微生物發(fā)酵飼料中乳酸含量的測定方法比較分析

1、微生物發(fā)酵飼料中乳酸含量的測定方法比較分析摘 要：通過比較分析羥基聯(lián)苯比色法、EDTA定鈣法、乳酸脫氫酶法3種檢測方法的準確性、簡便性、經濟性，找到適合于測定微生物發(fā)酵飼料中乳酸含量的方法。試驗結果表明，乳酸脫氫酶法檢測的準確性最好、迅速，但成本高；EDTA定鈣法檢測雖然簡便、迅速，但準確性最差；羥基聯(lián)苯比色法檢測效果居中，較為準確和方便。因此，乳酸脫氫酶法適合于高精度、高效率的檢測；EDTA定鈣法適合于迅速簡便、精度要求不高的檢測；羥基聯(lián)苯比色法可作為企業(yè)或科研單位精度要求不高的常規(guī)檢測。關鍵詞：發(fā)酵飼料；乳酸；羥基聯(lián)苯比色法；EDTA定鈣法；乳酸脫氫酶法Comparative Analys

2、is of Analytical Methods of Lactic AcidContent in Microbial Fermentation FeedsAbstract:To find a method that was used to measure the lactic acid content in microbial fermentation feeds,the accuracy, convenient and economy of hydroxybiphenol colorimetry method, EDTA titration method and lactic acid d

3、ehydrogenase method were contrasted in this study. The results showed that the accuracy of the test result wasbest and rapid using the lactic acid dehydrogenase method, but the cost was higher. The test of EDTA titration method was simple and rapid, but the accuracy was worst. The test results of hy

4、droxybiphenol colorimetry method waspreferably, the methods had good specificity and convenient. Consequently, lactic acid dehydrogenase method wasfit for the tests require high precision and high efficiency. The EDTA titration method was fit for the tests requiresimple and rapid, but the accuracy d

5、idn t ask for much. The hydroxybiphenol colorimetry method was used for routine undemanding accuracy test result in enterprise or institutes of scientific research.Key words:microbialfermentationfeeds;lacticacid;hydroxybiphenolcolorimetrymethod;EDTAtitrationmethod;lacticaciddehydrogenasemethod收稿日期：2

6、012-03-22基金項目：龍巖市科技計劃重點項目（2011LY18）作者簡介：羅建（1962），男，福建龍巖人，碩士，研究方向為飼料的研發(fā)、生產與應用。*通訊作者：教授，碩士生導師，E-mail：Lyyxy1988。37飼料博覽 2012年第5期檢測分析微生物發(fā)酵飼料的生產與應用是近年來飼料工業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)最熱門的話題之一。隨著人民生活水平的不斷提高和環(huán)境資源的日益惡化，利用農副產品和輕工副產物生產高質量、無污染的微生物發(fā)酵飼料已成為緩解飼料資源短缺、提高畜禽產品品質、減少畜產品藥物抗生素殘留的重要手段 1 。微生物發(fā)酵飼料的生產菌種主要有乳酸菌、酵母菌和芽孢菌，其中乳酸菌包括發(fā)酵乳桿菌、嗜酸乳

7、桿菌和糞腸球菌3種 2 。乳酸菌是發(fā)酵的主角，其在厭氧條件下大量繁殖占支配地位時產生大量的乳酸，抑制其他不良微生物的生長繁殖，從而制成了優(yōu)質的微生物發(fā)酵飼料 3 。因此，發(fā)酵飼料中乳酸含量的高低是判斷微生物發(fā)酵飼料品質優(yōu)劣的一個重要指標。目前，乳酸含量的測定方法主要有羥基聯(lián)苯比色法、EDTA定鈣法、高效液相色譜法（HPLC）、酶法等，均有各自的適用范圍和優(yōu)缺點 4-7 。本文通過比較分析微生物發(fā)酵飼料中不同乳酸測定方法，以期得到適合于中小型飼料廠或科研單位快速、簡便檢測產品乳酸含量的方法。1 材料與方法1.1 試驗材料微生物發(fā)酵飼料由福建省龍巖市金和動物飼料有限公司提供。在規(guī)定的發(fā)酵時間內發(fā)酵

8、完成后取樣品1g，測定其乳酸含量。1.2 乳酸測定方法1.2.1羥基聯(lián)苯比色法標準曲線的繪制：分別配置乳酸標準液1、2、3、4、5、6 g·mL-1，在比色管中分別加入乳酸標準液1 mL、4.0%硫酸銅溶液0.05 mL，再加入濃硫酸6 mL，反應5 min，冷卻至20 以下后，再分別于各比色管中加入1%堿溶性羥基聯(lián)苯溶液0.05 mL，混合均勻，在室溫下放置68 h，過夜，在570 nm下進行比色測定，繪制出標準曲線 8 。樣品測定：1 g發(fā)酵飼料溶解于100 mL蒸餾水中，4 000 rpm離心10 min，取上清液1 mL，按標準曲線測定樣品中乳酸含量（%）。1.2.2 EDT

9、A定鈣法稱取樣品1 g（準確至0.0002 g）于100 mL杯中，加水80 mL，在電爐上加熱至近沸，繼續(xù)加熱5 min（溶液不要溢出），冷卻，定容至100 mL，待溶液澄清后（或過濾），吸取上清液（濾液）10 mL于錐形瓶中，加三乙醇胺10 mL、蒸餾水50 mL、200 g·L-1氫氧化鈉溶液10 mL、鹽酸羥胺0.5 g搖勻后，再加鈣混合指示劑少許，立即用EDTA標準溶液0.05 moL·L-1滴定，溶液呈現(xiàn)純藍色為滴定終點。乳酸的測定結果計算公式見式（1）。乳酸濃度（g·L-1）= 90.08×C×V（1）式中，V為滴定所消耗EDTA

10、溶液體積（mL）；C為EDTA濃度（moL·L-1）；90.08為乳酸的摩爾質量。為便于與其他方法測定結果比較，乳酸的測定結果最終轉換成每克飼料乳酸含量（%）。1.2.3乳酸脫氫酶法酶法測定乳酸含量操作步驟見表1。酶法乳酸檢測試劑盒購自南京建成生物工程有限公司，按照其使用說明，預先配置好酶工作液和反應顯色劑（標準液和終止液試劑盒中已配好，直接使用）。取飼料樣品1g溶解于50 mL蒸餾水中，4 000 rpm離心10 min，取上清液待測，蒸餾水調零，測定波長為530 nm。測定結果計算公式見式（2）。式中，C為樣品濃度mmoL·L-1；50為樣品稀釋倍數(shù)。同理，乳酸的測定結

11、果最終轉換成每克飼料乳酸含量（%）。2 結果與分析2.13種方法測定發(fā)酵飼料乳酸含量分別采用羥基聯(lián)苯比色法、EDTA定鈣法、乳酸脫氫酶法測3種方法對同一發(fā)酵批次的微生物發(fā)酵飼料進行測定，取樣3批、每批重復3次，進行統(tǒng)計學分析，結果見表2。試 劑蒸餾水3 mmoL·L-1標準液樣本酶工作液顯色劑混勻，37 水浴準確反應10 min終止液加樣管空白管0.0210.22標準管0.0210.22測定管0.0210.22表1 酶法測定乳酸含量操作步驟mL乳酸濃度（mmoL·L-1）=（2）382012年第5期 飼料博覽檢測分析由表2可知，同一批次間和不同批次間檢測，平均誤差最小的方法

12、是乳酸脫氫酶法，最差的是EDTA定鈣法；對于同一批次檢測結果，羥基聯(lián)苯比色法和乳酸脫氫酶法檢測結果差異不顯著（P>0.05），而與EDTA定鈣法差異顯著（P<0.05）。2.23種方法測定發(fā)酵飼料乳酸含量應用性分析3種方法測定發(fā)酵飼料乳酸含量應用分析結果見表3。由表3可知，3種方法中，乳酸脫氫酶法檢測的準確性最好，操作也最為簡便，且檢測時間也最短，但成本較為昂貴；EDTA定鈣法雖然操作簡便，檢測時間也不太長，但檢測準確性最差，誤差較大，結果較不可靠；羥基聯(lián)苯比色法檢測效果處于另外兩個方法之間，檢測較為準確和方便。3 討 論發(fā)酵飼料中乳酸含量的高低是判斷其產品品質優(yōu)劣的一個非常重要指

13、標，但目前我國對飼料中乳酸含量的測定方法報道較少。本文探討了3種檢測發(fā)酵飼料中乳酸含量的方法，結果表明，乳酸脫氫酶法檢測的準確性最好、迅速，但成本較高，該方法適用于某特定時期抽檢樣品，需迅速得到準確結果的場合；EDTA定鈣法檢測的準確性最差，但操作簡便、迅速，只適用于只需得到檢測樣品乳酸含量大概數(shù)值的場合；羥基聯(lián)苯比色法檢測效果居中，可作為企業(yè)或科研單位精度要求不高的常規(guī)檢測發(fā)酵飼料樣品中乳酸含量的一種方法。發(fā)酵液中乳酸含量的測定方法還有HPLC法、生物傳感器法等。這兩種方法檢測結果可靠、快捷迅速、專業(yè)性強，并可同時檢測產品中其他物質（如有機酸、葡萄糖等）的含量。樊永紅試驗結果表明，在同一發(fā)酵

14、批次的乳酸含量測試中，EDTA定鈣法與HPLC法、生物傳感儀法有顯著差異（P<0.05），而HPLC法與生物傳感儀法無顯著性差異（P>0.05）；EDTA定鈣法簡便快速，但重復性差；HPLC法準確、靈敏；生物傳感儀測定法比較準確和方便 9 。如發(fā)酵飼料生產企業(yè)有財力購置相關的設備，此方法也可作為微生物發(fā)酵飼料中乳酸含量的檢測方法，檢測結果可能更為真實可靠。 參 考 文 獻 1 陸文清.發(fā)酵飼料生產與應用技術M.北京:中國輕工業(yè)出版社, 2011. 2 林標聲,羅建,戴愛玲,等.微生物發(fā)酵飼料對斷奶仔豬生長性能的影響J.安徽農業(yè)科學, 2010, 38（5）: 2 378-2 380

15、. 3 余伯良.發(fā)酵飼料生產與應用新技術M.北京:中國農業(yè)出版社, 1999. 4 高慶,印建和,穆華容,等.對羥基聯(lián)苯法測定啤酒中乳酸J.釀酒, 2005（6）: 93-95. 5 鄭志,姜紹通,潘麗軍. EDTA定鈣法測定發(fā)酵液中乳酸含量的探討J.食品科學, 2003, 24（3）: 102-105. 6 白冬梅,班睿,趙學明,等.反相高效液相色譜法測定米根霉乳酸發(fā)酵液中的乳酸J.色譜, 2000, 18（6）: 527-528. 7 柳暢先,度潯,吳士鈞.酶法測定乳酸J.分析試驗室, 2005, 24（9）: 75-77. 8 梁瓊,魯明波,盧正東,等.對羥基聯(lián)苯法定量測定發(fā)酵液中的乳酸J.食品科學, 2008, 29（6）: 357-360. 9 樊永紅,王麗,柳丹,等.米根霉發(fā)酵液中乳酸含量的測定方法研究J.生物技術, 2007, 17（1）: 54-55.注：同列數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05），肩標不同大寫字母者表示差異極顯著（P<0.01），肩標相同寫字母或不標注者表示差異不顯著（P>0.05）。提取方法羥基聯(lián)苯比色法EDTA定鈣法乳酸脫氫酶法準確性較好較差最好成本居中便宜昂貴操作繁簡較繁瑣簡便簡便檢測時間較長適中很短