RT-PCR操作流程及其相關(guān)注意事項(xiàng)

1、一、知識(shí)背景：1、基因表達(dá)：DNA RNA Protein2、PCR技術(shù)(Polymerase chain reaction)：即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在模板、引物和四種脫氧核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)，其特異性由兩個(gè)人工合成的引物序列決定。反應(yīng)分三步：A、變性：通過(guò)加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA；B、退火：將反應(yīng)混合液冷卻至某一溫度，使引物與模板結(jié)合。C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2存在下，退火引物沿5 3方向延伸。以上三步為一個(gè)循環(huán)，如此反復(fù)。3、逆轉(zhuǎn)錄酶和RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒體內(nèi)的依賴R

2、NA的DNA聚合酶，至少具有以下三種活性：1、依賴RNA的DNA聚合酶活性：以RNA為模板合成cDNA第一條鏈；2、Rnase水解活性：水解RNA:DNA雜合體中的RNA；3、依賴DNA的DNA聚合酶活性：以第一條DNA鏈為模板合成互補(bǔ)的雙鏈cDNA.4、引物的設(shè)計(jì)及其原則：引物的特異性決定PCR反應(yīng)特異性。盡量選擇覆蓋相連兩個(gè)內(nèi)含子的引物，或者在目的蛋白表達(dá)過(guò)程中特異存在而在其他亞型中不存在的內(nèi)含子。a、引物長(zhǎng)度:一般為1530bp ，引物太短會(huì)影響PCR的特異性，引物太長(zhǎng)PCR的最適延伸溫度會(huì)超過(guò)Taq酶的最適溫度，也影響反應(yīng)的特異性。b、堿基分布：四種堿基最好應(yīng)隨機(jī)分布，避免嘌呤或嘧啶的

3、聚集存在，特別是連續(xù)出現(xiàn)3個(gè)以上的單一堿基。GC含量（Tm值）：4060，PCR擴(kuò)增的復(fù)性溫度一般是較低Tm值減去510度。c、 3端要求：3端必須與模板嚴(yán)格互補(bǔ)，不能進(jìn)行任何修飾，也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能。末位堿基是A時(shí)錯(cuò)配的引發(fā)效率最低，G、C居中間，因此引物的3端最好選用A、G、C而盡可能避免連續(xù)出現(xiàn)兩個(gè)以上的T。d、引物自身二級(jí)結(jié)構(gòu)：引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則會(huì)自身折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)或引物自身復(fù)性。e、引物之間的二級(jí)結(jié)構(gòu)：兩引物之間不應(yīng)有多于4個(gè)連續(xù)堿基互補(bǔ)，3端不應(yīng)超過(guò)2個(gè)。f、同源序列：引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性應(yīng)小于連續(xù)8個(gè)的互補(bǔ)堿基存在。g、5端無(wú)嚴(yán)格限制：5末端堿基

4、可以游離，但最好是G或C，使PCR產(chǎn)物的末端結(jié)合穩(wěn)定。還可以進(jìn)行特異修飾（標(biāo)記、酶切位點(diǎn)等）等等。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇適當(dāng)?shù)囊?。常用引物設(shè)計(jì)軟件如Primer5.0，Oligo6.0等對(duì)于這些條件都可以自行設(shè)置。RNA提?。ㄓ肨rizol法提取）注意事項(xiàng)：1、整個(gè)操作過(guò)程中總是帶著帽子、口罩和手套2、整個(gè)RT-PCR過(guò)程均必須使用無(wú)菌無(wú)RNA酶的制品（玻璃物品和飯盒需在180烤箱烘烤10h，注意烘烤時(shí)最好是早上開(kāi)180烤箱，晚上到時(shí)間后一定要關(guān)掉，第二天早上將所需物品取出。取東西時(shí)需帶好帽子和口罩，輕柔操作，防止有空氣逆流入烤箱引起RNA酶污染；塑料制品泡1DEPC水72h,DEPC水提前一天配

5、制，并用玻璃棒攪拌混勻。連續(xù)高溫高壓消毒3次，以充分降解DEPC。）3、除非特別注明，所有程序均在室溫（1530）下進(jìn)行，試劑也放置于室溫。4、提RNA前，收拾干凈試驗(yàn)臺(tái)，盡量不要放無(wú)關(guān)的物品；將試驗(yàn)臺(tái)桌面用普通的75%酒精仔細(xì)擦兩遍；將所需用到的移液器全部用普通的75%酒精仔細(xì)擦拭干凈。需要的試劑：氯仿、異丙醇（裝此試劑的廣口瓶，瓶蓋最好用錫箔紙包一下）75%乙醇（溶于DEPC處理的水中）DEPC-treated water：100ul DEPC +100 ml ddH2O制成1DEPC水，放入RNase-free的玻璃瓶中用RNase-free的玻璃棒攪拌，靜置12小時(shí)以上，高溫高壓消毒。

6、RNase-free H2O的制備：把水加入到RNase-free的玻璃瓶中，加入DEPC至0.01%（v/v）,靜置過(guò)夜，高壓蒸汽滅菌，連續(xù)3遍。需要的器具：100ml棕色廣口瓶2個(gè)、100ml白色廣口瓶4個(gè)、鉗子2把、飯盒一個(gè)、100ml量筒一個(gè)、藍(lán)、黃、白Tip頭若干、1.5EP管、0.5EP管、PCR管若干、PE手套、錫箔紙若干、4離心機(jī)需提前降溫、1200ul、1000ul、400ul平衡管，大培養(yǎng)皿一套，濾紙、滴管3支，比色皿1個(gè)操作步驟：1、 均質(zhì)化：?jiǎn)螌优囵B(yǎng)的細(xì)胞，直接在培養(yǎng)瓶中裂解。倒掉培基，中號(hào)培養(yǎng)瓶中直接加入1mlTrizol試劑，加入后即反復(fù)抽吸、吹打細(xì)胞數(shù)次（約204

7、0次）室溫(1530)孵育5min（以利于勻漿樣品中核蛋白體完全解離）轉(zhuǎn)移均質(zhì)溶液到新的1.5mlEP管中2、 相分離：每1mlTrizol試劑加入200ul氯仿，小心蓋緊管蓋（單手操作；將裝氯仿和異丙醇的廣口瓶放在正前方遠(yuǎn)離自己的位置，操作時(shí)不會(huì)越過(guò)瓶口上方造成污染；取氯仿時(shí)，不要把瓶蓋放在桌面上，取完立即蓋好瓶蓋）用手劇烈震蕩15s室溫(1530)靜置23min（215min）4 12000g 離心15min(將EP管在離心機(jī)取出時(shí)需十分小心，盡量不要使EP管晃動(dòng))RNA存在于水相中，水相體積約為60%均質(zhì)化時(shí)使用的Trizol試劑量水相（無(wú)色）中間相，白色紅色下層（酚、氯仿相）3、 RN

8、A沉淀水相轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的1.5mlEP管【注意：EP管垂直；槍垂直、貼壁、用200ul槍緩慢抽；一共最多抽400ul，寧缺勿濫】混合異丙醇，以從水相中沉淀RNA，每1ml用于初始同質(zhì)化的Trizol試劑，使用500ul異丙醇，輕輕顛倒混勻12次室溫(1530)孵育樣品10min(510min)【將逆轉(zhuǎn)錄的試劑置于冰上溶解備用】4 12000g 離心10min(往往離心前RNA沉淀不可見(jiàn)，離心后在管側(cè)面和底部形成一個(gè)凝膠樣沉淀)4、 RNA洗滌棄上清（緩慢倒出）用75%乙醇洗滌RNA沉淀一次每ml用于初始同質(zhì)化的Trizol試劑使用至少1ml75%乙醇（可用75%乙醇預(yù)洗一次放進(jìn)去乙醇，不漩渦，

9、小心倒掉；再加入1ml乙醇） 漩渦混合4 7500g離心5min緩慢倒出上清液，再用小離心機(jī)離心數(shù)秒，用20ul的槍移走剩余的水，以保證整個(gè)EP管的干燥是同步的。整個(gè)過(guò)程一定要小心。5、 重新溶解RNA簡(jiǎn)單干燥RNA沉淀空氣干燥510min【將有RNA沉淀的EP管放入裝有濾紙的大培養(yǎng)皿中；不要讓RNA沉淀完全干燥，這將大大降低其溶解度】用無(wú)RNAse free water（逆轉(zhuǎn)錄試劑盒里的一般用不完） 20ul吹打幾次，溶解RNA用紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280及RNA的濃度1.82.0比較好注：紫外分光光度計(jì)的使用：打開(kāi)后面的電源按RNA確定RNA對(duì)應(yīng)的設(shè)置時(shí)1OD=40 向比色皿中加

10、入50ul高溫消毒之后的三蒸水blank將其中的水吸出加入3ulRNA+47ul三蒸水漩渦混勻后的樣品dilutionentersample（默認(rèn)光程為10mm，比色皿光面對(duì)著自己）逆轉(zhuǎn)錄（應(yīng)用GeneCopoeiaTM First Strand cDNA Synthesis Kit）：1、準(zhǔn)備：緩慢顛倒混勻試劑，避免起泡，并經(jīng)瞬時(shí)離心后，放置冰上待用。 用于制備RNA-Primer Mix的EP管需在冰上預(yù)冷。2、制備RNA-Primer Mix,輕彈幾下混勻，瞬時(shí)離心 試劑組分體積終含量total RNA2ug60M Oligo(dT)181 l2.4 MddH2O (DNase/RNas

11、e Free)To 13ulX3、變性RNA65加熱RNA-Primer Mix，10min（RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)打開(kāi)，增加反應(yīng)產(chǎn)量）立即放置冰上冷卻（消除RNA大多數(shù)二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而使引物可以結(jié)合）、4、配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：在已冷卻的RNA-Primer Mix反應(yīng)管內(nèi)加入以下試劑至總體積25 l。試劑組分 體積 終濃度RNA-Primer Mix 13 l5×RT Reaction Buffer 5 l 1×25 mM dNTP 1 l 1 mM25 U/l RNase Inhibitor 1 l 1 U/ul200U/ul M-MLV RTase (RNase H-) 1 l

12、8U/ulddH2O (DNase/RNase Free) 4 l總體積 25ul5、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混勻反應(yīng)Mix，瞬時(shí)離心，42 60min6、 滅活并保存逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加熱至85 5min,終止反應(yīng)在PCR儀上設(shè)置4 hold將cDNA保存于-20PCR階段：反應(yīng)體系50L= PCR-Mix+模板+引物1+引物2+去RNA酶的水反應(yīng)條件：95預(yù)變性5min后，94變性30s，55退火40s，72延伸1min；共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)后72延伸10min。取10L產(chǎn)物1.0%瓊脂糖凝膠電泳、照相。并采用凝膠圖像處理軟件ImageTool（IT）3.0測(cè)量灰度值，計(jì)算mRNA表達(dá)的相對(duì)值。計(jì)算方法：mRNA表

13、達(dá)的相對(duì)值目的基因灰度值-actin灰度值。凝膠電泳：1、先高火煮瓊脂糖，見(jiàn)快要冒泡時(shí)即轉(zhuǎn)到低火，直至溶液清亮為止。開(kāi)始可能會(huì)冒泡比較多，不要讓其溢出來(lái)，之后就不會(huì)冒出來(lái)了。2、灌膠時(shí)，先緩慢灌膠再插梳齒，不容易出氣泡。3、電泳緩沖液最好每次都用新的；至少要保證電泳緩沖液中不能有很多氣泡。3、膠跑到中間時(shí)，可以放到機(jī)子上去顯影，看有無(wú)目的條帶，是否需要繼續(xù)跑。trizol試劑盒提取總RNA。取2g總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后各取7.5L行PCR反應(yīng)，-actin為內(nèi)參照。TRX引物：上游為5'-CATATGGTGAAGCAGATCGAGAG-3，下游為5- TGTCACGCAG A T G G

14、CAACTG -3，擴(kuò)增片段大小為420bp。-actin引物：上游為5'-CCTTCCTG GGCATGGAGTCCT-3'，下游為5'- GGAGCAATGATCTT GATCT T-3'，擴(kuò)增片段大小為204bp。4、分離不同大小DNA片段的合適瓊脂糖濃度瓊脂糖濃度（）線性DNA片段的有效分離范圍（kb）0.51300.70.8121.00.5101.20.471.50.235、電泳緩沖液配方：TAE（Tris-乙酸） 工作液 貯存液/1000ml (1×) (50×) 40mmol/L Tris-乙酸 242g Tris-base 1mmol/ L EDTA 57.1ml 冰乙酸 100ml 0.5mol/L EDTA(PH=8.0)TBE (Tri