擬南芥TDNA插入突變體的鑒定

1、遺傳學(xué)實驗報告擬南芥T-DNA插入突變體的鑒定一、實驗?zāi)康模?、學(xué)習(xí)和掌握基本的植物DNA的CTAB提取法，掌握PCR、瓊脂糖凝膠電泳等基本實驗操作技能2、了解T-DNA插入突變體的鑒定原理，掌握其方法。二、實驗原理1、擬南芥（Arabidopsis thaliana）十字花科，植物遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和分子生物學(xué)的模式植物。Ø 植株形態(tài)個體小，高度只有30cm左右；Ø 生長周期快，從播種到收獲種子一般只需8周左右；Ø 種子多，每株可產(chǎn)生數(shù)千粒種子；Ø 形態(tài)特征簡單，生命力強(qiáng)，用普通培養(yǎng)基就可作人工培養(yǎng)；Ø 遺傳轉(zhuǎn)化簡單，轉(zhuǎn)化效率高；Ø

2、 基因組小，只有5對染色體，125MB；Ø 在2000年，擬南芥成為第一個基因組被完整測序的植物 。2、突變體突變體是遺傳學(xué)研究的最重要材料。突變體可以通過自然突變和人工誘變的方法獲得。擬南芥誘變常用方法有EMS誘變、T-DNA插入突變、激活標(biāo)簽。 由于T-DNA插入突變體便于對突變基因進(jìn)行追蹤，目前擬南芥、水稻中已經(jīng)有大量的T-DNA插入突變體；SALK中心提供的擬南芥T-DNA插入突變體超過十萬種。3、T-DNA插入突變原理T-DNA，轉(zhuǎn)移DNA（transferred DNA ），是根瘤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒中的一段DNA序列，可以從農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)移并穩(wěn)定整合到植物基因組 。人們將目的基因

3、插入到經(jīng)過改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實現(xiàn)外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與整合，獲得轉(zhuǎn)基因植株。除用于轉(zhuǎn)基因以外，T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活，從而產(chǎn)生基因敲除突變體，T-DNA大多為單拷貝插入，使其利于進(jìn)行遺傳分析。4、T-DNA插入突變體PCR鑒定 圖 1 結(jié)果鑒定 圖 2 PCR引物設(shè)計三、實驗材料1、材料：T-DNA插入的突變擬南芥植株；2、儀器：離心管，離心機(jī)，水浴鍋，移液槍，PCR儀，電泳槽等；3、試劑：液氮，CTAB提取液，氯仿/異戊醇（24：1），無水乙醇，70%乙醇，10xTaq buffer，MgCl2，引物，瓊脂糖，溴化乙錠（EB）。四、實驗步驟1、植物

4、DNA提取方法（CTAB法）1) 水浴加熱CTAB提取液至65 ；2) 取葉片100mg, 液氮研磨成粉末；3) 加入600µl CTAB提取液并混勻；4) 65 水浴45min（至少30min）；5) 12,000rpm 離心10min；6) 將上清轉(zhuǎn)移到新離心管，加入等體積氯仿/異戊醇, 混勻；7) 12,000rpm離心5-10min, 將上清液轉(zhuǎn)移到新管中；8) 向上清中加入1/10體積3M NaAc,再加入預(yù)冷的等體積異丙醇或2V無水乙醇, 混勻冰上放置10min；9) 12,000rpm 離心10min，棄上清，加入500µl 70乙醇洗滌2min；10) 12

5、,000rpm 離心5min，棄上清，吸干殘留并干燥；11) 加20-50 µl TE緩沖液溶解DNA。2、PCR反應(yīng)1)引物設(shè)計Ø LP: 5-TCA TCC ACC ATG GAA GAA AAGØ RP: 5-TTG GAT ACG ATG CGA GTA AACØ BP: 5- TTG TTC ACG TAG TGG GCC ATC GØ LP+RP:1107bpØ BP+RP: 560-860bp2）PCR 反應(yīng)體系Ø H2O: 12.4 l Ø 10×Buffer: 2 lØ dNT

6、P: 0.5 lØ MgCl2: 2 lØ LP/BP: 0.5 lØ RP: 0.5 lØ Taq: 0.1 lØ DNA: 2 lØ Total: 20 l3)PCR溫度設(shè)定Ø 94 5minØ 33 cyclen 變性：94 30sn 退火：53 30sn 延伸：72 1min30sØ 72 7min3、瓊脂糖凝膠電泳分析1) 500-1000bp：1.2%，Agarose 0.5×TBE；2) 化膠時應(yīng)注意不能沸出，冷卻至約60制膠，凝膠充分冷卻凝固后點樣進(jìn)行電泳；3) PCR產(chǎn)物加3-

7、4 l 6×loading buffer；4) 120V穩(wěn)壓電泳；5) EB染色10min，紫外觀察。五、結(jié)果分析PCR產(chǎn)物電泳截圖結(jié)果如下圖所示。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13圖 3 PCR產(chǎn)物電泳條帶圖在圖3，第7泳道為DL 2000 DNA marker，第5泳道是BP-RP引物體系，第六泳道是LP-RP引物體系。BP-RP體系的PCR產(chǎn)物產(chǎn)生一條略大于750bp的DNA條帶，而LP-RP引物體系中沒有在大致900bp的位置產(chǎn)生條帶。由此，可以斷定此樣品為純和突變體。六、思考與討論1、加液氮碾磨葉片時，最好保持離心管中始終有液體氮存在，如果碾磨一段時間后中途要加液氮繼續(xù)碾磨，一定注意，液氮沸騰時極易將已經(jīng)碾磨好的葉片吹走；另一點，碾磨時要迅速，避免空氣中的水汽在離心管上凝結(jié)。本次試驗中，離心管出現(xiàn)了冰霜，可能對最后的結(jié)果有影響。2、DNA有一定