基因芯片技術基礎知識

1、HGP生物科學正迅速地演變?yōu)橐婚T信息科學。最明顯的一個例子就是目前正在進行的（human genome project），最終要搞清人類全部基因組的30億左右堿基對的序列。除了人的遺傳信息以外，還有其它生物尤其是模式生物（model organism ）已經(jīng)或正在被大規(guī)模測序，如大腸桿菌、啤酒酵母、秀麗隱桿線蟲以及中國和日本科學家攻關的水稻基因組計 劃。但單純知曉生物基因組序列一級結(jié)構還遠遠不夠，還必須了解其中基因是怎樣組織起來的，每個基因的功能是什么，又是怎樣隨發(fā)育調(diào)控和微環(huán)境因素的影響而在特定的時空域中展開其表達譜的，即我們正由結(jié)構基因組時代邁入功能基因組時代。隨著這個功能基因組學問題的提

2、出（后基因組時代，蛋白組學），涌現(xiàn)出許多功能強大的研究方法和研究工具，最突出的就是細胞蛋白質(zhì)二維凝膠電泳（2-D-gel）（及相應的質(zhì)譜法測蛋白分子量）和生物芯片（Biochip ）技術2。一什么是基因芯片生物芯片，簡單地說就是在一塊指甲大?。?cm3）的有多聚賴氨酸包被的硅片上或其它固相支持物（如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等，但需經(jīng)特殊處理。作原位合成的支持物在聚合反應前要先使其表面衍生出羥基或氨基（視所要固定的分子為核酸或寡肽而定）并和保護基建立共價連接；作點樣用的支持物為使其表面帶上正電荷以吸附 帶負電荷的探針分子， 通常需包被以氨基硅烷或 多聚賴氨酸等）將生物分子探針

3、（寡核苷酸 片段或基因片段）以大規(guī)模陣列的形式排布，形成可和目的分子（如基因）相互作用，交行 反應的固相表面，在激光的順序激發(fā)下標記熒光根據(jù)實際反應情況分別呈現(xiàn)不同的熒光發(fā)射 譜征，CCD相機或激光共聚焦顯微鏡 根據(jù)其波長及波幅特征收集信號，作出比較和檢測， 從而迅速得出所要的信息。生物芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、組織芯片。而基因芯片中，最成功的是DNA芯片，即將無數(shù)預先設計好的寡 核苷酸或cDNA在芯片上做成點陣，和樣 品中同源核酸分子雜交 的芯片?；蛐酒幕驹硗酒夹g中雜交測序（sequencing by hybridization, SBH ）。即任何線狀的單鏈 DNA或RNA

4、序列均可被分解為一個序列固定、錯落而重疊的寡 核苷酸, 又稱亞序列(subsequenee )。例如可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATG 分解成5個8 nt亞 序列：CTCATATG(2) GCTCATAT(3) AGCTCATA(4) TAGCTCAT(5) TTAGCTCA這5個亞序列依次錯開一個堿基而重疊7個堿基。亞序列中 A、T、C、G 4個堿基自由組合而形成的所有可能的序列共有65536種。假如只考慮完全互補的雜交，那么48個8 nt亞序列探針中，僅有上述5個能同靶DNA雜交。可以用人工合成的已知序列的所有可能的n體寡核苷酸探針和一個未知的熒光標記DNA/RNA序列雜交，通過對雜

5、交熒光信號檢測，檢出所有能和靶DNA雜交的寡核苷酸，從而推出靶DNA中的所有8 nt亞序列，最后由計算 機對大量熒光信號的譜型(pattern )數(shù)據(jù)進行分析，重構靶 DNA的互補寡核苷酸序列。二芯片類型一般基因芯片按其材質(zhì)和功能，基本可分為以下幾類4(一) 元件型微陣列芯片1生物電子芯片2. 凝膠元件微陣列芯片3. 藥物控釋芯片(二) 通道型微陣列芯片1.毛細管電泳芯片2 P CR擴增芯片3. 集成DNA分析芯片4. 毛細管電層析芯片（三）生物傳感芯片1光學纖維陣列芯片2白光干涉譜傳感芯片小鼠基因表達譜芯片（MGEC）附:目前國內(nèi)基因芯片常見品種.（上海博星公司）芯片品種芯片點數(shù)MGEC-2

6、0S2000MGEC-40S4000MGEC-80S8000癌癥相關基因表達譜芯片 （CRGEC）分類芯片型號芯片點數(shù)肝癌相關基因表達譜芯片LiverC-16S1626LiverC-16D3252LiverC-9.5NS954LiverC-9.5ND1908肺癌相關基因表達譜芯片Lun gC-7.3S737Lun gC-7.3D1474人類基因表達譜芯片（HGEC）芯片品種芯片點數(shù)HGEC-10S1024HGEC-10D2048HGEC-20S2048HGEC-20D4096HGEC-40S4096HGEC-40D8192HGEC-80S8192HGEC-80D16184三基因芯片的制備芯片種

7、類較多，制備方法也不盡相同，常見的芯片可分為兩大類：一類是原位合成；一種是直接點樣。原位合成適用于寡核苷酸；直接點樣多用于大片段DNA，有時也用于寡核苷酸，甚至mRNA。原位合成有兩種途徑。一是光蝕刻法；一是噴印法。光蝕刻法可以合 成30nt左右，噴印法可以合成 40-50nt，光蝕刻法每步縮合率較低，一般為95%左右，合成30nt產(chǎn)率僅20% ;噴印法可達99%以上，合成30nt產(chǎn)率可達74%，從這個意義上說噴印法 特異性應比光刻法高。此外，噴印法不需特殊的合成試劑。和原位合成法比較點樣法較簡單，只需將預先制備好的寡 核苷酸或cDNA等樣品通過自動點樣裝置點于經(jīng)特殊處理的玻璃片 或其它材料上

8、即可。1原位光蝕刻合成5-7寡聚核苷酸原位光蝕刻合成技術是由Asymetrix公司開發(fā)的，采用的技術原理是在合成堿基單體的5'羥基末端連上一個光敏保護基。合成的第一步是利用光照射使羥基端脫保護，然后一個 5'端保護的核苷酸單體連接上去，這個過程反復進行直至合成 完畢。使用多種掩蓋物能以更少的合成步驟生產(chǎn)出高密度的陣列，在合成循環(huán)中探針數(shù)目呈指數(shù)增長。某一含n個核苷酸的寡聚核苷酸，通過4 xn個化學步驟能合成出4n個可能結(jié)構。例如：一個完整的十 核苷酸通過32個化學步驟，8個小時可能合成65,536個探針。目前美國Affymetrix公司已有同時檢測6,500個已知人類基因的 D

9、NA芯片，并且正在制 備含500,000-1,000,000個寡核苷酸探針的人類基因檢測芯片。該公司每月投入基因芯片研 究的經(jīng)費約100萬美元，目前產(chǎn)品尚未公開投放市場發(fā)揮經(jīng)濟效益，但已有許多公司及研究 機構和其簽約購買其產(chǎn)品。該產(chǎn)品不僅可用于基因表達分析和基因診斷等，而且在大規(guī)模藥物開發(fā)方面也具有誘人的前景。Affymetrix的大部分產(chǎn)品將在98年底全面投放市場。屆時，在其產(chǎn)品被廣泛采用的同時，其所有的研究投入將變成巨大的利潤。其它公司產(chǎn)品也正在從實驗室技術研究走向開發(fā)使用。目前，用于分子診斷的DNA芯片不僅已可用于檢測愛滋病病毒基因還可用于囊性纖維化（CF ）、乳腺癌、卵巢癌等疾病相關基

10、因的基因診斷。鑒于光刻設備技術復雜，只能有專業(yè)化公司生產(chǎn)，加之成本高及合成效率不高的問題，因此有待進行以下研究：對光刻技術進行改進，提高合成效率；開發(fā)新的原位合成技術，如噴印合成技術，該技術既能進行原位合成又能進行非原位合成。另一方法是光導原位合成法。具體方法是在經(jīng)過處理的載玻片表面鋪上一層連接分子（linker），其羥基上加有光敏保護基團，可用光照除去，用特制的光刻掩膜（photolithographic mask ）保護不需要合成的部位，而暴露合成部位，在光作用下去除羥基上的保護基團， 游離羥基，利用化學反應加上第一個核苷酸，所加核苷酸種類及在芯片上的部位預先設定，所引入的核苷酸帶有光敏保

11、護基團，以便下一步合成。然后按上述方法在其它位點加上另外 三種核苷酸完成第一位核苷酸的合成，因而N個核苷酸長的芯片需要4N個步驟。每一個獨 特序列的探針稱為一個feature，這樣的芯片便具有4N個feature ”包含了全部長度為 N的核苷酸序列。這種原位直接合成的方法無須制備處理克隆和PCR產(chǎn)物，但是每輪反應所需設計的光柵則是主要的經(jīng)費消耗。運用這種方法制作的芯片密度可高達106探針/平方厘米，即探針間隔為 5 10 g，但只能制作II型DNA芯片。見圖一。PhOlL¥VFiMhJ RealmsDcrivalixcd、kirih聲 nl ohii|iii thipPhalLili

12、 iho 14phy F<Uafcn|$I light眈認口沁Ctofilbng RcjLgcnijhim冊PmteUNjj強C<Hn(M*kr *hifi Ilsc2CywniiK 廠 M CcHiplm Rcjjx-mPidiJIy cnmptoctlsymlicsi> 皿K iHtgiinuc 怙 iMidczNuckLHidk： Key r; A 7 l t A； T 15Repealed Synthciic Cycles2原位噴印合成芯片原位噴印合成原理和噴墨打印類似，不過芯片噴印頭和墨盒有多個，墨盒中裝的是四種堿基等液體而不是碳粉。噴印頭可在整個芯片上移動并根據(jù)芯

13、片上不同位點探針的序列需要將特定的堿基噴印在芯片上特定位置。該技術采用的化學原理和傳統(tǒng)的DNA固相合成一致，因此不特殊制備的化學試劑。3點樣法 點樣法是將合成好的探針、cNDA或基因組DNA通過特定的高速點樣機器人直接點在芯片上。點樣分子可以是核酸也可以是寡核酸。一些研究者采用人工點樣的方法將寡即固定于載玻片上，制備好的DNA芯片可置于緩沖液中保存。由于方法費時費力，不適于大規(guī)模DNA芯片制作，因而實現(xiàn)自動化點樣就顯得尤為重要。有的研究者用多聚賴氨酸 包被固相支待物玻片，經(jīng)過分區(qū)后用計算機控制的微陣列點樣機按照預先設計順序點上核酸分 子，點樣量很小，約為5nl。大規(guī)模CDNA芯片多采用這種方法

14、， 和其寡核苷酸微芯片相比。 DNA芯片的潛在優(yōu)越性是具有更強的親和勢和特異性雜交，但是需要大量制備，純化，量 化，分類PCR產(chǎn)物。有的研究者將玻片上覆蓋 20 pm厚薄層聚丙烯酰胺凝膠作為支持物， 采用機械刻寫或光刻的方法在其表面劃上網(wǎng)格，并用激光照射蒸發(fā)掉單元間隙的多余凝膠， 以實現(xiàn) DNA芯片分區(qū)，單元大小為 40 >40 m 或100 X100 m 間隔分別為50 m 和100 pm。 然后將化學方法合成的寡 核苷酸探針自動化點樣于各個單元內(nèi)而制成DNA芯片，點樣速度可達2000單元/秒。其裝置采用的機器人有一套計算機控制三維移動裝置、多個打印/噴印針的打印/噴印頭；一個減震底座

15、，上面可放內(nèi)盛探針的多孔板和多個芯片。根據(jù)需要還可以有溫度和濕度控制裝置、針洗滌裝置。打印 /噴印針將探針從多孔板取出直接打印或噴印于芯片上。直接 打印時針頭和芯片接觸，而在噴印時針頭和芯片保持一定距離。打印法的優(yōu)點是探針密度高， 通常1平方厘米可打印2,500個探針。缺點是定量準確性及重現(xiàn)性不好，打印針易堵塞且使 用壽命有限。噴印法的優(yōu)點是定量準確，重現(xiàn)性好，使用壽命長。缺點是噴印的斑點大，因 此探針密度低，通常1平方厘米只有400點。國外有多家實驗室和公司研究開發(fā)打印/噴印設備，目前有一些已經(jīng)商品化。 軍事醫(yī)學科學院和益生堂生物企業(yè)公司目前正在聯(lián)手利用打印 /噴印技術進行生物芯片的研究和開

16、發(fā)，預計2年內(nèi)將有用于實驗室研究或臨床診斷的基因芯 片產(chǎn)品問世。見圖4電子芯片8-10電子芯片是由美國N anogen公司開發(fā)的，目前國內(nèi)清華大學和復旦大學 也在開發(fā)這一技術。這種芯片為帶有陽電荷的硅芯片、芯片經(jīng)熱氧化，制成1mm ximm的陣列、每個陣列含多個微電極，在每個電極上通過氧化硅沉積和蝕刻制備出樣品池。將連接鏈親和素的瓊脂糖覆蓋在電極上，在電場作用下生物素標記的探針即可結(jié)合在特定電極上。電子芯片最大特點是雜交速度快，可大大縮短分析時間。制備復雜、成本高是其不足。5三維芯片11-12三維芯片是由美國的Packard、摩托羅拉、Argonne國家實驗室三家機構和俄羅斯Engelhard

17、t分子生物學研究所合作開發(fā)的一種芯片技術。三維生物芯片實質(zhì)上 是一塊顯微鏡載玻片，其上有10,000個微小聚乙烯酰胺凝膠條，每個凝膠條可用于靶 DNA ,RNA和蛋白質(zhì)的分析。先把乙知化合物加在凝膠條上，再用3cm長的微型玻璃毛細管將待測樣品加到凝膠條上。每個毛細管能把小到0.2nl的體積打到凝膠上。以上幾家機構合作研究的生物芯片系統(tǒng)具有其它生物芯片系統(tǒng)不具有的幾個優(yōu)點。一是凝膠的三維化能加進更多的已知物質(zhì)，增加了敏感性。二是可以在芯片上同時進行擴增和檢則。一般情況下，必須在微量多孔板上先進行 PCR擴增，再把樣品加到芯片上，因此需要進行許多額外操作。本芯 片所用凝膠體積很小。使PCR擴增體系

18、的體積減小1,000倍（總體積約納升級），從而節(jié)約了每個反應所用的 PCR酶（約減少100倍）。三是以三維構象形式存在的蛋白和基因材料可 以其天然狀態(tài)在凝膠條上分析，可以進行免疫測定，受體-配體研究和蛋白組分析。6流過式芯片（flow-thru chip ） 13 Cene Logic正在開發(fā)一種在芯片片基上制成格柵狀 微通道，Cene Logic設計及合成特定的寡核苷酸探針，結(jié)合于微通道內(nèi)芯片的特定區(qū)域。從待測樣品中分離 DNA或RNA并對其進行熒光標記，然后，該樣品流過芯片，固定的寡核苷酸探針捕獲和之相互補的核酸，采用Cene Logic's信號檢測系統(tǒng)分析結(jié)果。 流通式芯片用于高

19、通量分析已知基因的變化，其特定在于敏感性高：由于寡核苷酸吸附表面的增大，流過式芯片可監(jiān)測稀有基因表達的變化；速度快：微通道加速了雜交反應， 減少了每次檢測所需時間；價格降低：由于采用了特殊的共價化學技術將寡 核苷酸吸附于微通道內(nèi)， 使 每一種流過芯片可反復使用多次，從而使其成本降低。四基因芯片樣品制備一般說來使用 DNA芯片進行實驗包括5個過程：生物學問題的提出和芯片設計；樣品制備；生物雜交反應；結(jié)果探測；數(shù)據(jù)處理和建模。1 樣品制備。一般所需 mRNA的量是以一張表達譜芯片需要 3用mRNA計算的不同組織抽提3 10mRNA所需組織量器官/組織*提取3用mRNA所需組織量（克）提取10 （j

20、gmRNA 所需織量（克）總RNA得率單位:毫克RNA/克組織mRNA所占百分比%成人正常組織肝0.20830.69441.80 - 1.80 mg/g0.80成人正常組織腦缺數(shù)據(jù)缺數(shù)據(jù)1.30 - 1.30 mg/g缺數(shù)據(jù)成人正常組織肺0.30001.00001.00 - 1.00 mg/g1.00成人正常組織心0.50001.66670.60 - 0.60 mg/g1.00成人正胃0.18520.61732.70 - 2.70 mg/g0.60常組織成人正常組織喉0.31251.04171.20 - 1.20 mg/g0.80病理組織結(jié)腸癌0.25210.84031.70 - 1.70 m

21、g/g0.70病理組織1=1=1 J i=r'冃癌0.43171.43880.50 - 0.50 mg/g1.39病理組織空腸腺癌0.35711.19051.40 - 1.40 mg/g0.60病理組織直腸癌0.16040.53481.70 - 1.70 mg/g1.10病理組織肝癌0.11160.37203.84 - 3.84 mg/g0.70病理組織肺癌0.12820.42742.00 - 2.00 mg/g1.17考慮到個體差異以及樣品在研磨、勻漿等過程中的損失，客戶提供的樣品量應在上述基礎上增加1-2倍。2樣本采集過程關鍵點.組織標本采集操作建議規(guī)程，（取標本所需關鍵器材和處理

22、要求）鋁箔經(jīng)DEPC水浸泡過夜，78 °C烘干，高壓滅菌后烘干1.5 ml微離心管15 ml聚丙烯離心管市場有售RNAase-Free 的相應規(guī)格離心管標簽紙記號筆樣品登記表由客戶指定專人填寫液氮罐應常備液氮罐，并保證液氮的來源取材部位的病理切片由客戶提供1-2張注:以下步驟1 - 5應在冰上進行且不超過15分鐘，超過時間會導致樣品的RNA降解。對腫瘤組織的取材，要求盡可能準確地判定腫瘤和正常組織，例如對于手術切除的整個或部分前列腺，可能要根據(jù)冰凍切片報告的結(jié)果來判定要進行研究的取材部位。1離體新鮮組織，切成多個1cm3小塊，易V除結(jié)締組織和脂肪組織。胃、腸組織應剪除外膜；肝、腎、脾

23、應剪除門部血管神經(jīng)，腫瘤組織應將周圍的正常組織切除干凈（正常組織也應將 周圍的腫瘤組織切除干凈）。2在RNase-Free 0.9 %生理鹽水中漂洗樣品，以去除血漬和污物。3用鋁箔包裹組織，或用 5ml凍存管裝載組織（但最好統(tǒng)一采用鋁箔）。用記號筆在鋁箔或 凍 存管外表寫明樣品編號，并貼上標簽，迅速投入液氮冷卻。4填寫樣品登記表，寫明樣品名稱、種類、編號、取樣日期、樣品處理情況等將液氮冷卻的組織放入樣品袋（每個樣品袋只保存同樣的組織），袋口留一根編號繩，繩上粘一張標簽紙（標簽上注明：樣品名稱、編號、日期），迅速轉(zhuǎn)入便攜式液氮罐5保留1-2張取材部位的病理切片。五生物芯片雜交待分析基因在和芯片結(jié)

24、合探針雜交之前必需進行分離、擴增及標記。根據(jù)樣品來源、基因含量及檢測方法和分析目的不同，采用的基因分離、擴增及標記方法各異。當然，常規(guī)的基因分離、擴增及標記技術完全可以采用，但操作繁瑣且費時。高度集成的微型樣品處理系統(tǒng)如細胞分離芯片及基因擴增芯片等是實現(xiàn)上述目的的有效手段和發(fā)展方向。為了獲得基因的雜交信號必須對目的基因進行標記，目前采用的最普遍的熒光標記方法和傳統(tǒng)方法如體外轉(zhuǎn)錄、PCR、逆轉(zhuǎn)錄等原理上并無多大差異，只是采用的熒光素種類更多，這可以滿足不 同來源樣品的平行分析。用計算機控制的高分辨熒光掃描儀可獲得結(jié)合于芯片上目的基因的 熒光信號，通過計算機處理即可給出目的基因的結(jié)構或表達信息。雜

25、交條件的選擇和研究目的有關， 多態(tài)性分析或者基因測序時， 每個核苷酸或突變位點 都必須檢測出來。通常設計出一套四種寡聚核苷酸，在靶序列上跨越每個位點，只在中央位 點堿基有所不同，根據(jù)每套探針在某一特點位點的雜交嚴謹程度， 即可測定出該堿基的種類。如果芯片僅用于檢測基因表達，只需設計出針對基因中的特定區(qū)域的幾套寡聚核苷酸即可。這有利于增加檢測的特異性和低拷貝基因檢測的靈敏度。突變檢測，要鑒別出單堿基錯配,需要更高的雜交嚴表達檢測需要長的雜交時間，更高的嚴謹性，更高的樣品濃度和低溫度,謹性和更短的時間。此外，雜交反應還必須考慮雜交反應體系中鹽濃度、探針GC含量和所帶電荷、 探針和芯片之間連接臂的長

26、度及種類、檢測基因的二級結(jié)構的影響。有資料顯示探針和芯片之間適 當長度的連接臂可使雜交效率提高150倍。連接臂上任何正或負電荷都將減少雜交效率。由于探針和檢測基因均帶負電荷，因此影響他們之間的雜交結(jié)合，為此有人提出用不帶電荷的肽核酸（PNA ）做探針9。雖然PNA的制備比較復雜，但和 DNA探針比較有許多特點， 如不需要鹽離子，因此可防止檢測基因二級結(jié)構的形成及自身復性。由于PNA-DNA結(jié)合更加穩(wěn)定和特異，因此更有利于單堿基錯配基因的檢測。六基因芯片檢測原理雜交信號的檢測是 DNA芯片技術中的重要組成部分。以往的研究中已形成許多種探測分子雜交的方法，如熒光顯微鏡、隱逝波傳感器、光散射表面共振

27、、電化傳感器、化學發(fā)光、 熒光各向異性等等，但并非每種方法都適用于DNA芯片。由于DNA芯片本身的結(jié)構及性質(zhì)，需要確定雜交信號在芯片上的位置，尤其是大規(guī)模DNA芯片由于其面積小，密度大，點樣量很少，所以雜交信號較弱，需要使用光電倍增管 或冷卻的電荷偶連照相機(charged-coupled device camera，CCD)攝像機等弱光信號探測裝置。此外，大多數(shù)DNA芯片雜交信號譜型除了分布位點以外還需要確定每一點上的信號強度，以確定是完全雜交還是不完全雜交，因而探測方法的靈敏度及線性響應也是非常重要的。雜交信號探測系統(tǒng)主要包括雜交信號產(chǎn)生、信號收集及傳輸和信號處理及成像三個部分組成。由于所

28、使用的標記物不同， 因而相應的探測方法也各具特色。 大多數(shù)研究者使用熒光標 記物，也有一些研究者使用生物素標記，聯(lián)合抗生物素結(jié)合物檢測DNA化學發(fā)光。通過檢測標記信號來確定 DNA芯片雜交譜型。1 熒光標記雜交信號的檢測方法使用熒光標記物的研究者最多，因而相應的探測方法也就最多、最成熟。由于熒光顯微鏡可以選擇性地激發(fā)和探測樣品中的混合熒光標記物，并具有很好的空間分辨率和熱分辨 率，特別是當熒光顯微鏡 中使用了共焦激光掃描時，分辨能力在實際使用中可接近由數(shù)值孔徑和光波長決定的空間分辨率，而在傳統(tǒng)的顯微鏡是很難做到的，這便為DNA芯片進一步微型化提供了重要的檢測方法的基礎。大多數(shù)方法都是在人射照明

29、式熒光顯微鏡(epifluoesee nee microscope )基礎上發(fā)展起來的，包括激光掃描熒光顯微鏡、激光共焦掃描顯微鏡、 使用了 CCD相機的改進的熒光顯微鏡以及將DNA芯片直接制作在光纖維束切面上并結(jié)合 熒光顯微鏡的光纖傳感器微陣列。這些方法基本上都是將待雜交對象以熒光物質(zhì)標記，如熒光素或麗絲膠(lissamine )等，雜交后經(jīng)過 SSC和SDS的混合溶液或 SSPE等緩沖液 清洗。(1 )激光掃描 熒光顯微鏡探測裝置比較典型。方法是將雜交后的芯片經(jīng)處理后固定在計算機控制的二維傳動平臺 上，并將一物鏡置于其上方，由氬離子激光器產(chǎn)生激發(fā)光經(jīng)濾波后通過物鏡聚焦到芯片表面， 激發(fā)熒光

30、標記物產(chǎn)生熒光， 光斑半徑約為5- 10 g。同時通過同一物鏡收集熒光信號經(jīng)另一 濾波片濾波后，由冷卻的光電倍增管探測，經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換板轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號。通過計算機控制傳動平臺X- Y方向上步進平移，DNA芯片被逐點照射，所采集熒光信號構成雜交信號譜 型，送計算機分析處理，最后形成20 口象素的圖像。這種方法分辨率高、圖像質(zhì)量較好，適用于各種主要類型的 DNA芯片及大規(guī)模 DNA芯片雜交信號檢測， 廣泛使用于基因表達、 基因診斷等方面研究。(2) 激光掃描共焦顯微鏡激光掃描共焦顯微鏡和激光掃描 熒光顯微鏡 結(jié)構非常相似，但是由于采用了共焦技術因 而更具優(yōu)越性。這種方法可以在熒光標記分子和DNA芯片雜

31、交的同時進行雜交信號的探測，而無須清洗掉未雜交分子，從而簡化了操作步驟大大提高了工作效率。Asymetrix公司的S. P . A . Forder等人設計的DNA芯片即利用此方法。其方法是將靶DNA分子溶液放在樣品地中，芯片上合成寡 核苷酸陣列的一面向下，和 樣品池溶液直接接觸，并和 DNA樣品 雜交。當用激發(fā)光照射使熒光標記物產(chǎn)生熒光時，既有芯片上雜交的DNA樣品所發(fā)出的熒光，也有樣品地中 DNA所發(fā)出的熒光，如何將兩者分離開來是一個非常重要的問題。而共 焦顯微鏡具有非常好的縱向分辨率，可以在接受芯片表面熒光信號的同時，避開樣品池中熒光信號的影響。一般采用氬離子激光器(488nm )作為激

32、發(fā)光源，經(jīng)物鏡聚焦，從芯片背面入射，聚集于芯片和靶分子溶液接觸面。雜交分子所發(fā)的熒光再經(jīng)同一物鏡收集，并經(jīng)濾波片濾波，被冷卻的光電倍增管 在光子計數(shù)的模式下接收。經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換反轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號送微機處理，成像分析。在光電信增管前放置一共焦小孔，用于阻擋大部分激發(fā)光焦平面以外的來自樣品池的未雜交分子熒光信號，避免其對探測結(jié)果的影響。激光器前也放置一個小孔 光闌以盡量縮小聚焦點處光斑半徑，使之能夠只照射在單個探針上。通過計算機控制激光束或樣品池的移動，便可實現(xiàn)對芯片的二維掃描，移動步長和芯片上寡 核苷酸的間距匹配，在幾分鐘至幾十分鐘內(nèi)即可獲得熒光標記雜交信號圖譜。其特點是靈敏度和分辨率較高，掃描 時間

33、長，比較適合研究用?，F(xiàn)在Asymetrix公司已推出商業(yè)化樣機， 整套系統(tǒng)約12萬美元。（3）采用了 CCD相機的熒光顯微鏡這種探測裝置和以上的掃描方法都是基于熒光顯微鏡，但是以CCD相機作為信號接收器而不是 光電倍增管，因而無須掃描傳動平臺。由于不是逐點激發(fā)探測，因而激發(fā)光照射光場為整個芯片區(qū)域，由 CCD相機獲得整個DNA芯片的雜交譜型。這種方法一般不采用激 光器作為激發(fā)光源，由于激光束光強的高斯分布，會使得光場光強度分布不均，而熒光信號的強度和激發(fā)光的強度密切相關，因而不利于信號采集的線性響應。為保證激發(fā)光勻場照射， 有的學者使用高壓汞燈經(jīng)濾波片濾波，通過傳統(tǒng)的光學物鏡將激發(fā)光投射到芯片

34、上，照明面積可通過更換物鏡來調(diào)整；也有的研究者使用大功率弧形探照燈作為光源，使用光纖維束和透鏡結(jié)合傳輸激發(fā)光，并和芯片表面呈50o角入射。由于采用了 CCD相機，因而大大提高了獲取熒光圖像的速度，曝光時間可縮短至零點幾秒至十幾秒。其特點是掃描時間短，靈敏度和分辨率較低，比較適合臨床診斷用14.（4）光纖傳感器有的研究者將 DNA芯片直接做在光纖維束的切面上（遠端），光纖維束的另一端（近端）經(jīng)特制的耦合裝置耦合到 熒光顯微鏡 中。光纖維束由7根單模光纖組成。每根光纖的直 徑為200呵,兩端均經(jīng)化學方法拋光清潔?；瘜W方法合成的寡 核苷酸探針共價結(jié)合于每根光纖的遠端組成寡核苷酸陣列。將光纖遠端浸入到

35、熒光標記的靶分子溶液中和靶分子雜交，通過光纖維束傳導來自 熒光顯微鏡的激光（490urn ）,激發(fā)熒光標記物產(chǎn)生熒光，仍用光纖維 束傳導熒光信號返回到 熒光顯微鏡，由CCD相機接收。每根光纖單獨作用互不干擾，而溶 液中的熒光信號基本不會傳播到光纖中，雜交到光纖遠端的靶分子可在 90 %的甲酸胺（formamide ）和TE緩沖液中浸泡10秒鐘去除，進而反復使用。這種方法快速、便捷，可實時 檢測DNA微陣列雜交情況而且具有較高的靈敏度，但由于光纖維束所含光纖數(shù)目有限，因 而不便于制備大規(guī)模 DNA芯片，有一定的使用局限性。2.生物素標記方法中的雜交信號探測以生物素(biotin )標記樣品的方法

36、由來已久，通常都要聯(lián)合使用其它大分子和抗生物素的結(jié)合物(如結(jié)合化學發(fā)光底物酶、熒光素等)，再利用所結(jié)合大分子的特殊性質(zhì)得到最初的雜交信號，由于所選用的和抗生物素結(jié)合的分子種類繁多，因而檢測方法也更趨多樣化。特別是如果采用尼龍膜作為固相支持物，直接以熒光標記的探針用于DNA芯片雜交將受到很大的限制，因為在尼龍膜上熒光標記信號信噪比較低。因而使用尼龍膜作為固相支持物的這些研究者大多是采用生物素標記的。目前使用較多的是美國 General Scanning公司開發(fā)的基因芯片專用檢測系統(tǒng)(SeanArray 3000)，采用激光共聚焦掃描原理進行熒光信號采集，由計算機處理熒光信號，并對每個點的熒光強度

37、數(shù)字化后進行分析。近期又開發(fā)出了Scan Array 5000 ,其掃描精度和功能有較大的提高。七結(jié)果的分析樣品在被測定前，首先要經(jīng)過消化，使待測組織細胞中的DNA或RNA釋放出來，在經(jīng)過適當?shù)臄U增后，以熒光標記物標記，放入基因芯片自動孵育裝置(Fluidics Station )中，由其自動控制反應的時間、溫度以及緩沖液的配比等反應條件，進行雜交，這一過程，僅需要數(shù)秒鐘。雜交完成后，要對基因芯片進行讀片”即使用激光共聚焦熒光掃描顯微鏡，對基因芯片表面的每個位點進行檢測。這種顯微鏡，將聚焦的平面設定為芯片的表面，因此可以檢測結(jié)合到芯片表面位點的樣品片斷的熒光標記，而待測樣品中未和芯片上探針結(jié)合

38、的熒光標記物，則懸浮于溶液中，由于不在聚焦平面上，因而不被檢測。樣品和探針的錯配是影 響雜交反應結(jié)果的重要因素，但由于樣品和芯片上的探針正確配對時產(chǎn)生的熒光信號要比錯 配時強的多，因此，通過對信號強度的分析，就可以區(qū)分正確和錯誤的配對。為了使結(jié)果的檢驗更加簡便和快速，Affymetrix的基因芯片的分析系統(tǒng)中采用了基因陣列掃描儀和專用的基因芯片工作站，對一幅包含數(shù)萬個探針位點的基因芯片圖樣的分析，僅需要數(shù)分鐘的時間。這樣在短短的幾十分鐘至數(shù)小時內(nèi)，就可以完成用傳統(tǒng)方法需要數(shù)月才 能完成的幾萬乃至幾十萬次雜交分析試驗。八基因芯片的使用（一）基因表達分析基因芯片具有高度的敏感性和特異性，它可以監(jiān)測

39、細胞中幾個至幾千個mRNA拷貝的轉(zhuǎn)錄情況。和用單探針分析 mRNA的點雜交技術不同，基因芯片表達探針陣列使用了大約20對寡核苷酸探針來監(jiān)測每一個 mRNA的轉(zhuǎn)錄情況。每對探針中，包含一 個和所要監(jiān)測的 mRNA完全吻合和一個不完全吻合的探針（圖 2），這兩個探針的差別在于 其中間位置的核苷酸不同。這種成對的探針可以將非特異性雜交和背景訊號減小到最低的水 平，由此我們就可以確定那些低強度的mRNA。目前，Affymetrix公司已經(jīng)生產(chǎn)出 HugeneFL、Mu6500 （含有小鼠6 500個基因）、Ye6100 （含有酵母6 100個基因）等基因芯片 成品。1 分析基因表達時空特征。英國劍橋大

40、學Whitehead研究所的Frank C.P. Holstege等人，使用含有酵母基因組的基因芯片，深入研究了真核細胞基因組的調(diào)節(jié)周期。使用基因組水平的表達分析，監(jiān)測那些表達受轉(zhuǎn)錄起始機制的關鍵成分控制的基因，發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶II、主要的轉(zhuǎn)錄因子 TFIID和SAGA染色體修飾復合物等均在基因的表達中有自己特定的作 用位點15。通過本試驗，研究人員揭示了：（ 1）基因特異性的轉(zhuǎn)錄因子對表達的調(diào)控作用。（2）細胞在缺乏營養(yǎng)的環(huán)境中，基因不同位點的協(xié)同調(diào)節(jié)作用的全新機制。（3 ）信號轉(zhuǎn)導通路的最終作用位點，在最初的幾步中就可以確定。以此試驗為基礎，研究人員進一步繪制 出了酵母基因組控制圖，并由此

41、分析出了各種調(diào)節(jié)因子在基因上不同的作用位點和其作用的 分子機制。美國Stanford大學的V.R.Iyer等人16，對成纖維細胞中和細胞增生和損傷修復有關的 基因進行了分析。首先，他們用成纖維細胞中的8 600個基因片斷制成基因芯片的探針陣列，通過和mRNA反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA的雜交反應，可以判斷出該基因的活性。在試驗中，成纖維細胞被置于無營養(yǎng)的環(huán)境中，使絕大部分基因的活性關閉，兩天后，加入10%的血清，24小時內(nèi)，分6個不同的時間點，觀察基因的活化情況。試驗結(jié)果表明，在所有被監(jiān)測的基因中，約有500個基因最為活躍，而使細胞保持不分裂狀態(tài)的基因活性被抑制。其中，最早被活化的是那些轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因。

42、在活化的基因中，有28個基因共同作用，控制細胞的增殖;8個和免疫反應的激活有關；19個和血管重建有關；另有許多基因，和血管新生密切相關。在腫瘤細胞中，基因的表達和正常的細胞存在著明顯的差異。通過基因芯片繪出基因表達的時空圖譜，有助于人類認識生命活動過程和特征。2基因差異表達檢測17生命活動中基因表達的改變是生物學研究的核心問題。理解人類基因組中10萬個不同的基因功能，監(jiān)測某些組織、細胞不同分化階段的差異基因表達(differential gene expression , DGE )十分重要。對差異表達的研究，可以推斷基因和基因的相互關系，細胞分化中基因開啟”或 關閉”的機制；揭示基因和疾病的

43、發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸的內(nèi)在聯(lián)系。目前 DGE研究方法主要有表達序列標簽(ESTs)測序、差減克隆(subtractive cloning )、差異顯示(differential display )、基因表達系歹U分析(serial analysis of gene expression, SAGE)。而cDNA微陣列雜交技術可監(jiān)測大量mRNA的轉(zhuǎn)錄，直接快速地檢測出極其微量的 mRNA，且易于同時監(jiān)測成千上萬的基因，是研究基因功能的重要手段之一。Rihn BH等利用基因芯片檢測胸膜間皮瘤和正常細胞間比較了6500個基因，發(fā)現(xiàn)了300多個差異基因的表達。其中幾個典型基因的表達經(jīng)RT-PCR進行定量后

44、，可作為胸膜間皮瘤診斷的標記物(Markers ) 18。Sgroi19報告DNA芯片結(jié)合激光捕獲顯微切割技術(I aser capture microdissection )用于乳癌浸潤期和轉(zhuǎn)移期及正常細胞的基因表達譜(geneexpression profiles )差異研究，結(jié)果被 定量PCR和免疫組化所證實。差異表達有助于早 期發(fā)現(xiàn)瘤細胞3萬個基因和正常細胞的區(qū)別，有助于了解瘤細胞的發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移和藥敏。 最近，美國毒物化學研究所(CIIT )和國家環(huán)境健康科學研究所( NIEHS )正計劃在一張玻片上建立8 700個小白鼠cDNA芯片，用于肝癌的研究。我國也已成功研制出能檢出410

45、00種基因表達譜的芯片。美國Stanford大學的David Botstein利用cDNA微陣列芯片，對乳腺癌細胞的基因表達進行了分析，發(fā)現(xiàn)其基因表達水平明顯低于正常細胞。利用基因芯片對表達進行分析，在一次試驗中可以獲取相當于在60余萬次傳統(tǒng)的Northern雜交中所獲得的關于基因表達的信息。通過這種實驗方法，可以建立一種全新的腫瘤分類學方法，即依據(jù)每個腫瘤細胞中的基因表達情況對腫瘤細胞進行分類。基因芯片技術在分析基因的表達中具有不可比擬的優(yōu)勢。3發(fā)現(xiàn)新基因Moch等利用腫瘤微陣列芯片（5 184個cDNA片段）發(fā)現(xiàn)了腎細胞癌的腫瘤標志物基因，并于正常細胞進行比較。在532份標本中檢測到胞漿纖

46、維Vimentin的表達基因，陽性率為51%61%20。追蹤觀察，有 Vimentin表達的患者，預后極差。人類大量 ESTs給cDNA微陣列提供了豐富的資源，數(shù)據(jù)庫中400 000個ESTs代表了所有人類基因，成千上萬的ESTs微陣列將為人類基因表達研究提供強有力的分析工具。這將大大地加速人類基因組的功能分析21。定量檢測大量基因表達水平在闡述基因功能、探索疾病原因及機理、發(fā)現(xiàn)可能的診斷及治療靶等方面是很有價值的。如該技術在炎癥性疾病類風濕性關節(jié)炎（RA）和炎癥性腸?。↖BD）的基因表達研究中，由RA或IBD組織制備探針，用 Cy3和Cy5熒光素標記，然后和靶cDNA微陣列雜交，可檢測出炎癥

47、疾病誘導的基因如TNF- a IL或粒細胞集落刺激因子，同時發(fā)現(xiàn)一些以前未發(fā)現(xiàn)的基因如HME基因和黑色素瘤生長刺激因子。Schena等人22報道了 cDNA的微陣列在人類基因表達監(jiān)測、生物學功能研究和基因發(fā)現(xiàn)方面的使用。采用含1,046個已知序列的cDNA微陣列，用高速機器人噴印在玻片上，用雙色雜交法定量監(jiān)測不同 基因表達，在一定的實驗條件下，不同表達模式的陣列成分通過序列分析鑒定其特征。該方法較以往常用的方法敏感 10倍以上，檢測限度為1:500,000（wt/wt）總?cè)梭wmRNA。在培養(yǎng)T 細胞熱休克反應的測定中，發(fā)現(xiàn)17個陣列成分的熒光比較明顯改變，其中11個受熱休克處理的誘導，6個呈現(xiàn)

48、中度抑制，對相應于 17個陣列成分的cDNA測序發(fā)現(xiàn)5個表達最高的成 分是5種熱休克蛋白，17個克隆中發(fā)現(xiàn)3個新序列。另外，在佛波酯誘導檢測中23，發(fā)現(xiàn)有4種組織中檢測出15種熱休克和6個陣列成分信號增強超過 2倍，測序及數(shù)據(jù)庫比較揭示有 5個已知的，誘導表達最高的兩個 是PCA-1酪氨酸磷酸酶和核因子-啟1 ,有一個是未知的。 這4個新基因的表達水平均相對較 低，僅呈現(xiàn)2倍的誘導。Northern雜交結(jié)果證實了微陣列的結(jié)果。進一步檢測了人的骨髓、 腦、前列腺及心臟組織中熱休克和佛波酯調(diào)節(jié)基因的表達,佛波酯調(diào)節(jié)基因的表達，其表達水平和Jurkat細胞中相應成分的表達水平密切相關如在四種組織中表

49、達水平最高的兩個基因3-actin和細胞色素C氧化酶在Jurkat細胞中的表達水平也很高。上述實驗提示在缺乏任何序列信息的條件下，微陣列可用于基因發(fā)現(xiàn)和基因表達檢測。目前，大量人類 ESTs給cDNA微陣列提供了豐富的資源，數(shù)據(jù)庫中400,000個ESTs代表了所有人類基因，成千上萬的ESTs微陣列將為人類基因表達研究提供強有力的分析工 具。這將大大地加速人類基因組的功能分析。4大規(guī)模DNA測序人類基因組計劃的實施促進了高效的、自動化操作的測序方法的發(fā)展。芯片技術中雜交測序(sequencing by hybridization, SBH )技術及鄰堆雜交(contiguous stackin

50、g hybridization, CSH )技術即是一種新的高效快速測序方法24-26。用含65 536個8聚寡核苷酸的微陣列，采用 SBH技術，可測定200 bp長DNA序列，采用67 1 08 864個13聚寡核苷酸的微陣列，可對數(shù)千個堿基長的DNA測序。SBH技術的效率隨著微陣列中寡核苷酸數(shù)量和長度的增加而提高，但微陣列中寡核苷酸數(shù)量和長度的增加則提高 了微陣列的復雜性，降低了雜交準確性。CSH技術彌補了 SBH技術存在的弊端，CSH技術的使用增加了微陣列中寡 核苷酸的有效長度，加強了序列準確性，可進行較長的DNA測序。計算機模擬論證了 8聚寡核苷酸微陣列和5聚寡核苷酸鄰堆雜交，相當于1

51、3聚寡核苷酸 微陣列的作用，可測定數(shù)千個核苷酸長的DNA序列26。Dubiley等人26將合成的10聚寡核苷酸固定于排列在載片表面的 0.1 >0.1 X0.02mm或1 X1 X0.02mm聚丙酰胺凝膠墊上制備聚 寡核苷酸微陣列，先用分離微陣列(fractionation chips )進行單鏈DNA分離，再用測序微 陣列(sequencing chips )分析序列，后者聯(lián)合采用了10聚寡核苷酸微陣列的酶促磷酸化、DNA雜交及和鄰堆的5聚寡核苷酸連接等技術。該方法可用于含重復序列及較長序列的DNA序列測定及不同基因組同源區(qū)域的序列比較。利用基因芯片測序的準確率達99%以上。正如NIH

52、首腦Harold Varmus在美國細胞生物學1998年年會上所說：在基因芯片的幫助下，我們將能夠監(jiān)測一個細胞乃至整個組織中所有基因的行為?！?二) 基因型、基因突變和多態(tài)性分析性狀和多種遺傳性疾病有著密切的關系。通過對大量具有不同性狀的個體的基因型進行比 較，就可以得出基因和性狀的關系。但是，由于大多數(shù)性狀和遺傳性疾病是由多個基因同時決定的，因此分析起來就十分困難，然而基因芯片技術恰恰解決了這一問題，利用其可以同時反應數(shù)千甚至更多個基因的特性，我們就可以分析基因組中不同基因和性狀或疾病的關系。美國Stanford大學的E.A.Winzeler等27，以兩種不同菌株的酵母（S96和YJM789

53、）作為實驗材料，對控制酵母對放線菌酮的抗藥性的基因進行分析。將含有酵母150 000個DNA片斷的基因芯片分別和這兩株酵母活化轉(zhuǎn)錄的mRNA分子雜交，S96幾乎全部吻合，而YJM789和芯片上的探針組存在較大的差異，約有3000個位點沒有雜交顯色。由于S96對放線菌酮有抗藥性而 YJM789的抗藥性則弱的多，因此可以判定控制這一抗藥性的基因的所 在。而后，通過對 S96和YJM789雜交后產(chǎn)生的抗藥子代的遺傳標記的分析，進一步確定， 控制該抗藥性的基因位于 15號染色體，是一長約57 000個堿基的片斷。美國國家人類基因 組研究室的J.G.Hacia等在Fodor研究小組的協(xié)助下28，將基因芯

54、片使用于雙色突變分析。 他們的分析對象是和人類遺傳性乳腺癌和卵巢癌密切相關的BRCA1基因的外顯子11。在擴增后，將BRCA1基因的外顯子11置于含有熒光素-12-UTP的環(huán)境中進行體外轉(zhuǎn)錄反應，而 后將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的 mRNA和BRCA1外顯子11芯片雜交，4小時后，用藻紅蛋白染色。在觀察 時，用488nm的氬離子激光進行掃描，熒光染色位點呈現(xiàn)綠色，而藻紅蛋白染色的位點呈 現(xiàn)紅色。使用雙色分析，可以更為清楚的監(jiān)測未知樣品和標準鏈之間的競爭性雜交情況，進而分析該基因中的不同突變。通過對15名患者BRCA1基因的觀察，有14名患者在外顯子11位點存在不同的突變。Hacia等：29在1.28 cm X

55、1.28 cm的芯片上固定了 9.66 X104個長度為20 nt的寡核苷酸探針，用于檢測乳腺癌基因BRCA1的exon11 （3.45 kb）中所有可能的堿基置換、插入和缺失（15 bp）突變。針對每一個位點，共有 28個獨立的探針，14個針對 有義鏈，14個針對反義鏈。14個探針包括2個野生型，3個堿基置換、4個插入突變、5個堿 基缺失。在15例患者樣品中，發(fā)現(xiàn)有14例有基因突變，類型包括點突變、插入及缺失等；在20例對照樣品中均未檢出假陽性結(jié)果，結(jié)果表明DNA芯片技術可快速、準確地研究大量患者樣品中特定基因所有可能的雜合變。Cronin等：30：分別用兩種DNA芯片檢測囊性纖維化跨膜傳導調(diào)節(jié)（CFTR）的突變，其中一個芯片包含1 480個探針，檢測了 CFTR基因的第1 0和11外顯子的已知突變，包括缺失、插入和單堿基置換，并分析了10個未知樣品的 CFTR基因，其結(jié)果和 PCR-RELP的分析結(jié)果完全一致。Guo等人31利用結(jié)合在玻璃支持物上的等位基因特異性寡核苷酸（ASOs）微陣列建立了簡單快速的基因多態(tài)性分析方法。將ASOs共價固定于玻璃載片上，采用PCR擴增基因組DNA，其一條引物用熒光素標記，另一條引物用生物素標記，分離兩條互補的DNA鏈，將熒光素標記DNA鏈和微陣列雜交，通過