基因芯片技術(shù)基礎(chǔ)知識

1、HGP生物科學(xué)正迅速地演變?yōu)橐婚T信息科學(xué)。最明顯的一個(gè)例子就是目前正在進(jìn)行的（human genome project），最終要搞清人類全部基因組的30億左右堿基對的序列。除了人的遺傳信息以外，還有其它生物尤其是模式生物（model organism ）已經(jīng)或正在被大規(guī)模測序，如大腸桿菌、啤酒酵母、秀麗隱桿線蟲以及中國和日本科學(xué)家攻關(guān)的水稻基因組計(jì) 劃。但單純知曉生物基因組序列一級結(jié)構(gòu)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，還必須了解其中基因是怎樣組織起來的，每個(gè)基因的功能是什么，又是怎樣隨發(fā)育調(diào)控和微環(huán)境因素的影響而在特定的時(shí)空域中展開其表達(dá)譜的，即我們正由結(jié)構(gòu)基因組時(shí)代邁入功能基因組時(shí)代。隨著這個(gè)功能基因組學(xué)問題的提

2、出（后基因組時(shí)代，蛋白組學(xué)），涌現(xiàn)出許多功能強(qiáng)大的研究方法和研究工具，最突出的就是細(xì)胞蛋白質(zhì)二維凝膠電泳（2-D-gel）（及相應(yīng)的質(zhì)譜法測蛋白分子量）和生物芯片（Biochip ）技術(shù)2。一什么是基因芯片生物芯片，簡單地說就是在一塊指甲大?。?cm3）的有多聚賴氨酸包被的硅片上或其它固相支持物（如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等，但需經(jīng)特殊處理。作原位合成的支持物在聚合反應(yīng)前要先使其表面衍生出羥基或氨基（視所要固定的分子為核酸或寡肽而定）并和保護(hù)基建立共價(jià)連接；作點(diǎn)樣用的支持物為使其表面帶上正電荷以吸附 帶負(fù)電荷的探針分子， 通常需包被以氨基硅烷或 多聚賴氨酸等）將生物分子探針

3、（寡核苷酸 片段或基因片段）以大規(guī)模陣列的形式排布，形成可和目的分子（如基因）相互作用，交行 反應(yīng)的固相表面，在激光的順序激發(fā)下標(biāo)記熒光根據(jù)實(shí)際反應(yīng)情況分別呈現(xiàn)不同的熒光發(fā)射 譜征，CCD相機(jī)或激光共聚焦顯微鏡 根據(jù)其波長及波幅特征收集信號，作出比較和檢測， 從而迅速得出所要的信息。生物芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、組織芯片。而基因芯片中，最成功的是DNA芯片，即將無數(shù)預(yù)先設(shè)計(jì)好的寡 核苷酸或cDNA在芯片上做成點(diǎn)陣，和樣 品中同源核酸分子雜交 的芯片?；蛐酒幕驹硗酒夹g(shù)中雜交測序（sequencing by hybridization, SBH ）。即任何線狀的單鏈 DNA或RNA

4、序列均可被分解為一個(gè)序列固定、錯(cuò)落而重疊的寡 核苷酸, 又稱亞序列(subsequenee )。例如可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATG 分解成5個(gè)8 nt亞 序列：CTCATATG(2) GCTCATAT(3) AGCTCATA(4) TAGCTCAT(5) TTAGCTCA這5個(gè)亞序列依次錯(cuò)開一個(gè)堿基而重疊7個(gè)堿基。亞序列中 A、T、C、G 4個(gè)堿基自由組合而形成的所有可能的序列共有65536種。假如只考慮完全互補(bǔ)的雜交，那么48個(gè)8 nt亞序列探針中，僅有上述5個(gè)能同靶DNA雜交。可以用人工合成的已知序列的所有可能的n體寡核苷酸探針和一個(gè)未知的熒光標(biāo)記DNA/RNA序列雜交，通過對雜

5、交熒光信號檢測，檢出所有能和靶DNA雜交的寡核苷酸，從而推出靶DNA中的所有8 nt亞序列，最后由計(jì)算 機(jī)對大量熒光信號的譜型(pattern )數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，重構(gòu)靶 DNA的互補(bǔ)寡核苷酸序列。二芯片類型一般基因芯片按其材質(zhì)和功能，基本可分為以下幾類4(一) 元件型微陣列芯片1生物電子芯片2. 凝膠元件微陣列芯片3. 藥物控釋芯片(二) 通道型微陣列芯片1.毛細(xì)管電泳芯片2 P CR擴(kuò)增芯片3. 集成DNA分析芯片4. 毛細(xì)管電層析芯片（三）生物傳感芯片1光學(xué)纖維陣列芯片2白光干涉譜傳感芯片小鼠基因表達(dá)譜芯片（MGEC）附:目前國內(nèi)基因芯片常見品種.（上海博星公司）芯片品種芯片點(diǎn)數(shù)MGEC-2

6、0S2000MGEC-40S4000MGEC-80S8000癌癥相關(guān)基因表達(dá)譜芯片 （CRGEC）分類芯片型號芯片點(diǎn)數(shù)肝癌相關(guān)基因表達(dá)譜芯片LiverC-16S1626LiverC-16D3252LiverC-9.5NS954LiverC-9.5ND1908肺癌相關(guān)基因表達(dá)譜芯片Lun gC-7.3S737Lun gC-7.3D1474人類基因表達(dá)譜芯片（HGEC）芯片品種芯片點(diǎn)數(shù)HGEC-10S1024HGEC-10D2048HGEC-20S2048HGEC-20D4096HGEC-40S4096HGEC-40D8192HGEC-80S8192HGEC-80D16184三基因芯片的制備芯片種

7、類較多，制備方法也不盡相同，常見的芯片可分為兩大類：一類是原位合成；一種是直接點(diǎn)樣。原位合成適用于寡核苷酸；直接點(diǎn)樣多用于大片段DNA，有時(shí)也用于寡核苷酸，甚至mRNA。原位合成有兩種途徑。一是光蝕刻法；一是噴印法。光蝕刻法可以合 成30nt左右，噴印法可以合成 40-50nt，光蝕刻法每步縮合率較低，一般為95%左右，合成30nt產(chǎn)率僅20% ;噴印法可達(dá)99%以上，合成30nt產(chǎn)率可達(dá)74%，從這個(gè)意義上說噴印法 特異性應(yīng)比光刻法高。此外，噴印法不需特殊的合成試劑。和原位合成法比較點(diǎn)樣法較簡單，只需將預(yù)先制備好的寡 核苷酸或cDNA等樣品通過自動點(diǎn)樣裝置點(diǎn)于經(jīng)特殊處理的玻璃片 或其它材料上

8、即可。1原位光蝕刻合成5-7寡聚核苷酸原位光蝕刻合成技術(shù)是由Asymetrix公司開發(fā)的，采用的技術(shù)原理是在合成堿基單體的5'羥基末端連上一個(gè)光敏保護(hù)基。合成的第一步是利用光照射使羥基端脫保護(hù)，然后一個(gè) 5'端保護(hù)的核苷酸單體連接上去，這個(gè)過程反復(fù)進(jìn)行直至合成 完畢。使用多種掩蓋物能以更少的合成步驟生產(chǎn)出高密度的陣列，在合成循環(huán)中探針數(shù)目呈指數(shù)增長。某一含n個(gè)核苷酸的寡聚核苷酸，通過4 xn個(gè)化學(xué)步驟能合成出4n個(gè)可能結(jié)構(gòu)。例如：一個(gè)完整的十 核苷酸通過32個(gè)化學(xué)步驟，8個(gè)小時(shí)可能合成65,536個(gè)探針。目前美國Affymetrix公司已有同時(shí)檢測6,500個(gè)已知人類基因的 D

9、NA芯片，并且正在制 備含500,000-1,000,000個(gè)寡核苷酸探針的人類基因檢測芯片。該公司每月投入基因芯片研 究的經(jīng)費(fèi)約100萬美元，目前產(chǎn)品尚未公開投放市場發(fā)揮經(jīng)濟(jì)效益，但已有許多公司及研究 機(jī)構(gòu)和其簽約購買其產(chǎn)品。該產(chǎn)品不僅可用于基因表達(dá)分析和基因診斷等，而且在大規(guī)模藥物開發(fā)方面也具有誘人的前景。Affymetrix的大部分產(chǎn)品將在98年底全面投放市場。屆時(shí)，在其產(chǎn)品被廣泛采用的同時(shí)，其所有的研究投入將變成巨大的利潤。其它公司產(chǎn)品也正在從實(shí)驗(yàn)室技術(shù)研究走向開發(fā)使用。目前，用于分子診斷的DNA芯片不僅已可用于檢測愛滋病病毒基因還可用于囊性纖維化（CF ）、乳腺癌、卵巢癌等疾病相關(guān)基

10、因的基因診斷。鑒于光刻設(shè)備技術(shù)復(fù)雜，只能有專業(yè)化公司生產(chǎn)，加之成本高及合成效率不高的問題，因此有待進(jìn)行以下研究：對光刻技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，提高合成效率；開發(fā)新的原位合成技術(shù)，如噴印合成技術(shù)，該技術(shù)既能進(jìn)行原位合成又能進(jìn)行非原位合成。另一方法是光導(dǎo)原位合成法。具體方法是在經(jīng)過處理的載玻片表面鋪上一層連接分子（linker），其羥基上加有光敏保護(hù)基團(tuán)，可用光照除去，用特制的光刻掩膜（photolithographic mask ）保護(hù)不需要合成的部位，而暴露合成部位，在光作用下去除羥基上的保護(hù)基團(tuán)， 游離羥基，利用化學(xué)反應(yīng)加上第一個(gè)核苷酸，所加核苷酸種類及在芯片上的部位預(yù)先設(shè)定，所引入的核苷酸帶有光敏保

11、護(hù)基團(tuán)，以便下一步合成。然后按上述方法在其它位點(diǎn)加上另外 三種核苷酸完成第一位核苷酸的合成，因而N個(gè)核苷酸長的芯片需要4N個(gè)步驟。每一個(gè)獨(dú) 特序列的探針稱為一個(gè)feature，這樣的芯片便具有4N個(gè)feature ”包含了全部長度為 N的核苷酸序列。這種原位直接合成的方法無須制備處理克隆和PCR產(chǎn)物，但是每輪反應(yīng)所需設(shè)計(jì)的光柵則是主要的經(jīng)費(fèi)消耗。運(yùn)用這種方法制作的芯片密度可高達(dá)106探針/平方厘米，即探針間隔為 5 10 g，但只能制作II型DNA芯片。見圖一。PhOlL¥VFiMhJ RealmsDcrivalixcd、kirih聲 nl ohii|iii thipPhalLili

12、 iho 14phy F<Uafcn|$I light眈認(rèn)口沁Ctofilbng RcjLgcnijhim冊PmteUNjj強(qiáng)C<Hn(M*kr *hifi Ilsc2CywniiK 廠 M CcHiplm Rcjjx-mPidiJIy cnmptoctlsymlicsi> 皿K iHtgiinuc 怙 iMidczNuckLHidk： Key r; A 7 l t A； T 15Repealed Synthciic Cycles2原位噴印合成芯片原位噴印合成原理和噴墨打印類似，不過芯片噴印頭和墨盒有多個(gè)，墨盒中裝的是四種堿基等液體而不是碳粉。噴印頭可在整個(gè)芯片上移動并根據(jù)芯

13、片上不同位點(diǎn)探針的序列需要將特定的堿基噴印在芯片上特定位置。該技術(shù)采用的化學(xué)原理和傳統(tǒng)的DNA固相合成一致，因此不特殊制備的化學(xué)試劑。3點(diǎn)樣法 點(diǎn)樣法是將合成好的探針、cNDA或基因組DNA通過特定的高速點(diǎn)樣機(jī)器人直接點(diǎn)在芯片上。點(diǎn)樣分子可以是核酸也可以是寡核酸。一些研究者采用人工點(diǎn)樣的方法將寡即固定于載玻片上，制備好的DNA芯片可置于緩沖液中保存。由于方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適于大規(guī)模DNA芯片制作，因而實(shí)現(xiàn)自動化點(diǎn)樣就顯得尤為重要。有的研究者用多聚賴氨酸 包被固相支待物玻片，經(jīng)過分區(qū)后用計(jì)算機(jī)控制的微陣列點(diǎn)樣機(jī)按照預(yù)先設(shè)計(jì)順序點(diǎn)上核酸分 子，點(diǎn)樣量很小，約為5nl。大規(guī)模CDNA芯片多采用這種方法

14、， 和其寡核苷酸微芯片相比。 DNA芯片的潛在優(yōu)越性是具有更強(qiáng)的親和勢和特異性雜交，但是需要大量制備，純化，量 化，分類PCR產(chǎn)物。有的研究者將玻片上覆蓋 20 pm厚薄層聚丙烯酰胺凝膠作為支持物， 采用機(jī)械刻寫或光刻的方法在其表面劃上網(wǎng)格，并用激光照射蒸發(fā)掉單元間隙的多余凝膠， 以實(shí)現(xiàn) DNA芯片分區(qū)，單元大小為 40 >40 m 或100 X100 m 間隔分別為50 m 和100 pm。 然后將化學(xué)方法合成的寡 核苷酸探針自動化點(diǎn)樣于各個(gè)單元內(nèi)而制成DNA芯片，點(diǎn)樣速度可達(dá)2000單元/秒。其裝置采用的機(jī)器人有一套計(jì)算機(jī)控制三維移動裝置、多個(gè)打印/噴印針的打印/噴印頭；一個(gè)減震底座

15、，上面可放內(nèi)盛探針的多孔板和多個(gè)芯片。根據(jù)需要還可以有溫度和濕度控制裝置、針洗滌裝置。打印 /噴印針將探針從多孔板取出直接打印或噴印于芯片上。直接 打印時(shí)針頭和芯片接觸，而在噴印時(shí)針頭和芯片保持一定距離。打印法的優(yōu)點(diǎn)是探針密度高， 通常1平方厘米可打印2,500個(gè)探針。缺點(diǎn)是定量準(zhǔn)確性及重現(xiàn)性不好，打印針易堵塞且使 用壽命有限。噴印法的優(yōu)點(diǎn)是定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，使用壽命長。缺點(diǎn)是噴印的斑點(diǎn)大，因 此探針密度低，通常1平方厘米只有400點(diǎn)。國外有多家實(shí)驗(yàn)室和公司研究開發(fā)打印/噴印設(shè)備，目前有一些已經(jīng)商品化。 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院和益生堂生物企業(yè)公司目前正在聯(lián)手利用打印 /噴印技術(shù)進(jìn)行生物芯片的研究和開

16、發(fā)，預(yù)計(jì)2年內(nèi)將有用于實(shí)驗(yàn)室研究或臨床診斷的基因芯 片產(chǎn)品問世。見圖4電子芯片8-10電子芯片是由美國N anogen公司開發(fā)的，目前國內(nèi)清華大學(xué)和復(fù)旦大學(xué) 也在開發(fā)這一技術(shù)。這種芯片為帶有陽電荷的硅芯片、芯片經(jīng)熱氧化，制成1mm ximm的陣列、每個(gè)陣列含多個(gè)微電極，在每個(gè)電極上通過氧化硅沉積和蝕刻制備出樣品池。將連接鏈親和素的瓊脂糖覆蓋在電極上，在電場作用下生物素標(biāo)記的探針即可結(jié)合在特定電極上。電子芯片最大特點(diǎn)是雜交速度快，可大大縮短分析時(shí)間。制備復(fù)雜、成本高是其不足。5三維芯片11-12三維芯片是由美國的Packard、摩托羅拉、Argonne國家實(shí)驗(yàn)室三家機(jī)構(gòu)和俄羅斯Engelhard

17、t分子生物學(xué)研究所合作開發(fā)的一種芯片技術(shù)。三維生物芯片實(shí)質(zhì)上 是一塊顯微鏡載玻片，其上有10,000個(gè)微小聚乙烯酰胺凝膠條，每個(gè)凝膠條可用于靶 DNA ,RNA和蛋白質(zhì)的分析。先把乙知化合物加在凝膠條上，再用3cm長的微型玻璃毛細(xì)管將待測樣品加到凝膠條上。每個(gè)毛細(xì)管能把小到0.2nl的體積打到凝膠上。以上幾家機(jī)構(gòu)合作研究的生物芯片系統(tǒng)具有其它生物芯片系統(tǒng)不具有的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。一是凝膠的三維化能加進(jìn)更多的已知物質(zhì)，增加了敏感性。二是可以在芯片上同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增和檢則。一般情況下，必須在微量多孔板上先進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，再把樣品加到芯片上，因此需要進(jìn)行許多額外操作。本芯 片所用凝膠體積很小。使PCR擴(kuò)增體系

18、的體積減小1,000倍（總體積約納升級），從而節(jié)約了每個(gè)反應(yīng)所用的 PCR酶（約減少100倍）。三是以三維構(gòu)象形式存在的蛋白和基因材料可 以其天然狀態(tài)在凝膠條上分析，可以進(jìn)行免疫測定，受體-配體研究和蛋白組分析。6流過式芯片（flow-thru chip ） 13 Cene Logic正在開發(fā)一種在芯片片基上制成格柵狀 微通道，Cene Logic設(shè)計(jì)及合成特定的寡核苷酸探針，結(jié)合于微通道內(nèi)芯片的特定區(qū)域。從待測樣品中分離 DNA或RNA并對其進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后，該樣品流過芯片，固定的寡核苷酸探針捕獲和之相互補(bǔ)的核酸，采用Cene Logic's信號檢測系統(tǒng)分析結(jié)果。 流通式芯片用于高

19、通量分析已知基因的變化，其特定在于敏感性高：由于寡核苷酸吸附表面的增大，流過式芯片可監(jiān)測稀有基因表達(dá)的變化；速度快：微通道加速了雜交反應(yīng)， 減少了每次檢測所需時(shí)間；價(jià)格降低：由于采用了特殊的共價(jià)化學(xué)技術(shù)將寡 核苷酸吸附于微通道內(nèi)， 使 每一種流過芯片可反復(fù)使用多次，從而使其成本降低。四基因芯片樣品制備一般說來使用 DNA芯片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)包括5個(gè)過程：生物學(xué)問題的提出和芯片設(shè)計(jì)；樣品制備；生物雜交反應(yīng)；結(jié)果探測；數(shù)據(jù)處理和建模。1 樣品制備。一般所需 mRNA的量是以一張表達(dá)譜芯片需要 3用mRNA計(jì)算的不同組織抽提3 10mRNA所需組織量器官/組織*提取3用mRNA所需組織量（克）提取10 （j

20、gmRNA 所需織量（克）總RNA得率單位:毫克RNA/克組織mRNA所占百分比%成人正常組織肝0.20830.69441.80 - 1.80 mg/g0.80成人正常組織腦缺數(shù)據(jù)缺數(shù)據(jù)1.30 - 1.30 mg/g缺數(shù)據(jù)成人正常組織肺0.30001.00001.00 - 1.00 mg/g1.00成人正常組織心0.50001.66670.60 - 0.60 mg/g1.00成人正胃0.18520.61732.70 - 2.70 mg/g0.60常組織成人正常組織喉0.31251.04171.20 - 1.20 mg/g0.80病理組織結(jié)腸癌0.25210.84031.70 - 1.70 m

21、g/g0.70病理組織1=1=1 J i=r'冃癌0.43171.43880.50 - 0.50 mg/g1.39病理組織空腸腺癌0.35711.19051.40 - 1.40 mg/g0.60病理組織直腸癌0.16040.53481.70 - 1.70 mg/g1.10病理組織肝癌0.11160.37203.84 - 3.84 mg/g0.70病理組織肺癌0.12820.42742.00 - 2.00 mg/g1.17考慮到個(gè)體差異以及樣品在研磨、勻漿等過程中的損失，客戶提供的樣品量應(yīng)在上述基礎(chǔ)上增加1-2倍。2樣本采集過程關(guān)鍵點(diǎn).組織標(biāo)本采集操作建議規(guī)程，（取標(biāo)本所需關(guān)鍵器材和處理

22、要求）鋁箔經(jīng)DEPC水浸泡過夜，78 °C烘干，高壓滅菌后烘干1.5 ml微離心管15 ml聚丙烯離心管市場有售RNAase-Free 的相應(yīng)規(guī)格離心管標(biāo)簽紙記號筆樣品登記表由客戶指定專人填寫液氮罐應(yīng)常備液氮罐，并保證液氮的來源取材部位的病理切片由客戶提供1-2張注:以下步驟1 - 5應(yīng)在冰上進(jìn)行且不超過15分鐘，超過時(shí)間會導(dǎo)致樣品的RNA降解。對腫瘤組織的取材，要求盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤和正常組織，例如對于手術(shù)切除的整個(gè)或部分前列腺，可能要根據(jù)冰凍切片報(bào)告的結(jié)果來判定要進(jìn)行研究的取材部位。1離體新鮮組織，切成多個(gè)1cm3小塊，易V除結(jié)締組織和脂肪組織。胃、腸組織應(yīng)剪除外膜；肝、腎、脾

23、應(yīng)剪除門部血管神經(jīng)，腫瘤組織應(yīng)將周圍的正常組織切除干凈（正常組織也應(yīng)將 周圍的腫瘤組織切除干凈）。2在RNase-Free 0.9 %生理鹽水中漂洗樣品，以去除血漬和污物。3用鋁箔包裹組織，或用 5ml凍存管裝載組織（但最好統(tǒng)一采用鋁箔）。用記號筆在鋁箔或 凍 存管外表寫明樣品編號，并貼上標(biāo)簽，迅速投入液氮冷卻。4填寫樣品登記表，寫明樣品名稱、種類、編號、取樣日期、樣品處理情況等將液氮冷卻的組織放入樣品袋（每個(gè)樣品袋只保存同樣的組織），袋口留一根編號繩，繩上粘一張標(biāo)簽紙（標(biāo)簽上注明：樣品名稱、編號、日期），迅速轉(zhuǎn)入便攜式液氮罐5保留1-2張取材部位的病理切片。五生物芯片雜交待分析基因在和芯片結(jié)

24、合探針雜交之前必需進(jìn)行分離、擴(kuò)增及標(biāo)記。根據(jù)樣品來源、基因含量及檢測方法和分析目的不同，采用的基因分離、擴(kuò)增及標(biāo)記方法各異。當(dāng)然，常規(guī)的基因分離、擴(kuò)增及標(biāo)記技術(shù)完全可以采用，但操作繁瑣且費(fèi)時(shí)。高度集成的微型樣品處理系統(tǒng)如細(xì)胞分離芯片及基因擴(kuò)增芯片等是實(shí)現(xiàn)上述目的的有效手段和發(fā)展方向。為了獲得基因的雜交信號必須對目的基因進(jìn)行標(biāo)記，目前采用的最普遍的熒光標(biāo)記方法和傳統(tǒng)方法如體外轉(zhuǎn)錄、PCR、逆轉(zhuǎn)錄等原理上并無多大差異，只是采用的熒光素種類更多，這可以滿足不 同來源樣品的平行分析。用計(jì)算機(jī)控制的高分辨熒光掃描儀可獲得結(jié)合于芯片上目的基因的 熒光信號，通過計(jì)算機(jī)處理即可給出目的基因的結(jié)構(gòu)或表達(dá)信息。雜

25、交條件的選擇和研究目的有關(guān)， 多態(tài)性分析或者基因測序時(shí)， 每個(gè)核苷酸或突變位點(diǎn) 都必須檢測出來。通常設(shè)計(jì)出一套四種寡聚核苷酸，在靶序列上跨越每個(gè)位點(diǎn)，只在中央位 點(diǎn)堿基有所不同，根據(jù)每套探針在某一特點(diǎn)位點(diǎn)的雜交嚴(yán)謹(jǐn)程度， 即可測定出該堿基的種類。如果芯片僅用于檢測基因表達(dá)，只需設(shè)計(jì)出針對基因中的特定區(qū)域的幾套寡聚核苷酸即可。這有利于增加檢測的特異性和低拷貝基因檢測的靈敏度。突變檢測，要鑒別出單堿基錯(cuò)配,需要更高的雜交嚴(yán)表達(dá)檢測需要長的雜交時(shí)間，更高的嚴(yán)謹(jǐn)性，更高的樣品濃度和低溫度,謹(jǐn)性和更短的時(shí)間。此外，雜交反應(yīng)還必須考慮雜交反應(yīng)體系中鹽濃度、探針GC含量和所帶電荷、 探針和芯片之間連接臂的長

26、度及種類、檢測基因的二級結(jié)構(gòu)的影響。有資料顯示探針和芯片之間適 當(dāng)長度的連接臂可使雜交效率提高150倍。連接臂上任何正或負(fù)電荷都將減少雜交效率。由于探針和檢測基因均帶負(fù)電荷，因此影響他們之間的雜交結(jié)合，為此有人提出用不帶電荷的肽核酸（PNA ）做探針9。雖然PNA的制備比較復(fù)雜，但和 DNA探針比較有許多特點(diǎn)， 如不需要鹽離子，因此可防止檢測基因二級結(jié)構(gòu)的形成及自身復(fù)性。由于PNA-DNA結(jié)合更加穩(wěn)定和特異，因此更有利于單堿基錯(cuò)配基因的檢測。六基因芯片檢測原理雜交信號的檢測是 DNA芯片技術(shù)中的重要組成部分。以往的研究中已形成許多種探測分子雜交的方法，如熒光顯微鏡、隱逝波傳感器、光散射表面共振

27、、電化傳感器、化學(xué)發(fā)光、 熒光各向異性等等，但并非每種方法都適用于DNA芯片。由于DNA芯片本身的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，需要確定雜交信號在芯片上的位置，尤其是大規(guī)模DNA芯片由于其面積小，密度大，點(diǎn)樣量很少，所以雜交信號較弱，需要使用光電倍增管 或冷卻的電荷偶連照相機(jī)(charged-coupled device camera，CCD)攝像機(jī)等弱光信號探測裝置。此外，大多數(shù)DNA芯片雜交信號譜型除了分布位點(diǎn)以外還需要確定每一點(diǎn)上的信號強(qiáng)度，以確定是完全雜交還是不完全雜交，因而探測方法的靈敏度及線性響應(yīng)也是非常重要的。雜交信號探測系統(tǒng)主要包括雜交信號產(chǎn)生、信號收集及傳輸和信號處理及成像三個(gè)部分組成。由于所

28、使用的標(biāo)記物不同， 因而相應(yīng)的探測方法也各具特色。 大多數(shù)研究者使用熒光標(biāo) 記物，也有一些研究者使用生物素標(biāo)記，聯(lián)合抗生物素結(jié)合物檢測DNA化學(xué)發(fā)光。通過檢測標(biāo)記信號來確定 DNA芯片雜交譜型。1 熒光標(biāo)記雜交信號的檢測方法使用熒光標(biāo)記物的研究者最多，因而相應(yīng)的探測方法也就最多、最成熟。由于熒光顯微鏡可以選擇性地激發(fā)和探測樣品中的混合熒光標(biāo)記物，并具有很好的空間分辨率和熱分辨 率，特別是當(dāng)熒光顯微鏡 中使用了共焦激光掃描時(shí)，分辨能力在實(shí)際使用中可接近由數(shù)值孔徑和光波長決定的空間分辨率，而在傳統(tǒng)的顯微鏡是很難做到的，這便為DNA芯片進(jìn)一步微型化提供了重要的檢測方法的基礎(chǔ)。大多數(shù)方法都是在人射照明

29、式熒光顯微鏡(epifluoesee nee microscope )基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，包括激光掃描熒光顯微鏡、激光共焦掃描顯微鏡、 使用了 CCD相機(jī)的改進(jìn)的熒光顯微鏡以及將DNA芯片直接制作在光纖維束切面上并結(jié)合 熒光顯微鏡的光纖傳感器微陣列。這些方法基本上都是將待雜交對象以熒光物質(zhì)標(biāo)記，如熒光素或麗絲膠(lissamine )等，雜交后經(jīng)過 SSC和SDS的混合溶液或 SSPE等緩沖液 清洗。(1 )激光掃描 熒光顯微鏡探測裝置比較典型。方法是將雜交后的芯片經(jīng)處理后固定在計(jì)算機(jī)控制的二維傳動平臺 上，并將一物鏡置于其上方，由氬離子激光器產(chǎn)生激發(fā)光經(jīng)濾波后通過物鏡聚焦到芯片表面， 激發(fā)熒光

30、標(biāo)記物產(chǎn)生熒光， 光斑半徑約為5- 10 g。同時(shí)通過同一物鏡收集熒光信號經(jīng)另一 濾波片濾波后，由冷卻的光電倍增管探測，經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換板轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號。通過計(jì)算機(jī)控制傳動平臺X- Y方向上步進(jìn)平移，DNA芯片被逐點(diǎn)照射，所采集熒光信號構(gòu)成雜交信號譜 型，送計(jì)算機(jī)分析處理，最后形成20 口象素的圖像。這種方法分辨率高、圖像質(zhì)量較好，適用于各種主要類型的 DNA芯片及大規(guī)模 DNA芯片雜交信號檢測， 廣泛使用于基因表達(dá)、 基因診斷等方面研究。(2) 激光掃描共焦顯微鏡激光掃描共焦顯微鏡和激光掃描 熒光顯微鏡 結(jié)構(gòu)非常相似，但是由于采用了共焦技術(shù)因 而更具優(yōu)越性。這種方法可以在熒光標(biāo)記分子和DNA芯片雜

31、交的同時(shí)進(jìn)行雜交信號的探測，而無須清洗掉未雜交分子，從而簡化了操作步驟大大提高了工作效率。Asymetrix公司的S. P . A . Forder等人設(shè)計(jì)的DNA芯片即利用此方法。其方法是將靶DNA分子溶液放在樣品地中，芯片上合成寡 核苷酸陣列的一面向下，和 樣品池溶液直接接觸，并和 DNA樣品 雜交。當(dāng)用激發(fā)光照射使熒光標(biāo)記物產(chǎn)生熒光時(shí)，既有芯片上雜交的DNA樣品所發(fā)出的熒光，也有樣品地中 DNA所發(fā)出的熒光，如何將兩者分離開來是一個(gè)非常重要的問題。而共 焦顯微鏡具有非常好的縱向分辨率，可以在接受芯片表面熒光信號的同時(shí)，避開樣品池中熒光信號的影響。一般采用氬離子激光器(488nm )作為激

32、發(fā)光源，經(jīng)物鏡聚焦，從芯片背面入射，聚集于芯片和靶分子溶液接觸面。雜交分子所發(fā)的熒光再經(jīng)同一物鏡收集，并經(jīng)濾波片濾波，被冷卻的光電倍增管 在光子計(jì)數(shù)的模式下接收。經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換反轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號送微機(jī)處理，成像分析。在光電信增管前放置一共焦小孔，用于阻擋大部分激發(fā)光焦平面以外的來自樣品池的未雜交分子熒光信號，避免其對探測結(jié)果的影響。激光器前也放置一個(gè)小孔 光闌以盡量縮小聚焦點(diǎn)處光斑半徑，使之能夠只照射在單個(gè)探針上。通過計(jì)算機(jī)控制激光束或樣品池的移動，便可實(shí)現(xiàn)對芯片的二維掃描，移動步長和芯片上寡 核苷酸的間距匹配，在幾分鐘至幾十分鐘內(nèi)即可獲得熒光標(biāo)記雜交信號圖譜。其特點(diǎn)是靈敏度和分辨率較高，掃描 時(shí)間

33、長，比較適合研究用?，F(xiàn)在Asymetrix公司已推出商業(yè)化樣機(jī)， 整套系統(tǒng)約12萬美元。（3）采用了 CCD相機(jī)的熒光顯微鏡這種探測裝置和以上的掃描方法都是基于熒光顯微鏡，但是以CCD相機(jī)作為信號接收器而不是 光電倍增管，因而無須掃描傳動平臺。由于不是逐點(diǎn)激發(fā)探測，因而激發(fā)光照射光場為整個(gè)芯片區(qū)域，由 CCD相機(jī)獲得整個(gè)DNA芯片的雜交譜型。這種方法一般不采用激 光器作為激發(fā)光源，由于激光束光強(qiáng)的高斯分布，會使得光場光強(qiáng)度分布不均，而熒光信號的強(qiáng)度和激發(fā)光的強(qiáng)度密切相關(guān)，因而不利于信號采集的線性響應(yīng)。為保證激發(fā)光勻場照射， 有的學(xué)者使用高壓汞燈經(jīng)濾波片濾波，通過傳統(tǒng)的光學(xué)物鏡將激發(fā)光投射到芯片

34、上，照明面積可通過更換物鏡來調(diào)整；也有的研究者使用大功率弧形探照燈作為光源，使用光纖維束和透鏡結(jié)合傳輸激發(fā)光，并和芯片表面呈50o角入射。由于采用了 CCD相機(jī)，因而大大提高了獲取熒光圖像的速度，曝光時(shí)間可縮短至零點(diǎn)幾秒至十幾秒。其特點(diǎn)是掃描時(shí)間短，靈敏度和分辨率較低，比較適合臨床診斷用14.（4）光纖傳感器有的研究者將 DNA芯片直接做在光纖維束的切面上（遠(yuǎn)端），光纖維束的另一端（近端）經(jīng)特制的耦合裝置耦合到 熒光顯微鏡 中。光纖維束由7根單模光纖組成。每根光纖的直 徑為200呵,兩端均經(jīng)化學(xué)方法拋光清潔?；瘜W(xué)方法合成的寡 核苷酸探針共價(jià)結(jié)合于每根光纖的遠(yuǎn)端組成寡核苷酸陣列。將光纖遠(yuǎn)端浸入到

35、熒光標(biāo)記的靶分子溶液中和靶分子雜交，通過光纖維束傳導(dǎo)來自 熒光顯微鏡的激光（490urn ）,激發(fā)熒光標(biāo)記物產(chǎn)生熒光，仍用光纖維 束傳導(dǎo)熒光信號返回到 熒光顯微鏡，由CCD相機(jī)接收。每根光纖單獨(dú)作用互不干擾，而溶 液中的熒光信號基本不會傳播到光纖中，雜交到光纖遠(yuǎn)端的靶分子可在 90 %的甲酸胺（formamide ）和TE緩沖液中浸泡10秒鐘去除，進(jìn)而反復(fù)使用。這種方法快速、便捷，可實(shí)時(shí) 檢測DNA微陣列雜交情況而且具有較高的靈敏度，但由于光纖維束所含光纖數(shù)目有限，因 而不便于制備大規(guī)模 DNA芯片，有一定的使用局限性。2.生物素標(biāo)記方法中的雜交信號探測以生物素(biotin )標(biāo)記樣品的方法

36、由來已久，通常都要聯(lián)合使用其它大分子和抗生物素的結(jié)合物(如結(jié)合化學(xué)發(fā)光底物酶、熒光素等)，再利用所結(jié)合大分子的特殊性質(zhì)得到最初的雜交信號，由于所選用的和抗生物素結(jié)合的分子種類繁多，因而檢測方法也更趨多樣化。特別是如果采用尼龍膜作為固相支持物，直接以熒光標(biāo)記的探針用于DNA芯片雜交將受到很大的限制，因?yàn)樵谀猃埬ど蠠晒鈽?biāo)記信號信噪比較低。因而使用尼龍膜作為固相支持物的這些研究者大多是采用生物素標(biāo)記的。目前使用較多的是美國 General Scanning公司開發(fā)的基因芯片專用檢測系統(tǒng)(SeanArray 3000)，采用激光共聚焦掃描原理進(jìn)行熒光信號采集，由計(jì)算機(jī)處理熒光信號，并對每個(gè)點(diǎn)的熒光強(qiáng)度

37、數(shù)字化后進(jìn)行分析。近期又開發(fā)出了Scan Array 5000 ,其掃描精度和功能有較大的提高。七結(jié)果的分析樣品在被測定前，首先要經(jīng)過消化，使待測組織細(xì)胞中的DNA或RNA釋放出來，在經(jīng)過適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增后，以熒光標(biāo)記物標(biāo)記，放入基因芯片自動孵育裝置(Fluidics Station )中，由其自動控制反應(yīng)的時(shí)間、溫度以及緩沖液的配比等反應(yīng)條件，進(jìn)行雜交，這一過程，僅需要數(shù)秒鐘。雜交完成后，要對基因芯片進(jìn)行讀片”即使用激光共聚焦熒光掃描顯微鏡，對基因芯片表面的每個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測。這種顯微鏡，將聚焦的平面設(shè)定為芯片的表面，因此可以檢測結(jié)合到芯片表面位點(diǎn)的樣品片斷的熒光標(biāo)記，而待測樣品中未和芯片上探針結(jié)合

38、的熒光標(biāo)記物，則懸浮于溶液中，由于不在聚焦平面上，因而不被檢測。樣品和探針的錯(cuò)配是影 響雜交反應(yīng)結(jié)果的重要因素，但由于樣品和芯片上的探針正確配對時(shí)產(chǎn)生的熒光信號要比錯(cuò) 配時(shí)強(qiáng)的多，因此，通過對信號強(qiáng)度的分析，就可以區(qū)分正確和錯(cuò)誤的配對。為了使結(jié)果的檢驗(yàn)更加簡便和快速，Affymetrix的基因芯片的分析系統(tǒng)中采用了基因陣列掃描儀和專用的基因芯片工作站，對一幅包含數(shù)萬個(gè)探針位點(diǎn)的基因芯片圖樣的分析，僅需要數(shù)分鐘的時(shí)間。這樣在短短的幾十分鐘至數(shù)小時(shí)內(nèi)，就可以完成用傳統(tǒng)方法需要數(shù)月才 能完成的幾萬乃至幾十萬次雜交分析試驗(yàn)。八基因芯片的使用（一）基因表達(dá)分析基因芯片具有高度的敏感性和特異性，它可以監(jiān)測

39、細(xì)胞中幾個(gè)至幾千個(gè)mRNA拷貝的轉(zhuǎn)錄情況。和用單探針分析 mRNA的點(diǎn)雜交技術(shù)不同，基因芯片表達(dá)探針陣列使用了大約20對寡核苷酸探針來監(jiān)測每一個(gè) mRNA的轉(zhuǎn)錄情況。每對探針中，包含一 個(gè)和所要監(jiān)測的 mRNA完全吻合和一個(gè)不完全吻合的探針（圖 2），這兩個(gè)探針的差別在于 其中間位置的核苷酸不同。這種成對的探針可以將非特異性雜交和背景訊號減小到最低的水 平，由此我們就可以確定那些低強(qiáng)度的mRNA。目前，Affymetrix公司已經(jīng)生產(chǎn)出 HugeneFL、Mu6500 （含有小鼠6 500個(gè)基因）、Ye6100 （含有酵母6 100個(gè)基因）等基因芯片 成品。1 分析基因表達(dá)時(shí)空特征。英國劍橋大

40、學(xué)Whitehead研究所的Frank C.P. Holstege等人，使用含有酵母基因組的基因芯片，深入研究了真核細(xì)胞基因組的調(diào)節(jié)周期。使用基因組水平的表達(dá)分析，監(jiān)測那些表達(dá)受轉(zhuǎn)錄起始機(jī)制的關(guān)鍵成分控制的基因，發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶II、主要的轉(zhuǎn)錄因子 TFIID和SAGA染色體修飾復(fù)合物等均在基因的表達(dá)中有自己特定的作 用位點(diǎn)15。通過本試驗(yàn)，研究人員揭示了：（ 1）基因特異性的轉(zhuǎn)錄因子對表達(dá)的調(diào)控作用。（2）細(xì)胞在缺乏營養(yǎng)的環(huán)境中，基因不同位點(diǎn)的協(xié)同調(diào)節(jié)作用的全新機(jī)制。（3 ）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的最終作用位點(diǎn)，在最初的幾步中就可以確定。以此試驗(yàn)為基礎(chǔ)，研究人員進(jìn)一步繪制 出了酵母基因組控制圖，并由此

41、分析出了各種調(diào)節(jié)因子在基因上不同的作用位點(diǎn)和其作用的 分子機(jī)制。美國Stanford大學(xué)的V.R.Iyer等人16，對成纖維細(xì)胞中和細(xì)胞增生和損傷修復(fù)有關(guān)的 基因進(jìn)行了分析。首先，他們用成纖維細(xì)胞中的8 600個(gè)基因片斷制成基因芯片的探針陣列，通過和mRNA反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA的雜交反應(yīng)，可以判斷出該基因的活性。在試驗(yàn)中，成纖維細(xì)胞被置于無營養(yǎng)的環(huán)境中，使絕大部分基因的活性關(guān)閉，兩天后，加入10%的血清，24小時(shí)內(nèi)，分6個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)，觀察基因的活化情況。試驗(yàn)結(jié)果表明，在所有被監(jiān)測的基因中，約有500個(gè)基因最為活躍，而使細(xì)胞保持不分裂狀態(tài)的基因活性被抑制。其中，最早被活化的是那些轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因。

42、在活化的基因中，有28個(gè)基因共同作用，控制細(xì)胞的增殖;8個(gè)和免疫反應(yīng)的激活有關(guān)；19個(gè)和血管重建有關(guān)；另有許多基因，和血管新生密切相關(guān)。在腫瘤細(xì)胞中，基因的表達(dá)和正常的細(xì)胞存在著明顯的差異。通過基因芯片繪出基因表達(dá)的時(shí)空圖譜，有助于人類認(rèn)識生命活動過程和特征。2基因差異表達(dá)檢測17生命活動中基因表達(dá)的改變是生物學(xué)研究的核心問題。理解人類基因組中10萬個(gè)不同的基因功能，監(jiān)測某些組織、細(xì)胞不同分化階段的差異基因表達(dá)(differential gene expression , DGE )十分重要。對差異表達(dá)的研究，可以推斷基因和基因的相互關(guān)系，細(xì)胞分化中基因開啟”或 關(guān)閉”的機(jī)制；揭示基因和疾病的

43、發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸的內(nèi)在聯(lián)系。目前 DGE研究方法主要有表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)測序、差減克隆(subtractive cloning )、差異顯示(differential display )、基因表達(dá)系歹U分析(serial analysis of gene expression, SAGE)。而cDNA微陣列雜交技術(shù)可監(jiān)測大量mRNA的轉(zhuǎn)錄，直接快速地檢測出極其微量的 mRNA，且易于同時(shí)監(jiān)測成千上萬的基因，是研究基因功能的重要手段之一。Rihn BH等利用基因芯片檢測胸膜間皮瘤和正常細(xì)胞間比較了6500個(gè)基因，發(fā)現(xiàn)了300多個(gè)差異基因的表達(dá)。其中幾個(gè)典型基因的表達(dá)經(jīng)RT-PCR進(jìn)行定量后

44、，可作為胸膜間皮瘤診斷的標(biāo)記物(Markers ) 18。Sgroi19報(bào)告DNA芯片結(jié)合激光捕獲顯微切割技術(shù)(I aser capture microdissection )用于乳癌浸潤期和轉(zhuǎn)移期及正常細(xì)胞的基因表達(dá)譜(geneexpression profiles )差異研究，結(jié)果被 定量PCR和免疫組化所證實(shí)。差異表達(dá)有助于早 期發(fā)現(xiàn)瘤細(xì)胞3萬個(gè)基因和正常細(xì)胞的區(qū)別，有助于了解瘤細(xì)胞的發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移和藥敏。 最近，美國毒物化學(xué)研究所(CIIT )和國家環(huán)境健康科學(xué)研究所( NIEHS )正計(jì)劃在一張玻片上建立8 700個(gè)小白鼠cDNA芯片，用于肝癌的研究。我國也已成功研制出能檢出410

45、00種基因表達(dá)譜的芯片。美國Stanford大學(xué)的David Botstein利用cDNA微陣列芯片，對乳腺癌細(xì)胞的基因表達(dá)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其基因表達(dá)水平明顯低于正常細(xì)胞。利用基因芯片對表達(dá)進(jìn)行分析，在一次試驗(yàn)中可以獲取相當(dāng)于在60余萬次傳統(tǒng)的Northern雜交中所獲得的關(guān)于基因表達(dá)的信息。通過這種實(shí)驗(yàn)方法，可以建立一種全新的腫瘤分類學(xué)方法，即依據(jù)每個(gè)腫瘤細(xì)胞中的基因表達(dá)情況對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分類?；蛐酒夹g(shù)在分析基因的表達(dá)中具有不可比擬的優(yōu)勢。3發(fā)現(xiàn)新基因Moch等利用腫瘤微陣列芯片（5 184個(gè)cDNA片段）發(fā)現(xiàn)了腎細(xì)胞癌的腫瘤標(biāo)志物基因，并于正常細(xì)胞進(jìn)行比較。在532份標(biāo)本中檢測到胞漿纖

46、維Vimentin的表達(dá)基因，陽性率為51%61%20。追蹤觀察，有 Vimentin表達(dá)的患者，預(yù)后極差。人類大量 ESTs給cDNA微陣列提供了豐富的資源，數(shù)據(jù)庫中400 000個(gè)ESTs代表了所有人類基因，成千上萬的ESTs微陣列將為人類基因表達(dá)研究提供強(qiáng)有力的分析工具。這將大大地加速人類基因組的功能分析21。定量檢測大量基因表達(dá)水平在闡述基因功能、探索疾病原因及機(jī)理、發(fā)現(xiàn)可能的診斷及治療靶等方面是很有價(jià)值的。如該技術(shù)在炎癥性疾病類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）和炎癥性腸?。↖BD）的基因表達(dá)研究中，由RA或IBD組織制備探針，用 Cy3和Cy5熒光素標(biāo)記，然后和靶cDNA微陣列雜交，可檢測出炎癥

47、疾病誘導(dǎo)的基因如TNF- a IL或粒細(xì)胞集落刺激因子，同時(shí)發(fā)現(xiàn)一些以前未發(fā)現(xiàn)的基因如HME基因和黑色素瘤生長刺激因子。Schena等人22報(bào)道了 cDNA的微陣列在人類基因表達(dá)監(jiān)測、生物學(xué)功能研究和基因發(fā)現(xiàn)方面的使用。采用含1,046個(gè)已知序列的cDNA微陣列，用高速機(jī)器人噴印在玻片上，用雙色雜交法定量監(jiān)測不同 基因表達(dá)，在一定的實(shí)驗(yàn)條件下，不同表達(dá)模式的陣列成分通過序列分析鑒定其特征。該方法較以往常用的方法敏感 10倍以上，檢測限度為1:500,000（wt/wt）總?cè)梭wmRNA。在培養(yǎng)T 細(xì)胞熱休克反應(yīng)的測定中，發(fā)現(xiàn)17個(gè)陣列成分的熒光比較明顯改變，其中11個(gè)受熱休克處理的誘導(dǎo)，6個(gè)呈現(xiàn)

48、中度抑制，對相應(yīng)于 17個(gè)陣列成分的cDNA測序發(fā)現(xiàn)5個(gè)表達(dá)最高的成 分是5種熱休克蛋白，17個(gè)克隆中發(fā)現(xiàn)3個(gè)新序列。另外，在佛波酯誘導(dǎo)檢測中23，發(fā)現(xiàn)有4種組織中檢測出15種熱休克和6個(gè)陣列成分信號增強(qiáng)超過 2倍，測序及數(shù)據(jù)庫比較揭示有 5個(gè)已知的，誘導(dǎo)表達(dá)最高的兩個(gè) 是PCA-1酪氨酸磷酸酶和核因子-啟1 ,有一個(gè)是未知的。 這4個(gè)新基因的表達(dá)水平均相對較 低，僅呈現(xiàn)2倍的誘導(dǎo)。Northern雜交結(jié)果證實(shí)了微陣列的結(jié)果。進(jìn)一步檢測了人的骨髓、 腦、前列腺及心臟組織中熱休克和佛波酯調(diào)節(jié)基因的表達(dá),佛波酯調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，其表達(dá)水平和Jurkat細(xì)胞中相應(yīng)成分的表達(dá)水平密切相關(guān)如在四種組織中表

49、達(dá)水平最高的兩個(gè)基因3-actin和細(xì)胞色素C氧化酶在Jurkat細(xì)胞中的表達(dá)水平也很高。上述實(shí)驗(yàn)提示在缺乏任何序列信息的條件下，微陣列可用于基因發(fā)現(xiàn)和基因表達(dá)檢測。目前，大量人類 ESTs給cDNA微陣列提供了豐富的資源，數(shù)據(jù)庫中400,000個(gè)ESTs代表了所有人類基因，成千上萬的ESTs微陣列將為人類基因表達(dá)研究提供強(qiáng)有力的分析工 具。這將大大地加速人類基因組的功能分析。4大規(guī)模DNA測序人類基因組計(jì)劃的實(shí)施促進(jìn)了高效的、自動化操作的測序方法的發(fā)展。芯片技術(shù)中雜交測序(sequencing by hybridization, SBH )技術(shù)及鄰堆雜交(contiguous stackin

50、g hybridization, CSH )技術(shù)即是一種新的高效快速測序方法24-26。用含65 536個(gè)8聚寡核苷酸的微陣列，采用 SBH技術(shù)，可測定200 bp長DNA序列，采用67 1 08 864個(gè)13聚寡核苷酸的微陣列，可對數(shù)千個(gè)堿基長的DNA測序。SBH技術(shù)的效率隨著微陣列中寡核苷酸數(shù)量和長度的增加而提高，但微陣列中寡核苷酸數(shù)量和長度的增加則提高 了微陣列的復(fù)雜性，降低了雜交準(zhǔn)確性。CSH技術(shù)彌補(bǔ)了 SBH技術(shù)存在的弊端，CSH技術(shù)的使用增加了微陣列中寡 核苷酸的有效長度，加強(qiáng)了序列準(zhǔn)確性，可進(jìn)行較長的DNA測序。計(jì)算機(jī)模擬論證了 8聚寡核苷酸微陣列和5聚寡核苷酸鄰堆雜交，相當(dāng)于1

51、3聚寡核苷酸 微陣列的作用，可測定數(shù)千個(gè)核苷酸長的DNA序列26。Dubiley等人26將合成的10聚寡核苷酸固定于排列在載片表面的 0.1 >0.1 X0.02mm或1 X1 X0.02mm聚丙酰胺凝膠墊上制備聚 寡核苷酸微陣列，先用分離微陣列(fractionation chips )進(jìn)行單鏈DNA分離，再用測序微 陣列(sequencing chips )分析序列，后者聯(lián)合采用了10聚寡核苷酸微陣列的酶促磷酸化、DNA雜交及和鄰堆的5聚寡核苷酸連接等技術(shù)。該方法可用于含重復(fù)序列及較長序列的DNA序列測定及不同基因組同源區(qū)域的序列比較。利用基因芯片測序的準(zhǔn)確率達(dá)99%以上。正如NIH

52、首腦Harold Varmus在美國細(xì)胞生物學(xué)1998年年會上所說：在基因芯片的幫助下，我們將能夠監(jiān)測一個(gè)細(xì)胞乃至整個(gè)組織中所有基因的行為?！?二) 基因型、基因突變和多態(tài)性分析性狀和多種遺傳性疾病有著密切的關(guān)系。通過對大量具有不同性狀的個(gè)體的基因型進(jìn)行比 較，就可以得出基因和性狀的關(guān)系。但是，由于大多數(shù)性狀和遺傳性疾病是由多個(gè)基因同時(shí)決定的，因此分析起來就十分困難，然而基因芯片技術(shù)恰恰解決了這一問題，利用其可以同時(shí)反應(yīng)數(shù)千甚至更多個(gè)基因的特性，我們就可以分析基因組中不同基因和性狀或疾病的關(guān)系。美國Stanford大學(xué)的E.A.Winzeler等27，以兩種不同菌株的酵母（S96和YJM789

53、）作為實(shí)驗(yàn)材料，對控制酵母對放線菌酮的抗藥性的基因進(jìn)行分析。將含有酵母150 000個(gè)DNA片斷的基因芯片分別和這兩株酵母活化轉(zhuǎn)錄的mRNA分子雜交，S96幾乎全部吻合，而YJM789和芯片上的探針組存在較大的差異，約有3000個(gè)位點(diǎn)沒有雜交顯色。由于S96對放線菌酮有抗藥性而 YJM789的抗藥性則弱的多，因此可以判定控制這一抗藥性的基因的所 在。而后，通過對 S96和YJM789雜交后產(chǎn)生的抗藥子代的遺傳標(biāo)記的分析，進(jìn)一步確定， 控制該抗藥性的基因位于 15號染色體，是一長約57 000個(gè)堿基的片斷。美國國家人類基因 組研究室的J.G.Hacia等在Fodor研究小組的協(xié)助下28，將基因芯

54、片使用于雙色突變分析。 他們的分析對象是和人類遺傳性乳腺癌和卵巢癌密切相關(guān)的BRCA1基因的外顯子11。在擴(kuò)增后，將BRCA1基因的外顯子11置于含有熒光素-12-UTP的環(huán)境中進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，而 后將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的 mRNA和BRCA1外顯子11芯片雜交，4小時(shí)后，用藻紅蛋白染色。在觀察 時(shí)，用488nm的氬離子激光進(jìn)行掃描，熒光染色位點(diǎn)呈現(xiàn)綠色，而藻紅蛋白染色的位點(diǎn)呈 現(xiàn)紅色。使用雙色分析，可以更為清楚的監(jiān)測未知樣品和標(biāo)準(zhǔn)鏈之間的競爭性雜交情況，進(jìn)而分析該基因中的不同突變。通過對15名患者BRCA1基因的觀察，有14名患者在外顯子11位點(diǎn)存在不同的突變。Hacia等：29在1.28 cm X

55、1.28 cm的芯片上固定了 9.66 X104個(gè)長度為20 nt的寡核苷酸探針，用于檢測乳腺癌基因BRCA1的exon11 （3.45 kb）中所有可能的堿基置換、插入和缺失（15 bp）突變。針對每一個(gè)位點(diǎn)，共有 28個(gè)獨(dú)立的探針，14個(gè)針對 有義鏈，14個(gè)針對反義鏈。14個(gè)探針包括2個(gè)野生型，3個(gè)堿基置換、4個(gè)插入突變、5個(gè)堿 基缺失。在15例患者樣品中，發(fā)現(xiàn)有14例有基因突變，類型包括點(diǎn)突變、插入及缺失等；在20例對照樣品中均未檢出假陽性結(jié)果，結(jié)果表明DNA芯片技術(shù)可快速、準(zhǔn)確地研究大量患者樣品中特定基因所有可能的雜合變。Cronin等：30：分別用兩種DNA芯片檢測囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)（CFTR）的突變，其中一個(gè)芯片包含1 480個(gè)探針，檢測了 CFTR基因的第1 0和11外顯子的已知突變，包括缺失、插入和單堿基置換，并分析了10個(gè)未知樣品的 CFTR基因，其結(jié)果和 PCR-RELP的分析結(jié)果完全一致。Guo等人31利用結(jié)合在玻璃支持物上的等位基因特異性寡核苷酸（ASOs）微陣列建立了簡單快速的基因多態(tài)性分析方法。將ASOs共價(jià)固定于玻璃載片上，采用PCR擴(kuò)增基因組DNA，其一條引物用熒光素標(biāo)記，另一條引物用生物素標(biāo)記，分離兩條互補(bǔ)的DNA鏈，將熒光素標(biāo)記DNA鏈和微陣列雜交，通過