生化實(shí)驗(yàn)思考題參考答案

1、生化實(shí)驗(yàn)講義思考題參考答案實(shí)驗(yàn)一 淀粉的提取和水解1、實(shí)驗(yàn)材料的選擇依據(jù)是什么？答：生化實(shí)驗(yàn)的材料選擇原則是含量高、來源豐富、制備工藝簡(jiǎn)單、成本低。從科研工作的角度選材，還應(yīng)當(dāng)注意具體的情況，如植物的季節(jié)性、地理位置和生長(zhǎng)環(huán)境等，動(dòng)物材料要注意其年齡、性別、營(yíng)養(yǎng)狀況、遺傳素質(zhì)和生理狀態(tài)等，微生物材料要注意菌種的代數(shù)和培養(yǎng)基成分的差異等。2、材料的破碎方法有哪些？答：(1) 機(jī)械的方法： 包括研磨法、組織搗碎法； (2) 物理法：包括凍融法、超聲波處理法、壓榨法、冷然交替法等； (3) 化學(xué)與生物化學(xué)方法：包括溶脹法、酶解法、有機(jī)溶劑處理法等。實(shí)驗(yàn)二 總糖與還原糖的測(cè)定1、堿性銅試劑法測(cè)定還原糖

2、是直接滴定還是間接滴定？?jī)煞N滴定方法各有何優(yōu)缺點(diǎn)？答: 我們采用的是堿性銅試劑法中的間接法測(cè)定還原糖的含量。間接法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)條件溫和，缺點(diǎn)是在生成單質(zhì)碘和轉(zhuǎn)移反應(yīng)產(chǎn)物的過程中容易引入誤差；直接法的優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)原理直觀易懂，缺點(diǎn)是操作較復(fù)雜，條件劇烈，不易控制。實(shí)驗(yàn)五 粗脂肪的定量測(cè)定索氏提取法（1）本實(shí)驗(yàn)制備得到的是粗脂肪，若要制備單一組分的脂類成分，可用什么方法進(jìn)一步處理？答：硅膠柱層析，高效液相色譜，氣相色譜等。（2）本實(shí)驗(yàn)樣品制備時(shí)烘干為什么要避免過熱?答：防止脂質(zhì)被氧化。實(shí)驗(yàn)六 蛋白質(zhì)等電點(diǎn)測(cè)定1、在分離蛋白質(zhì)的時(shí)候，等電點(diǎn)有何實(shí)際應(yīng)用價(jià)值？答: 在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子與分子

3、間因碰撞而引起聚沉的傾向增加，所以處于等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)最容易沉淀。在分離蛋白質(zhì)的時(shí)候，可以根據(jù)待分離的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，有目的地調(diào)節(jié)溶液的pH使該蛋白質(zhì)沉淀下來，從而與其他處于溶液狀態(tài)的雜質(zhì)蛋白質(zhì)分離。實(shí)驗(yàn)七 氨基酸的分離鑒定紙層析法1、如何用紙層析對(duì)氨基酸進(jìn)行定性和定量的測(cè)定？答: 將標(biāo)準(zhǔn)的已知氨基酸與待測(cè)的未知氨基酸在同一張層析紙上進(jìn)行紙層析，顯色后根據(jù)斑點(diǎn)的Rf值，就可以對(duì)氨基酸進(jìn)行初步的定性，因?yàn)橥粋€(gè)物質(zhì)在同一條件下有相同的Rf值；將點(diǎn)樣的未知氨基酸溶液和標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液的體積恒定，根據(jù)顯色后的氨基酸斑點(diǎn)的面積與點(diǎn)樣的氨基酸質(zhì)量成正比的原理，通過計(jì)算斑點(diǎn)的面積可以對(duì)氨基酸溶液進(jìn)行定量測(cè)定。

4、3、紙層析、柱層析、薄層層析、高效液相層析各有什么特點(diǎn)？答:  支持介質(zhì)層析原理層析方向上樣量分離效率紙層析濾紙分配上行（多）或下行小低薄層層析玻璃板或塑料板分配、吸附上行較大較高柱層析玻璃柱分配、吸附、離子交換、分子篩、親和層析等下行可小可大較高高效液相層析不銹鋼柱分配、吸附-可小可大高實(shí)驗(yàn)八 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定(1) 簡(jiǎn)述紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理及優(yōu)點(diǎn)。答：原理：由于蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)具有吸收紫外線的性質(zhì)，吸收高峰在280 nm波長(zhǎng)處。在此波長(zhǎng)范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值（OD280）與其含量呈正比關(guān)系，可用作定量測(cè)定。優(yōu)點(diǎn)：迅速

5、、簡(jiǎn)便、不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測(cè)定。實(shí)驗(yàn)十 影響酶活性的因素（1）本實(shí)驗(yàn)中如何通過淀粉液加碘后的顏色的變化來判斷酶促反應(yīng)快慢的？答：在唾液淀粉酶的作用下，淀粉水解，經(jīng)過一系列被稱為糊精的中間產(chǎn)物，最后生成麥芽糖和葡萄糖。變化過程如下：淀粉紫色糊精紅色糊精麥牙糖、葡萄糖淀粉、紫色糊精、紅色糊精遇碘后分別呈藍(lán)色、紫色與紅色。麥芽糖和葡萄糖遇碘不變色。因此反應(yīng)后顏色如為藍(lán)色說明酶活力低，淡黃色則說明酶活力高。（2）如何通過加入班氏試劑后生成沉淀多少來反映酶促反應(yīng)快慢的？答：淀粉與糊精無還原性，或還原性很弱，對(duì)本尼迪克特試劑呈陰性反應(yīng)。麥芽糖、葡萄糖是還原糖，與本尼迪克特試劑共熱后生成紅棕色氧化

6、亞銅的沉淀。因此，產(chǎn)生紅棕色氧化亞銅的沉淀越多說明酶活力越高。（3）通過本實(shí)驗(yàn)，結(jié)合理論課的學(xué)習(xí)，小結(jié)出哪些因素影響唾液淀粉酶活性？是如何影響的？答：溫度、pH、激活劑、抑制劑等。高于或低于最適溫度或pH，酶活力都會(huì)降低；激活劑和抑制劑不是絕對(duì)的，只是相對(duì)而言，隨著濃度的變化而變化。實(shí)驗(yàn)十二 堿性磷酸酶的分離提取及比活力的測(cè)定(1) 試說明用硫酸銨分級(jí)分離酶的方法及應(yīng)注意的事件。答：用鹽分級(jí)沉淀是一種應(yīng)用非常廣泛的方法。由于硫酸銨在水中溶解度很大（20，每升可溶760克），并且對(duì)許多酶沒有很大的影響，因此它是最常用的鹽。例如：某酶（或蛋白質(zhì)）發(fā)生鹽析的范圍為35-65%飽和硫酸銨的濃度，因此可

7、先選擇30%飽和硫酸銨濃度，去沉淀雜蛋白，然后選擇70%飽和硫濃度酸銨，留沉淀（含所要的酶）。注意事項(xiàng)：在用硫酸銨沉淀酶蛋白時(shí)，要注意緩沖液的pH值和溫度，鹽的溶解度隨溫度不同而有較大的變化，同時(shí)酶的溶解度亦隨溫度的改變而改變。在加硫酸銨時(shí)，需事先將硫酸銨粉末研細(xì)。加入過程需緩慢并及時(shí)攪拌溶解。攪拌要緩慢，盡量防止泡沫的形成，以免酶蛋白在溶液中表面變性。(2) 用正丁醇處理勻漿液可以有效地使堿性磷酸酶酶蛋白釋放，使酶的產(chǎn)量大大提高，這是為什么？答：因?yàn)閴A性磷酸酶酶是一種膜蛋白，正丁醇處理后可使結(jié)合在膜上的蛋白質(zhì)更多地釋放出來。(3) 酶活力測(cè)定時(shí)，為什么必需先將酶液對(duì)緩沖液透析后才測(cè)定？答：去

8、除鹽離子的影響。實(shí)驗(yàn)十三 凝膠過濾層析純化堿性磷酸酶1. 在本實(shí)驗(yàn)中要注意哪些重要環(huán)節(jié)？答：1） 注意區(qū)分柱子的上下端。2） 各接頭不能漏氣，連接用的小乳膠管不要有破損，否則造成漏氣、漏液。3） 裝柱要均勻，既不過松，也不過緊，最好在要求的操作壓下裝柱，流速不宜過快，避免因此凝膠。4） 始終保持柱內(nèi)液面高于凝膠表面，否則水分蒸發(fā)，凝膠變干。也要防止液體流干，使凝膠混入大量氣泡，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)。5） 核酸蛋白檢測(cè)儀，記錄儀，部分收集器要正確連接。6） 要控制一定流速。7） 收集得到的液體要進(jìn)行酶活力的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)十四 底物濃度對(duì)酶活力的影響（米氏常數(shù)的測(cè)定）1. 在測(cè)定酶催化反應(yīng)的米氏常數(shù)K

9、m和最大反應(yīng)速度Vm時(shí)，應(yīng)如何選擇底物濃度范圍？答：底物濃度選擇范圍 S»0.2-5.0 Km為宜。底物濃度選取還應(yīng)該注意其倒數(shù)能均勻分布。1/v 1/v 0 1/S 0 1/S 底物濃度太大 底物濃度太小2. 試說明米氏常數(shù)Km的物理意義和生物學(xué)意義。答： (1) Km是酶的一個(gè)極重要的動(dòng)力學(xué)特征常數(shù)， Km物理含義：ES絡(luò)合物消失速度常數(shù)與形成速度常數(shù)之比；其數(shù)值相當(dāng)于酶活性部位的一半被底物占據(jù)時(shí)所需的底物濃度。(2) 可根據(jù)Km估計(jì)底物濃度的水平。(3) Km可作為同工酶的判斷依據(jù)。(4) 鑒別最適底物。(5) 有助于在酶學(xué)研究中對(duì)底物濃度的選擇。選用S>10Km濃度進(jìn)行

10、活力測(cè)定 3. 為什么說米氏常數(shù)Km是酶的一個(gè)特征常數(shù)而Vm則不是？答：某種酶的Km在給定的體系中不隨酶濃度改變而改變，也與酶的純度無關(guān)，因此是酶的一個(gè)特征常數(shù)。但Vm隨酶濃度改變而改變。實(shí)驗(yàn)十七 SDS-PAGE電泳(1) 簡(jiǎn)述SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定分子量的原理;答：1）SDS能使蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，形成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物。 2）SDS帶有大量負(fù)電荷，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異，使SDS與蛋白質(zhì)的復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷。 3）SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在水溶液中的形狀一樣，都是近似于雪茄煙形的長(zhǎng)橢圓棒。 4）不同的SDS-

11、蛋白質(zhì)復(fù)合物都帶有相同密度的負(fù)電荷，并具有相同形狀；因此在一定濃度的凝膠中，由于分子篩效應(yīng)，則電泳遷移率就成為蛋白質(zhì)分子量的函數(shù)。(2) 是否所有的蛋白質(zhì)用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳方法測(cè)定得到的分子量都完全可靠？答：不是。 如電荷異常或構(gòu)象異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（如某些糖蛋白）以及一些結(jié)構(gòu)蛋白如膠原蛋白等。 例如組蛋白F1，它本身帶有大量正電荷，因此，盡管結(jié)合了正常比例的SDS，仍不能完全掩蓋其原有正電荷的影響，它的分子量是21,000，但SDS-凝膠電泳測(cè)定的結(jié)果卻是35,000。實(shí)驗(yàn)十八 維生素C的定量測(cè)定（1）簡(jiǎn)述本法測(cè)定VC的利與弊。答：碘量法測(cè)定VC相比其它方法傳統(tǒng)的碘滴定法迅速、簡(jiǎn)捷，但易受到待測(cè)物顏色干擾而不易判斷滴定終點(diǎn)；只能測(cè)定待測(cè)溶液還原型的Vc含量，如果溶