人表皮細(xì)胞中側(cè)群細(xì)胞表型的初步分析

1、人表皮細(xì)胞中側(cè)群細(xì)胞表型的初步分析 作者：程俊美任寧曾慶東施娟紅李勁松【摘要】 目的：檢測(cè)人表皮細(xì)胞中是否存在側(cè)群(side population，SP)細(xì)胞，并研究該表型細(xì)胞是否表達(dá)通用干細(xì)胞標(biāo)志物ABCG2和表皮干細(xì)胞的標(biāo)志物整合素6和1。方法：運(yùn)用中性蛋白酶和胰蛋白酶兩步消化法從手術(shù)切除的人包皮組織中分離獲得表皮細(xì)胞。經(jīng)Hoechst33342熒光染料和PI染色，流式細(xì)胞儀分析并分選SP細(xì)胞。采用流式細(xì)胞儀分析SP細(xì)胞ABCG2、整合素6和1的表達(dá)情況。結(jié)果：人表皮細(xì)胞中存在SP細(xì)胞，其比例為0.2%0.3%。用流式細(xì)胞儀可檢測(cè)到在SP細(xì)胞以及總表皮細(xì)胞中均有少量細(xì)胞表達(dá)通用干細(xì)胞標(biāo)志物

2、ABCG2以及表皮干細(xì)胞的標(biāo)志物整合素6和1，但二者陽(yáng)性細(xì)胞百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：表皮細(xì)胞中的SP細(xì)胞是否是富集的表皮干細(xì)胞仍存在疑問，還需要進(jìn)一步的動(dòng)物體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)、克隆形成能力和增殖能力的研究證實(shí)。 【關(guān)鍵詞】 側(cè)群細(xì)胞·表皮干細(xì)胞·ABCG2·整合素6·整合素1【ABSTRACT】 Objective: To explore side population(SP) cells in human epithelial cells and to observe the expression of the unive

3、rsal stem cell marker ABCG2, epidermal stem cell markers 6 integrin and 1 integrin on SP cells. Methods: Epithelial cells were obtained by digesting human skins with Dispase II and Trypsin and stained with Hoechst33342 and PI. The SP cells were analyzed and sorted by the fluorescence-activated cell

4、sorter. Then the expression of ABCG2, 6 integrin and 1 integrin was analyzed by flow cytometry. Results: SP cells accounted for 0.2%-0.3% of total human epithelial cells. Only a small part of cells expressed ABCG2, integrin 6 and integrin 1 of both SP cells and total human epithelial cells detected

5、by flow cytometry .The difference of positive rates between SP cells and total human epithelial cells was not significant. Conclusion: SP cells accounted for 0.2%-0.3% of total human epithelial cells. The difference of positive rates of stem cells marker ABCG2, integrin 6 and integrin 1 between SP c

6、ells and total human epithelial cells was not significant.【KEY WORDS】 Side population ·Epidermal stem cells ·ABCG2·integrin 6· integrin1側(cè)群 (side population，SP) 細(xì)胞是利用Hoechst熒光染料和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行造血干細(xì)胞分離時(shí)發(fā)現(xiàn)的一群特殊細(xì)胞，高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物ABCG2 (ATP-binding cassette superfamily G member 2)1。SP細(xì)胞既具有類似干細(xì)胞的自我更

7、新和多向分化潛能，還具有獨(dú)特的表型標(biāo)記和生物學(xué)特征，代表了一種新的干細(xì)胞類型2。已有越來越多的研究者將SP細(xì)胞分離法用于對(duì)干細(xì)胞的分離中。皮膚是始終處于不斷更新狀態(tài)的組織之一，這種不斷的更新是由位于表皮基底部和毛囊隆突部的表皮干細(xì)胞維持的。表皮干細(xì)胞在創(chuàng)傷修復(fù)和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定過程中具有重要作用，而且是腫瘤發(fā)生和基因治療的主要靶標(biāo)3。本研究利用SP細(xì)胞分離法檢測(cè)人表皮細(xì)胞中是否存在SP細(xì)胞，并研究該表型細(xì)胞是否表達(dá)通用干細(xì)胞標(biāo)志物ABCG2、表皮干細(xì)胞標(biāo)志物整合素6和1，為進(jìn)一步研究SP細(xì)胞提供線索和基礎(chǔ)。1資料與方法1.1一般資料收集山東大學(xué)齊魯醫(yī)院普外科2008年1月2008年10月56例腹

8、部手術(shù)患者的腹部皮膚組織。1.2主要試劑與儀器K-SFM培養(yǎng)基、維拉帕米(Gibco公司)，小牛血清(Hyclone公司)，中性蛋白酶、0.25%胰酶(Gibco公司)， Hoechst33342熒光染料、PI(碘化丙錠，Sigma公司)，小鼠抗人ABCG2-FITC、 CD71-PE、6-FITC單克隆抗體(Sigma公司)，羊抗人1-FITC單克隆抗體(millipore公司)，同型對(duì)照抗體IgG1-FITC、IgG1-PE(Sigma公司)。超凈工作臺(tái)(Air Tech公司)，超速離心機(jī)(Sigma公司)，CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heraeus公司)，F(xiàn)ACSAria流式細(xì)胞儀(BD公司)

9、。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1表皮細(xì)胞懸液制備無菌條件下取患者腹部皮膚、徹底清洗，去除皮下組織，將皮膚剪切成約0.5 cm×1.0 cm大小的皮片，中性蛋白酶消化，4 過夜。D-Hanks清洗，仔細(xì)分離表皮和真皮層，將表皮剪碎，加0.25 %胰酶，室溫孵育8 min，用含血清培養(yǎng)基終止消化，過200目篩網(wǎng)，1 000 r/min離心6 min;用K-SFM培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，吹打成單細(xì)胞懸液。1.3.2細(xì)胞染色和SP細(xì)胞分選取表皮單細(xì)胞懸液，用K-SFM培養(yǎng)液重懸成1×106 mL-1的細(xì)胞懸液，加入Hoechst33342至終濃度為5 g/mL。另取同一標(biāo)本相同量表皮單細(xì)胞懸

10、液加入Hoechst33342至終濃度為5 g/mL，同時(shí)加入維拉帕米至終濃度為50 g/mL，做為對(duì)照組。37 水浴90 min，離心，棄上清。 D-Hanks清洗1次，重懸于含2%小牛血清的PBS緩沖液中，加入PI至終濃度為2 g/mL，上流式細(xì)胞儀分選SP細(xì)胞。Hoechst33342的激發(fā)光為407 nm紫光， 450/40帶通收集藍(lán)光， 695/40帶通和655長(zhǎng)通收集紅光。PI的激發(fā)光為488 nm藍(lán)光，用575/26帶通收集紅光。1.3.3流式細(xì)胞儀分析收集同一標(biāo)本總表皮細(xì)胞和分選的SP細(xì)胞，每106 個(gè)細(xì)胞分別加入5 L小鼠抗人ABCG2-FITC單克隆抗體，4 室溫避光孵育3

11、0 min，D-Hanks液清洗后待檢測(cè)，陰性對(duì)照管為IgG1-FITC。采用同樣的方法分別用小鼠抗人6-FITC、CD71-PE單克隆雙抗體(陰性對(duì)照管IgG1-FITC/IgG1-PE)和羊抗人1-FITC單克隆抗體(陰性對(duì)照管為IgG1-FITC)對(duì)2種細(xì)胞進(jìn)行熒光抗體標(biāo)記后，上流式細(xì)胞儀分析。1.4觀察項(xiàng)目根據(jù)陰性對(duì)照確定標(biāo)本是否為陽(yáng)性，Cellquest軟件自動(dòng)分析陽(yáng)性率。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，SP細(xì)胞和總表皮細(xì)胞ABCG2、整合素6和1陽(yáng)性表達(dá)率結(jié)果的記錄方式為至少3次獨(dú)立重復(fù)結(jié)果，記錄為x±s，數(shù)據(jù)進(jìn)行u檢驗(yàn)。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

12、義。2結(jié)果2.1SP細(xì)胞分選結(jié)果表皮細(xì)胞染色后先經(jīng)過前向角和測(cè)向角散射光分析，去除左下角細(xì)胞碎片。PI染色分為PI陰性活細(xì)胞和PI陽(yáng)性死細(xì)胞2群，去除死細(xì)胞。收集狀態(tài)良好的活細(xì)胞，分析Hoechst33342藍(lán)光和紅光的雙參數(shù)圖，SP細(xì)胞位于左下角2種熒光均陰性或很弱的區(qū)域。無維拉帕米組SP細(xì)胞比例約為0.2%0.3% (圖1A)，對(duì)照組經(jīng)維拉帕米阻斷后SP細(xì)胞比例減少(<0.01%，圖1B)。2.2流式細(xì)胞儀分析SP細(xì)胞ABCG2、整合素6和1表達(dá)流式細(xì)胞儀檢測(cè)到SP細(xì)胞和總表皮細(xì)胞中ABCG2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均較少(圖2)。SP細(xì)胞和總表皮細(xì)胞中均有少數(shù)6briCD71dim細(xì)胞和

13、整合素1陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞(圖3、4)。2種細(xì)胞中ABCG2、6briCD71dim細(xì)胞和整合素1陽(yáng)性表達(dá)率比較見表1。通用干細(xì)胞標(biāo)志物ABCG2、表皮干細(xì)胞標(biāo)志物整合素6和整合素1在SP細(xì)胞和總表皮細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3討論在干細(xì)胞表型標(biāo)記和功能特性研究中，人們利用Hoechst熒光染料結(jié)合熒光激活細(xì)胞分選(fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)進(jìn)行造血干細(xì)胞的分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)一群分布特殊的細(xì)胞，經(jīng)過紫外激發(fā)后用雙波長(zhǎng)(450 nm和675 nm以上波長(zhǎng))檢測(cè)，可以觀察到這群細(xì)胞發(fā)出微弱的藍(lán)色和紅色熒光，在流式二

14、維分析點(diǎn)陣圖上，呈彗星狀分布在造血干細(xì)胞主群的一側(cè)，被稱為SP細(xì)胞1，這已成為一種常用的分離造血干細(xì)胞的方法。在成體多種組織，如肝、肺、腦、神經(jīng)、小腸、氣管等中都發(fā)現(xiàn)了SP細(xì)胞，SP細(xì)胞具有自我更新和多向分化潛能，在體內(nèi)能夠分化產(chǎn)生不同組織類型的細(xì)胞，很多學(xué)者認(rèn)為其代表了一群新型干細(xì)胞，并將其稱為側(cè)群干細(xì)胞4。對(duì)SP細(xì)胞的研究有助于增加對(duì)干細(xì)胞各種特性的理解，還提供了一種從組織細(xì)胞中分離純化和利用干細(xì)胞的策略。表皮干細(xì)胞的分離與鑒定對(duì)機(jī)體穩(wěn)態(tài)維持、創(chuàng)傷愈合以及癌癥等研究起著重要作用。目前，表皮干細(xì)胞的分離方法有標(biāo)記滯留法、克隆分析法、分子標(biāo)記法5-7。但由于操作繁雜而不易分離，加上表皮干細(xì)胞數(shù)

15、量較少，且缺乏特異性分子標(biāo)志，為其研究帶來了一定困難。因此，本研究采用不依賴分子標(biāo)記的Hoechst33342染色結(jié)合FACS分析人表皮細(xì)胞中是否存在干細(xì)胞樣的SP細(xì)胞。Triel等8采用人(455歲)胸部及耳部皮膚檢測(cè)到表皮細(xì)胞中SP細(xì)胞比例分別為0.01%5.39%、0.08%2.01%，并得出SP細(xì)胞比例與部位無相關(guān)性的結(jié)論。本研究采用人腹部皮膚作為表皮細(xì)胞來源，經(jīng)消化分離獲得表皮細(xì)胞，結(jié)果顯示人皮膚的表皮細(xì)胞中存在SP細(xì)胞，比例為0.2%0.3%。范圍小于Triel等8的結(jié)果，可能與皮膚供者年齡范圍較窄有關(guān)。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATPbinding cassette transporter

16、)是一類跨膜蛋白超家族，參與了多種物質(zhì)分子的“出”、“入”細(xì)胞的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程，能選擇性地把一些染料(如Hoechst33342)和藥物泵出細(xì)胞外，其成員包括MDR1、ABCG2、ABCA3等9。多數(shù)研究認(rèn)為高表達(dá)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是產(chǎn)生SP表型的原因，提示ABCG2可作為SP細(xì)胞的表型標(biāo)志而用于分離鑒定10。ABCG2能夠被鈣離子拮抗劑維拉帕米非特異性阻斷，抑制染料外排，減少SP細(xì)胞比例。本研究在對(duì)照組中加入維拉帕米后可見SP亞群明顯減少，與Goodell等1的研究結(jié)果相符。但流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，與總表皮細(xì)胞相比，SP細(xì)胞ABCG2表達(dá)并不增高。近來，Zhou 等11通過一系列研究證實(shí)ABCG

17、2和MDR1均表達(dá)于造血干細(xì)胞， 并證實(shí)維拉帕米不僅可以阻斷ABCG2，還可阻斷MDR1。所以SP細(xì)胞外排Hoechst染料并不只與ABCG2表達(dá)有關(guān)，應(yīng)該還有其他的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與，還需進(jìn)一步研究證實(shí)。整合素是一類位于細(xì)胞膜表面的糖蛋白受體超家族分子，由和兩種亞單位組成。表皮基底細(xì)胞主要表達(dá)21、31和64。整合素不僅介導(dǎo)表皮干細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，也調(diào)控終末分化啟動(dòng)。Jones等7發(fā)現(xiàn)整合素1高表達(dá)的表皮細(xì)胞富含表皮干細(xì)胞。Tani等12研究證實(shí)， 使用整合素6和另一個(gè)表皮細(xì)胞的表面標(biāo)志CD71來區(qū)分表皮干細(xì)胞、暫時(shí)增殖細(xì)胞和終末分化細(xì)胞更有優(yōu)勢(shì)。通過6和CD71 可以將表皮細(xì)胞分為3 種類

18、型，其中6briCD71dim細(xì)胞約占細(xì)胞總數(shù)的8%，這類細(xì)胞代表表皮干細(xì)胞。因此，高表達(dá)整合素6也被認(rèn)為是表皮干細(xì)胞的表面標(biāo)志之一。本研究顯示SP細(xì)胞中存在6briCD71dim細(xì)胞和整合素1陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞;總表皮細(xì)胞中6briCD71dim細(xì)胞比例和整合素1陽(yáng)性表達(dá)率與Jones等7和Tani等12的研究結(jié)果一致;但是與總表皮細(xì)胞相比，SP細(xì)胞表達(dá)整合素6和1并不增高。這與Triel等8的研究結(jié)果一致。Jones等7已證實(shí)高表達(dá)整合素6和1是表皮干細(xì)胞的標(biāo)志，而SP細(xì)胞整合素6和1表達(dá)不增高，因此Triel等8認(rèn)為表皮細(xì)胞中SP細(xì)胞可能不是表皮干細(xì)胞。本研究認(rèn)為，雖然SP細(xì)胞并不高表達(dá)通用干

19、細(xì)胞標(biāo)志物ABCG2、表皮干細(xì)胞標(biāo)志物整合素6和整合素1，但還需要進(jìn)一步的動(dòng)物體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SP細(xì)胞的克隆形成能力和增殖能力以及在維持皮膚內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中的作用，才有可能明確表皮細(xì)胞中SP細(xì)胞是否是富集的表皮干細(xì)胞?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Goodell MA, Brose K, Paradis G, et al. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivoJ. Exp Med, 1996,183(4):66-78.2 Bhatt RI, Brow

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