā)光顯影觀察和記錄結(jié)果觀察和記錄結(jié)果整理ppt7酶聯(lián)免疫吸附試驗原理：酶聯(lián)免疫吸附試驗（ enzyme linked immunosorbant assay，ELISA）是一種固相免疫測定技術(shù)，先將已知的抗原或抗體包被到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。測定時，將待檢樣本和酶標抗原或抗體按不

4、同步驟與固相載體表面吸附的抗原或抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。最后加入酶反應(yīng)底物，根據(jù)底物被酶催化產(chǎn)生的顏色及其光密度（OD）值的大小進行定性或定量分析。優(yōu)點：靈敏度高；特異性好；簡便；重復(fù)性好。ELISA 和 Western 雜交都利用抗原抗體間的分子識別作用，借助不同的抗體分子標記實現(xiàn)蛋白質(zhì)的檢測。整理ppt8紫外吸收法 理論基礎(chǔ)：蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基使其在 280 nm 處具有紫外吸收， 其吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比。 此外，蛋白質(zhì)溶液在 238 nm 的吸光度值與肽鍵含量成正比。 利用一定波長下蛋白質(zhì)溶液的吸光度值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系可以測定蛋白質(zhì)含量。優(yōu)點：簡便、靈敏、快

5、速，不消耗樣品，測定后能回收缺點:準確度較差、專一性差、干擾物質(zhì)多，若樣品中含有嘌呤、 嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大的干擾整理ppt9凱氏定氮法理論基礎(chǔ)：各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，通常占其總重量的16左右。蛋白質(zhì)樣品用濃硫酸消化后，可以轉(zhuǎn)變?yōu)榱蛩徜@，硫酸銨中的NH4+與NaOH反應(yīng)又可轉(zhuǎn)變?yōu)镹H3，用硼酸液吸收后，可由標準鹽酸滴定并定量。凱氏定氮法由于蛋白質(zhì)是體內(nèi)的主要含氮物，因此，通過測定生物樣品的含氮量便可估算出樣品中的總蛋白質(zhì)含量。 蛋白質(zhì)含量含氮量 6.25此方法的測定范圍為0.21.0 mg氮。優(yōu)點：應(yīng)用范圍廣，重現(xiàn)性好、準確度高缺點：局限于樣品中總蛋白的檢測，破壞蛋白

6、質(zhì)結(jié)構(gòu)，易受到被測樣品中其它有機含氮化合物的干擾整理ppt10比色法-雙縮脲法原理：蛋白質(zhì)含有兩個以上的肽鍵，故有雙縮脲（NH2-CO-NH-CO-NH2）反應(yīng)。在堿性條件下，肽鍵的質(zhì)子被解離，Cu2+和失去質(zhì)子的多肽鏈的氮相結(jié)合產(chǎn)生穩(wěn)定的紫色絡(luò)合物，在540560 nm的光吸收值與蛋白質(zhì)的含量在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。由于與雙縮脲試劑與不同種類的蛋白質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)物的顏色差別極小，使得該方法比較適合總蛋白質(zhì)的檢測。優(yōu)點：操作簡單、測量速度快缺點：靈敏度較差，精度不高整理ppt11比色法-Folin-酚試劑/Lowry法原理：1、蛋白質(zhì)在堿性條件下與試劑甲（雙縮脲試劑）中的Cu2+形成絡(luò)合物。 2、由

7、于蛋白質(zhì)含芳香族氨基酸殘基（如Tyr和Trp），生成的絡(luò)合物可還原試劑乙（Folin-酚試劑）中的磷鉬酸和磷鎢酸而產(chǎn)生鉬藍和鎢藍復(fù)合物，該復(fù)合物顯藍色，其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，可用于定量分析。優(yōu)點：反應(yīng)靈敏，檢測限低，比較適合微量蛋白質(zhì)的測量缺點：Folin-酚試劑在堿性條件下極不穩(wěn)定因而要求精確控制操作時間，且容易受去酚類、糖類、尿素等多種物質(zhì)的干擾。此外，而不同的蛋白質(zhì)的酪氨酸和色氨酸的含量不同，導(dǎo)致在不知道蛋白質(zhì)種類的情況下測量結(jié)果存在部分偏差。整理ppt12比色法-BCA法BCA （Bicinchoninic acid) 試劑的主要成分為二喹啉甲酸鈉。BCA并不能

8、直接與蛋白質(zhì)發(fā)生化學(xué)或是物理上的反應(yīng)，而是對雙縮脲反應(yīng)的強化。BCA 極易與 Cu+結(jié)合形成紫色的復(fù)合物，該復(fù)合物在 562 nm 處有最大吸收峰，對入射光的吸收程度與 Cu+的濃度成正比。整理ppt13比色法-BCA法優(yōu)點：穩(wěn)定性好、顯色靈敏度高，顯色靈敏度與 Folin-酚法相當，且不受去垢劑、變性劑的影響缺點：反應(yīng)速度慢，易受糖類、尿素、B2 巰基乙醇等物質(zhì)的干擾，比Folin-酚法對糖類更加敏感整理ppt14比色法-考馬斯亮藍法理論基礎(chǔ)：1、考馬斯亮藍屬于三苯甲烷類染料，分為 G-250 和 R-250 兩種，是目前使用最為廣泛的一種蛋白質(zhì)染色劑。2、考馬斯亮藍 G-250 在游離狀態(tài)

9、下呈紅色，吸收峰位置為 488 nm 左右，容易與蛋白質(zhì)中的精氨酰和賴氨酰殘基結(jié)合，結(jié)合后顏色變?yōu)樗{色，最大吸收峰的位置轉(zhuǎn)移到 595nm。優(yōu)點：結(jié)合穩(wěn)定、反應(yīng)速度快、顯色靈敏度高，操作簡便，不受酚類、游離氨基酸、絡(luò)合劑等成分干擾缺點：不同蛋白質(zhì)中的精氨酰和賴氨酰殘基的含量不同，因此其與不同的蛋白質(zhì)結(jié)合有強有弱，導(dǎo)致測量不同的蛋白質(zhì)時存在較大偏差整理ppt15比色法-茚三酮法茚三酮，又名苯并戊三酮，溶于水后與水分子結(jié)合形成水合茚三酮，進而可與氨、一級胺、二級胺發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成紫藍色或黃色縮合物。茚三酮法可用于水解蛋白質(zhì)的檢測。整理ppt16比色法-茚三酮法 以氨基酸為例，首先在弱酸性加熱條件下

10、氨基酸與水合茚酸酮發(fā)生氧化反應(yīng)，氨基酸脫去氨基和羥基變成醛類化合物，水合茚三酮吸收氨基并脫去分水子變成胺合茚三酮。隨后胺合茚三酮與茚三酮反應(yīng)生成席夫堿，并最終形成紫藍色或黃、棕色化合物，產(chǎn)物顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度相關(guān)，最大吸收波長為 570 nm 左右。優(yōu)點：極高的顯色靈敏度和良好的檢出限缺點：水合茚三酮和不同的氨基酸顯色程度有所差異，蛋白質(zhì)水解程度的不同容易對測量結(jié)果造成較大誤差。此外，茚三酮顯色劑的穩(wěn)定性較差，不利于長期存儲整理ppt17高效液相色譜法原理：1、利用組分在兩相中的熱力學(xué)分配系數(shù)和動力學(xué)擴散系數(shù)差異來實現(xiàn)混合組分分離 2、由于不同的物質(zhì)的溶解度、蒸汽壓、吸附能力等物理化學(xué)性

11、質(zhì)存在差異，它們在流動相和固定相之間的分配系數(shù)有所不同，當兩相做相對運動時樣品組分在兩相之間進行多次連續(xù)分配，最終實現(xiàn)各組分的彼此分離優(yōu)點：其分離柱壽命長、分離效率高、分析時間短、進樣量小、檢測靈敏度高 缺點：對組成單位相似、分子極性相近、分子大小不同的動植物蛋白組分分離效果不佳 整理ppt18近紅外光譜法原理：當紅外光照射樣品分子時，極性共價鍵選擇性地吸收某些波長的光后產(chǎn)生振動能級躍遷，吸收光子的頻率與躍遷前后的能量差相關(guān)，吸收的強度取決于化學(xué)鍵振動的非諧性。分子的基頻振動產(chǎn)生的吸收譜帶位于波長2500-25000nm 的中紅外區(qū)域，發(fā)生780-1100nm 的短波近紅外區(qū)1100-2500

12、nm 的長波近紅外區(qū)的吸收譜帶對應(yīng)著基頻振動的倍頻和組合頻。含氫基團（X-H）的振動躍遷非諧性常數(shù)最高，其在有機物的近紅外吸收光譜中占主導(dǎo)地位。優(yōu)點：絕大多數(shù)的有機物都有吸收響應(yīng)，所以測量時幾乎無需進行樣品前處理缺點：吸收系數(shù)小，其檢測限通常不到 0.1%，不利于對蛋白質(zhì)的衡量分析整理ppt19質(zhì)譜法原理：質(zhì)譜分析法是將化合物形成母離子和碎片離子, 根據(jù)離子的質(zhì)荷比(m/z)進行分離, 從而對化合物的成分和結(jié)構(gòu)進行分析的方法質(zhì)譜分析的一般過程是: 樣品由合適的進樣裝置引入并進行氣化, 氣化后的樣品進入離子源后被電離, 電離后的離子經(jīng)過適當加速后進入質(zhì)量分析器, 根據(jù)不同的 m/z 進行分離,

13、到達檢測器, 產(chǎn)生不同的信號, 利用專業(yè)的生物軟件進行后續(xù)分析。優(yōu)點：準確性高，靈敏度高，與傳統(tǒng)的生物學(xué)技術(shù)手段相比, 基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)更適合于臨床疾病的研究缺點：技術(shù)發(fā)展不夠完善整理ppt20毛細管凝膠電泳法原理：電泳也稱作電遷移，是指溶液中帶電粒子在電場中所發(fā)生的遷移運動，運動的遷移率與組分分子的大小、極性、親和能力、等電點、相分配系數(shù)以及所帶電荷的多少等多個因素有關(guān)。毛細管電泳又稱為毛細管電分離，是以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅(qū)動力、根據(jù)帶電粒子遷移率的不同來實現(xiàn)組分分離的一種液相分離技術(shù)。 在毛細管內(nèi)充滿凝膠介質(zhì)的電泳稱為毛細管凝膠電泳。電泳過程中，不同分子在電場作用下

14、發(fā)生電泳遷移時受到網(wǎng)狀凝膠的阻礙作用不同，使其遷移速度不同，最終被分離。優(yōu)點：分離度極高，分離速度較快、樣品消耗量少（進樣量為 nL 級）缺點：分離檢測成本高，大分子容易積留、清洗困難，重現(xiàn)性差整理ppt21熒光法熒光探針具有靈敏度高，選擇性好，體積小，受生物體內(nèi)活性小分子及金屬離子干擾小等優(yōu)點基于小分子熒光探針檢測蛋白質(zhì) 小分子與蛋白質(zhì)相互作用后可引起小分子熒光光譜和蛋白質(zhì)自身熒光內(nèi)源熒光光譜以及同步熒光光譜的變化,如熒光強度和偏振度的改變、新熒光峰的出現(xiàn)等,這些均可以提供小分子與蛋白質(zhì)結(jié)合的信息。小分子與蛋白質(zhì)作用引起體系熒光性質(zhì)改變有兩種情況：小分子無熒光,在蛋白質(zhì)溶液中加入小分子后,蛋

15、白質(zhì)的內(nèi)源熒光淬滅小分子有熒光,蛋白質(zhì)與小分子作用后,內(nèi)源熒光被淬滅,而小分子的熒光被敏化增強整理ppt22基于蛋白質(zhì)疏水作用： 在水介質(zhì)中球狀蛋白質(zhì)的折疊總是傾向于把疏水性殘基包埋在分子內(nèi)部而形成疏水空腔。疏水作用及親水和疏水平衡在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能方面起著關(guān)鍵作用。 利用極性敏感有機小分子熒光探針與蛋白質(zhì)結(jié)合前后基于其疏水空腔提供了一個非極性環(huán)境從而導(dǎo)致探針熒光性質(zhì)的改變整理ppt23基于蛋白質(zhì)與有機染料結(jié)合作用 蛋白質(zhì)與熒光染料結(jié)合后,能使溶液熒光強度增強或淬滅,并且其變化量與蛋白質(zhì)濃度成正比。有機染料包括：血管黃素，曙紅Y，鉻天青S，溴酚藍，四羧基苯基卟啉，Evans blue，偶氮染料

16、，方酸菁染料，酞菁染料等 曙紅Y 鉻天青S整理ppt24溴酚藍四羧基苯基卟啉Evans blue整理ppt25偶氮染料 方酸菁染料酞菁染料整理ppt26基于AIE機理檢測蛋白質(zhì)此外，小分子熒光探針還可基于熒光能量共振轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer, FRET),光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移 (photo-induced electron transfer PET）, 分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移( Intramolecular charge transfer , ICT)等效應(yīng)對蛋白質(zhì)進行選擇性識別整理ppt27基于自組裝機理檢測蛋白質(zhì) 超分子化學(xué)：分子聚集體結(jié)構(gòu)和功能

17、為研究對象, 旨在研究分子基于弱相互作用的組裝、自組裝和自組織行為,并研究這些行為可能帶來的結(jié)構(gòu)和功能的改變,以期建立結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系。超分子的組裝的實現(xiàn)依賴于分子間鍵. 它包括氫鍵、范德華力、親脂-疏水作用、金屬離子的配位鍵、-堆積作用等Palapuravan Anees, et al. J. Am. Chem. Soc. 2014, 136,1323313239整理ppt28比色/比率型熒光探針檢測蛋白質(zhì) 利用催化消除氨基甲酸酯保護基團合成了反應(yīng)型探針，BSA的存在使得氨基萘二甲酰亞胺的綠色熒光增強，根據(jù)溶液顏色變化和熒光強度比值識別并定量檢測。X. Zhang. et al. Ana

18、lyst, 2011,136(19):4008-4012.整理ppt29基于熒光有機納米材料檢測蛋白質(zhì) 納米材料，是指在三維空間中至少有一維處于納米尺度范圍（100 nm）或由該尺度范圍的物質(zhì)作為基本單元構(gòu)成的材料。納米材料的特殊結(jié)構(gòu)，使其具有不同于常規(guī)材料和單個分子的一些特性，主要包括比表面積大、高化學(xué)活性、特殊的光、電、磁性質(zhì)等。而熒光納米材料，由于其特殊的結(jié)構(gòu)與光學(xué)特性，為化學(xué)、物理、醫(yī)學(xué)和生物領(lǐng)域的發(fā)展帶來了新的機遇。整理ppt30半導(dǎo)體量子點 量子點是主要由-族及-族元素構(gòu)成的半導(dǎo)體納米顆粒。量子點在研究蛋白質(zhì)方面具有許多優(yōu)勢。首先，可以用同一激發(fā)波長的光源同時激發(fā)多種不同熒光的量子

19、點，并且由于其發(fā)射譜帶窄而對稱，多種顏色的發(fā)射峰不易出現(xiàn)重疊與紅移拖尾，熒光光譜易于區(qū)分和識別。另外，量子點的斯托克斯位移較大，可以有效避免激發(fā)峰與發(fā)射峰的重疊，減少干擾。此外，量子點的光學(xué)特征可以通過控制反應(yīng)條件有效控制 量子點熒光可調(diào)的光學(xué)特征為蛋白質(zhì)多色標記及同步檢測奠定了基礎(chǔ)。整理ppt31嵌入式核殼熒光納米顆粒嵌入式核殼熒光納米顆粒是指一些負載有機熒光染料分子的無機納米顆粒或多聚生物大分子包被型納米顆粒。這種材料在蛋白質(zhì)標記成像中有固有優(yōu)點。 首先，納米顆粒對內(nèi)部所包裹的熒光染料有保護作用，使其熒光穩(wěn)定性增強，可以克服外界環(huán)境對熒光材料的影響。 其次，一個納米顆粒內(nèi)所包裹的熒光分子往

20、往多達幾千甚至幾萬個，因此，更多的熒光分子可以連接在生物分子上，當產(chǎn)生信號響應(yīng)時，很多熒光分子同時產(chǎn)生熒光信號，起到了信號放大的作用，從而提高檢測靈敏度整理ppt32碳點碳點是一種近似球型且直徑小于10 nm的零維半導(dǎo)體納米晶體，是由極少分子或是原子組成的納米團簇。熒光性能是碳點最突出的性能，碳點具有熒光穩(wěn)定性高、熒光波長可調(diào)、抗光漂白能力強、激發(fā)光寬且連續(xù)、能夠?qū)崿F(xiàn)一元激發(fā)、多元發(fā)射等特點。制備碳點的碳源來源豐富且價廉、毒性低。利用碳點表面的NH2和OH，在碳點表面接上對生物分子有特異性識別作用的核酸適體或分子印跡聚合物，可提高分析的靈敏度和選擇性。在蛋白質(zhì)研究中，碳點通過與蛋白質(zhì)的作用，改

21、變了表面電子空穴對之間的復(fù)合效率，從而發(fā)生熒光的增強或猝滅，實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的標記和分析。整理ppt33貴金屬元素納米簇貴金屬元素納米簇的尺寸通常小于2 nm，具有強的可見-近紅外熒光。同其他熒光納米材料相比，貴金屬元素納米簇更加穩(wěn)定，分散性更好。近幾年來，貴金屬納米簇分子橋的研究是一大熱點。由于金屬納米簇的低毒性，近紅外光譜特征，超小尺寸及優(yōu)良的熒光性質(zhì)，它們已廣泛用于蛋白質(zhì)檢測、標記成像及蛋白質(zhì)間相互作用的研究領(lǐng)域。整理ppt34磁性熒光納米顆粒磁性熒光納米顆粒是一種結(jié)合了磁性和發(fā)光性能的納米材料。磁性熒光納米材料集合了磁性納米顆粒的快速磁響應(yīng)性以及熒光材料的光致發(fā)光能力，在分離的同時還能進行

22、光學(xué)檢測。整理ppt35整理ppt36蛋白質(zhì)與疾病的關(guān)系妊娠期高血壓疾病 妊娠期特有的疾病，發(fā)生率為 9. 4% 10. 4% ，可導(dǎo)致腦出血、腦水腫、心力衰竭、肺水腫、新生兒死亡等不良妊娠結(jié)局，尤其是早發(fā)型重度子癇前期，是導(dǎo)致產(chǎn)婦及新生兒死亡的主要原因之一，嚴重危害母嬰健康。該疾病以“妊娠20周后高血壓、蛋白尿、水腫”為主要表現(xiàn)。（正常人每日自尿中排出約40-80mg蛋白，上限不超過150mg，其中主要為白蛋白，其次為糖蛋白和糖肽。）通過檢測尿蛋白含量，可以有效預(yù)防妊娠期高血壓疾病的發(fā)生。整理ppt37慢性腎臟病及糖尿病 慢性腎臟病(CKD)的進展是一個不可逆轉(zhuǎn)的過程,其發(fā)展是以腎功能進行性下降,細胞外基質(zhì)(ECM)在細胞外大量聚集而致的廣泛腎纖維化為特征,最終出現(xiàn)終末期腎功能衰竭。 非選擇性蛋白尿是大多數(shù)腎臟病共有的表現(xiàn)之一,其中存在的大量毒性/炎性物質(zhì)。大量蛋白尿,特別是大量非選擇性蛋白尿出現(xiàn)時,能夠通過一系列不同的機制表現(xiàn)出腎臟毒性加速腎臟病的進展。 蛋白尿不僅僅是腎臟病進行性發(fā)展過程中的表現(xiàn),又是其重要危險因素之一。整理ppt38冠心病 指由于脂質(zhì)代謝不正常，血液中的脂質(zhì)沉著在原本光滑的動脈內(nèi)膜上，在動脈內(nèi)膜一些類似粥樣的脂類物質(zhì)堆積而成白色斑塊，稱為動脈粥樣硬化病變。這些斑塊漸漸增多造成動脈腔狹窄，使血流受阻，導(dǎo)致心臟缺血，產(chǎn)生心絞痛。高密度脂蛋白(HD