電鏡練習(xí)題及參考答案

1、一、電鏡練習(xí)題及答案一、透射電鏡標(biāo)本取材的基本要求并簡要說明。答：取材的基本要求如下：組織從生物活體取下以后，如果不立即進(jìn)行及時固定處理，就有可能出現(xiàn)缺血缺氧后的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變，如細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞器變性或溶解等現(xiàn)象，這些都可造成電鏡觀察中的人為假象，直接影響觀察結(jié)果分析，甚至導(dǎo)致實驗失敗。此外，由于處理不當(dāng)造成組織微生物污染，導(dǎo)致細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)遭受破壞。因此，為了使細(xì)胞結(jié)構(gòu)盡可能保持生前狀態(tài)，取材成敗是關(guān)鍵，取材成功的關(guān)鍵在于操作者必須要注意把握“快、小、冷、準(zhǔn)”四個取材要點。(1)快：就是指取材動作要迅速，組織從活體取下后應(yīng)在最短時間 (爭取在12分鐘之內(nèi))投入前固定液。對于實驗動物，最

2、好在斷血流、斷氣之前就進(jìn)行取材，以免缺血缺氧后使細(xì)胞代謝發(fā)生改變而破壞細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。當(dāng)然，最好是采用灌注固定法。為了使前固定的效果更佳，組織塊要充分和固定液混合，應(yīng)采用振蕩固定10分鐘以上，有條件的可采用微波固定法固定。(2)小：由于常用的固定劑滲透能力較弱，組織塊如果太大，塊的內(nèi)部將不能得到良好的固定。因此所取組織的體積要小，一般不超過1mm3。為便于定向包埋，可將組織修成大小約1mm1mm2mm長條形。(3)冷：為了防止酶對自身細(xì)胞的酶解作用，取材操作最好在低溫(515)環(huán)境下進(jìn)行，這樣可以降低酶的活性，防止細(xì)胞自溶。所采用的固定劑以及取材器械要預(yù)先在冰箱(5）中存放一段時間。(4)準(zhǔn)：

3、就是取材部位要準(zhǔn)確，這就要求取材者對所取的組織解剖部位要熟悉，必須取到與實驗要求相關(guān)的部位，不同實驗組別間要取相同部位，如需要定向包埋的標(biāo)本，則要作好定向取材工作。此外，還要求操作動作輕柔，熟練，盡量避免牽拉、挫傷與擠壓對組織造成的人為損傷。二、 什么是瑞利準(zhǔn)則？電鏡與光鏡在原理上有何相似和不同之處？答：1、光線通過二個比較靠近的小孔時，這二個小孔的衍射圖會重疊在一起。當(dāng)一個衍射圖的中央亮斑正好落在另一個衍射圖的第一暗環(huán)中心時，這二個點剛可以分辯。這就是顯微鏡分辯本領(lǐng)的瑞利準(zhǔn)則。2、相似點：光學(xué)顯微鏡是利用玻璃制作的透鏡對光進(jìn)行折射，將一物點發(fā)出不同角度的光線最終會聚成一個像點。電子顯微鏡是以

4、電子束作為光源，利用電磁透鏡產(chǎn)生的電場或磁場折射電子束，并通過電子束轟擊熒光屏激發(fā)熒光而達(dá)到成像目的。不同點：光鏡的照明源是可見光，而電鏡是用電子束照明。光鏡的透鏡用玻璃制成，而電鏡的透鏡是軸對稱的電場或磁場。三、 簡述透射電鏡及掃描電鏡樣品制作流程答：1、透射電鏡樣品制作流程為取材漂洗（生理鹽水）前固定（2.5%戊二醛，4C冰箱2小時以上）漂洗（0.1M 磷酸緩沖液，3次，45分鐘）后固定(1%鋨酸1小時左右)漂洗（0.1M 磷酸緩沖液，3次，45分鐘）塊染（1%醋酸鈾2小時）梯度脫水（50%、70%、80%、90%丙酮各15分鐘， 100%丙酮 2次，各10分鐘）浸透（丙酮：包埋液=1：1

5、，37 C烘箱2小時；丙酮：包埋液=1：4， 37C烘箱過夜；純包埋液45C烘箱2小時）包埋聚合（45C烘箱3小時，65C烘箱48小時）。 2、掃描電鏡樣品制作流程為取材（做好樣品觀察面的標(biāo)志）漂洗（生理鹽水或緩沖液）固定（2.5%戊二醛2小時以上）漂洗（0.1M磷酸緩沖液，3次，45分鐘）后固定（1%鋨酸，2小時）脫水（ 50%、70%、80%、90%、95%各15分鐘，換醋酸異戊酯15分鐘或叔丁醇15分鐘）干燥（零界點干燥或冷凍干燥）鍍膜（真空鍍膜儀或離子濺射儀）四、常用的化學(xué)固定方法有哪些？答;常用的化學(xué)固定方法有1、浸泡固定法（也稱組織塊固定）：就是將組織塊直接浸泡入固定液當(dāng)中進(jìn)行固定

6、。2、游離細(xì)胞固定法：適用于培養(yǎng)細(xì)胞、周圍血、骨髓、胸腹水或其他滲出液。如為貼壁生長的培養(yǎng)細(xì)胞，應(yīng)先用橡皮刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)管壁上輕輕刮下，或用酶消化，使細(xì)胞脫離管壁。3、原位固定法：就是在組織未取下之前，在組織器官原來的位置進(jìn)行預(yù)固定的方法。原位固定可分為點滴固定法和注射固定法兩種。點滴固定法：就是將實驗動物麻醉后暴露出所需的器官表面，小心地剝開包膜，將預(yù)冷的固定液直接滴在組織的表面上，并保持固定液適當(dāng)濃度不使揮發(fā)干燥。注射固定法：就是將實驗動物麻醉后，將固定液用細(xì)注射針直接注射到所需固定的組織中或空腔臟器的內(nèi)部。4、灌注固定法就是利用血液循環(huán)的途徑將固定液灌注到所需固定的組織中，其特點是灌注

7、快速、均勻，缺點是固定操作復(fù)雜、要求高。灌注固定法可分為全身固定和局部固定兩種。通常采用的固定劑為2%4%戊二醛溶液或者4%多聚甲醛溶液。五、普通透射電鏡包括那些結(jié)構(gòu)？請簡要敘述。答：透射式電子顯微鏡（簡稱透射電鏡）由四部分組成，即電子光學(xué)系統(tǒng)（即鏡筒）、真空排氣系統(tǒng)、電源系統(tǒng)和水冷系統(tǒng)。電子光學(xué)系統(tǒng)包括：照明系統(tǒng)、樣品室、成像系統(tǒng)和觀察記錄系統(tǒng)。真空排氣系統(tǒng)包括：機械泵、油擴(kuò)散泵、真空管道、閥門及檢測系統(tǒng)組成。電源系統(tǒng)包括：主要的電源供給包括高壓電源、電子槍燈絲電源、控制極電源、透鏡電源、真空系統(tǒng)電源等部分。水冷系統(tǒng)主要靠冷卻水循環(huán)裝置來完成或者直接用自來水降溫。六、簡述電鏡在生命科學(xué)中的應(yīng)

8、用答: 電鏡在生命科學(xué)上的應(yīng)用幾乎包括所有的學(xué)科研究領(lǐng)域都已經(jīng)用到或即將用到電鏡技術(shù)。比如動物或植物細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)（包括細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)及其細(xì)胞器等內(nèi)容物、細(xì)胞間的連接等）的形態(tài)觀察，通過對比觀察，對動植物形態(tài)在超微結(jié)構(gòu)水平上進(jìn)行分類、分型，以探討遺傳、變異及病理病因的機理或機制，為生命科學(xué)的基礎(chǔ)研究所不可或缺的研究手段。 利用常規(guī)電鏡技術(shù)和特殊電鏡技術(shù)如免疫電鏡技術(shù)、電鏡酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、電鏡原位雜交技術(shù)等可以進(jìn)行細(xì)胞細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及超微病理分析，以及細(xì)胞內(nèi)抗原、酶等的定位、定性甚至定量研究等。七、簡述電鏡的球差和畸變及其形成原因。答：1、球差：由于電子束光源通過透鏡受到偏轉(zhuǎn)，通過樣品，從物平面向

9、下發(fā)射，形成物點孔徑角。從物點發(fā)出的射線，到達(dá)下一級透鏡又被聚集。如果透鏡有缺陷或孔徑角太大，則靠近光軸的射線和遠(yuǎn)離光軸的射線，受到電磁場的作用就會不同，這些射線在光軸上會聚的位置不同，結(jié)果遠(yuǎn)離光軸的射線就會在像面上形成一個最小模糊圈。此時可有圖象中央凸起感。球差是目前影響電鏡分辨率的一個主要因素。 2、畸變：由于離軸較遠(yuǎn)處的徑向磁場的作用力強，使放大倍數(shù)隨物點離軸的距離而變化，進(jìn)而使圖象發(fā)生改變而產(chǎn)生的?；兂Ｒ姷挠姓硇位?、桶形畸變和S形畸變等。八、簡述電磁透鏡及其聚焦原理答：由于軸對稱彎曲磁場對電子束有聚焦作用，因而可以得到電子光學(xué)像。我們稱這種具有軸對稱彎曲磁場裝置構(gòu)成的電子透鏡為電磁

10、透鏡（electron magnetic lenses）。由于電磁透鏡磁場非均勻分布，物、像點在磁場之外，電子在磁場中既受到軸向分量的作用，又受到徑向分量的作用，使平行于軸進(jìn)入磁場的電子束可獲得聚焦。九、什么是反差？簡述電鏡熒光圖像反差形成的原因。答：1、人的眼睛在區(qū)分物體時，主要根據(jù)物體不同部位或物體之間的光強度與波長的差別，這些差別構(gòu)成了物體的反襯度，又稱為“反差”。電鏡與光鏡一樣也存在反差現(xiàn)象。2、由于電鏡標(biāo)本上的不同部位的物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同，經(jīng)過電子染色后，其疏密度也不同，它們散射電子的能力也各不相同，散射電子能力強的地方，顯現(xiàn)為暗像；相反，散射能力弱的地方，顯現(xiàn)為亮像。因此，在熒光屏上所看

11、到的是由暗像與亮像組成的具有一定反差的熒光圖像。 十、游離細(xì)胞取材方法有哪些?并簡述其處理方法。 答：血漿凝集法：將抗凝全血離心分層（2000轉(zhuǎn)/每分鐘，1020分鐘），用毛細(xì)吸管沿著管壁輕輕的將上清夜吸?。ú灰茐陌准?xì)胞層），接著用吸管吸取固定液，并沿著管壁將2.5%戊二醛固定液慢慢地加入進(jìn)行固定，然后把它放在4冰箱內(nèi)保存。血漿（血清）混合法：如為細(xì)菌、病毒、脫落細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞則先將它們制成懸液放置于離心管內(nèi)（最好是玻璃的），離心成團(tuán)（10003000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘，下同），去上清液后加入2.5%戊二醛固定10分鐘左右，離心，再棄去多余的固定液，然后和少量抗凝血漿或血清混合均勻，離心成團(tuán)

12、，去上清液（留少許），用吸管吸取2.5%戊二醛固定液沿著離心管壁緩慢滴入，盡量避免團(tuán)塊分散，靜置于4冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。十一、簡述超薄切片流程并簡要說明。答：超薄切片流程包括以下幾個步驟：1、切片前的準(zhǔn)備：銅網(wǎng)清洗（用丙酮和乙醇浸洗）2、支持膜制備：常用Formvar膜（用聚乙烯醇縮甲醛和氯仿配置，濃度為0.5%）3、玻璃刀制備：專用制刀機制作。4、半薄切片光鏡定位（主要確定超薄切片的位置）。5、修塊（表面修成梯形或長方形）。6、超薄切片：專用超薄切片機切片，厚度在 50100 nm 之間較為合適。7、撈片：將超薄切片撈在載網(wǎng)上。8、染色：鉛-鈾雙重染色法，如已有過塊染，則只需鉛染色30分鐘即可。

13、十二、簡述負(fù)染技術(shù)及其應(yīng)用。答：負(fù)染技術(shù)是利用重金屬鹽（常用磷鎢酸鹽或醋酸鈾溶液）沉積到樣品四周，樣品四周散射電子的能力就較強，因而表現(xiàn)為暗區(qū)；樣品本身散射電子的能力較弱，則表現(xiàn)為亮區(qū)，這樣便能把樣品的外形與表面結(jié)構(gòu)清楚地襯托出來。是觀察微小顆粒狀生物材料的外部形狀常用的染色方法。主要應(yīng)用于病毒、支原體、細(xì)菌等微生物外部形態(tài)的觀察以及納米級生物材料的形態(tài)觀察。十三、簡述石蠟塊做超薄切片的樣品制作流程答、石蠟塊做超薄切片的樣品制作流程如下：1、取材：從石蠟塊上相應(yīng)部位切下約1mm3 的小塊。2、溶蠟：將取下的標(biāo)本放在一張濾紙上，40烘箱內(nèi)烘1小時，然后轉(zhuǎn)放入二甲苯溶液中40烘箱內(nèi)繼續(xù)浸泡812h

14、。3、水化：純丙酮30分鐘、90%、80%、70%丙酮各15分鐘。4、漂洗：用緩沖液漂洗（0.1M磷酸緩沖液PBS)3次，每次15分鐘。5、固定：2.5%戊二醛固定2小時，PBS漂洗3次,而后1%鋨酸后固定12小時。6、漂洗、塊染、脫水、浸泡、包埋聚合同常規(guī)透射電鏡標(biāo)本制作方法。二、選擇題及答案1、 人眼的平均分辨率為（B）A 0.4mm B 0.2mm C 0.3mm D O.2m E 0.4m2、 電子槍產(chǎn)生的電子是（A ）A 入射電子 B 透射電子 C 彈性散射電子 D 二次電子 E 俄歇電子3、 用來顯示組織和細(xì)胞的內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)像的電子為（B）A 入射電子 B 透射電子 C 彈性散射電

15、子 D 二次電子 E 反射電子4、 下面哪項不屬于透射電鏡樣品制備技術(shù)（ A ）A 鍍膜 B 負(fù)染技術(shù) C 電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)D 超薄切片技術(shù) E 半薄切片技術(shù)5、下面哪項不屬于掃描電鏡樣品制備技術(shù)（B ）A 表面干燥法 B 浸透包埋 C 冷凍復(fù)型D 冷凍割斷法 E 組織導(dǎo)電法6、下面哪種電鏡可以在觀察結(jié)構(gòu)的同時，對組織細(xì)胞內(nèi)的元素成分進(jìn)行分析（C）A 透射電鏡 B 掃描電鏡 C 分析電鏡D 超高壓透射電鏡 E 原子力顯微鏡7、觀察組織細(xì)胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)應(yīng)選用哪種電鏡（B）A 原子力顯微鏡 B 透射電鏡 C 掃描電鏡D 磁力顯微鏡 E 側(cè)向力顯微鏡8、下面哪項不是超高壓電子顯微鏡的優(yōu)點（E ）A

16、可用于觀察厚切片 B 可以提高分辨率 C 可提高圖像質(zhì)量D 可觀察復(fù)雜的結(jié)構(gòu) E 減少輻射損傷范圍9、下面對掃描電鏡的描述錯誤的是（B）A 利用反射電子和二次電子成像B 用于觀察組織細(xì)胞表面形貌C 樣品室大，可用于觀察塊狀樣品D 景深長，立體感強E 樣品可被升降和傾斜10、電子槍由（D）組成A 陰極、陽極 B 陰極、柵極 C 陽極、柵極D 陰極、陽極、柵極 E 正極、負(fù)極、柵極11、二次電子監(jiān)測系統(tǒng)不包括（E）A 檢測器 B 陰極射線管 C 閃爍器D 光電倍增器 E 視頻放大器12、固定液中戊二醛的常用濃度為（C）A 0.5% B 2.0% C 2.5% D 4% E 10%13、下面對透射電鏡描述不正確的是（D）A 利用透射電子成像B 觀察細(xì)胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu) C 可觀察負(fù)染標(biāo)本D 景深長、立體感強E 分辨率高，性能最完善14、透射電鏡的反差取決于樣品對（B）的散射能力A 二次電子 B 入射電子 C 透射電子D 散射電子 E 反射電子15、觀察生物樣品時，透射電鏡的加速電壓一般為（C）A 20-50KV B 50-80KV C 80-100KV D 100-120KV E 120KV以上16、超薄切片是指厚度小于（ D）的切片A 200nm B 300nm C 400nm D 100nm E 500nm1