他克莫司對(duì)周?chē)窠?jīng)損傷后脊髓組織中肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響

1、他克莫司對(duì)周?chē)窠?jīng)損傷后脊髓組織中肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響 作者：潘峰，陳安民，陶鳳華，陳家祿，陶海鷹，彭昊，祝成亮【摘要】 目的 探討他克莫司對(duì)大鼠周?chē)窠?jīng)損傷后脊髓組織中肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (HGF) 表達(dá)的影響。方法成年雄性大鼠 50 只，隨機(jī)分為正常組、損傷組和治療組，后兩組行雙側(cè)坐骨神經(jīng)切斷。術(shù)后治療組頸后皮下注射他克莫司 (1 mg/kg)，損傷組注射生理鹽水。術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)取 L46脊髓，應(yīng)用 Western blotting 技術(shù)及免疫熒光標(biāo)記對(duì)脊髓組織中HGF 的表達(dá)變化進(jìn)行定量和定位檢測(cè)。結(jié)果HGF 在脊髓灰質(zhì)前角、中間帶和后角的各類(lèi)神經(jīng)元中均有表達(dá)；損傷組與正常組大鼠脊髓組織

2、中 HGF 的表達(dá)之間無(wú)顯著性差異 (P>0.05)，治療組大鼠脊髓組織中 HGF 的表達(dá)在術(shù)后 7、14 d 時(shí)明顯高于損傷組 (P< 0.05)。結(jié)論 (1) 周?chē)窠?jīng)損傷本身并不能使脊髓組織中 HGF 的表達(dá)上調(diào)；(2) 他克莫司能誘導(dǎo)周?chē)窠?jīng)損傷后內(nèi)源性 HGF 的高表達(dá)，從而保護(hù)相應(yīng)神經(jīng)元，促進(jìn)軸突生長(zhǎng)。 【關(guān)鍵詞】 周?chē)窠?jīng)； 創(chuàng)傷與損傷； 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子； 他克莫司 Abstract：ObjectiveTo explore the effect of tacrolimus on expression of hepatocyte growth facto

3、r (HGF) in rat spinal cord following peripheral nerve injury.MethodFifty male rats were randomly divided into normal group,injury group and treatment group.Models of peripheral nerve injury were established by transection of bilateral sciatic nerve at 0.5 cm distal to piriform muscle.Then treatment

4、group received subcutaneous injection of tacrolimus (1 mg/kg) at the back of the neck,while injury group received 0.9 % saline.The L46 spinal cords were harvested at various time points after surgery.Western blotting and immunofluorescence staining were used to detect the level and position of HGF i

5、n the spinal cord.ResultHGFpositive neurons were located in anterior horn,intermediate zone and posterior horn of gray matter in normal spinal cord.There was no significant difference in the expressions of HGF between injury group and normal group,while the expression of HGF was significantly higher

6、 in treatment group than that in injury group at 7 and 14 days after surgery.ConclusionPeripheral nerve injury does not upregulate the expression of HGF in spinal cord,while tacrolimus can induce high expression of endogenous HGF after injury to protect neurons and promote axonal outgrowth. Key word

7、s：peripheral nerves; wounds and injuries; hepatocyte growth factor; tacrolimus 周?chē)窠?jīng)損傷可引起相應(yīng)脊髓節(jié)段神經(jīng)元的死亡，嚴(yán)重影響了周?chē)窠?jīng)再生及后期功能恢復(fù)。新型免疫抑制劑他克莫司，已被證實(shí)對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)切斷后的脊髓神經(jīng)元具有保護(hù)作用，使其免遭凋亡1，但其機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (hepatocyte growth factor，HGF) 是最新發(fā)現(xiàn)的一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，在腦和脊髓的不同區(qū)域均有表達(dá)，具有促進(jìn)神經(jīng)元存活、加速神經(jīng)再生的作用2。本研究的目的在于明確誘導(dǎo)內(nèi)源性 HGF 的表達(dá)上調(diào)是否構(gòu)成周?chē)?/p>

8、神經(jīng)損傷后他克莫司發(fā)揮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用的因素之一。 1 材料與方法 1.1 動(dòng)物分組與模型制備 成年雄性健康 Wistar 大鼠 50 只 (武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體質(zhì)量 200250 g。隨機(jī)分為損傷組和治療組，每組各 20 只，剩余 10 只設(shè)為正常組。損傷組和治療組大鼠行雙側(cè)坐骨神經(jīng)切斷術(shù)：大鼠經(jīng) 1 % 戊巴比妥鈉 30 mg/kg 腹腔內(nèi)麻醉后，取俯臥位，術(shù)區(qū)剪毛、消毒鋪單，無(wú)菌條件下行臀部斜行切口，長(zhǎng)1.5 cm，在臀肌間隙暴露坐骨神經(jīng)，距梨狀肌下緣 0.5 cm 處切斷坐骨神經(jīng)，近端以 5-0 號(hào)線雙重結(jié)扎，遠(yuǎn)端切除 1 cm 后埋入股二頭肌中，縫合切口。術(shù)后治療組大

9、鼠頸后皮下注射他克莫司 (1 mg/kg)，損傷組大鼠以相同方法給予生理鹽水，正常組大鼠未作任何處理。動(dòng)物分籠標(biāo)記，統(tǒng)一喂養(yǎng)。 1.2 Western blotting 檢測(cè) HGF 的表達(dá) 分別于術(shù)后 1、7、14 d 切取損傷組和治療組大鼠脊髓組織，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)取 5 只。大鼠經(jīng)腹腔內(nèi)麻醉后，暴露雙側(cè)坐骨神經(jīng)，循神經(jīng)根逆行追蹤暴露與之相連的 L46節(jié)段脊髓，切取該段脊髓組織，加入裂解液冰上孵育并徹底勻漿，12 000 r/min 離心 20 min 后留取上清，考馬斯亮藍(lán) G-250 法測(cè)定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，全濕式電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5 % 脫脂奶粉封閉

10、1 h 后加入兔抗鼠 HGF 多克隆抗體 (武漢博士德生物工程公司)，內(nèi)參為兔抗鼠肌動(dòng)蛋白，4 孵育過(guò)夜。TBST 溶液 (含 0.1 % Tween20 的 TBS) 洗滌 10 min × 3 次，加入辣根過(guò)氧化物酶 (HRP) 標(biāo)記的羊抗兔 IgG (北京中山生物公司)，37 孵育 60 min，TBST 洗膜 10 min × 3 次，二氨基聯(lián)苯胺 (DAB) 顯色，結(jié)果以目的條帶灰度值與同一樣本肌動(dòng)蛋白灰度值的比率來(lái)表示。正常組隨機(jī)取 5 只大鼠于第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)與其余兩組一起取材檢測(cè)。 1.3 免疫熒光染色檢測(cè) HGF 的分布 1.3.1 標(biāo)本取材及準(zhǔn)備 以 Wes

11、tern blotting 結(jié)果得出的 HGF 表達(dá)高峰時(shí)間確定免疫熒光染色觀察時(shí)間點(diǎn)為術(shù)后 7 d，每組取 5 只大鼠。大鼠經(jīng)腹腔內(nèi)麻醉后開(kāi)胸，將 11 號(hào)針頭從左心室插至升主動(dòng)脈，右心房開(kāi)一小口。先以生理鹽水 250 ml 行主動(dòng)脈灌注，待流出液體變清后再以 4 % 多聚甲醛灌注 30 min。同法切取 L46節(jié)段脊髓，置于 4 % 多聚甲醛后固定 2 h，繼而轉(zhuǎn)入含 20 % 蔗糖的磷酸緩沖液 (PBS) 中 4 冰箱內(nèi)過(guò)夜，至標(biāo)本沉底。20 恒冷箱切片機(jī)中連續(xù)橫向切片，片厚 10 m。 1.3.2 免疫熒光染色 從各組術(shù)后 7 d 每只大鼠的冰凍切片中隨機(jī)抽取，4 % 多聚甲醛 37

12、固定 15 min，PBS 漂洗 5 min × 3 次，3 % 小牛血清白蛋白 (BSA) 37 封閉 1 h，滴加兔抗鼠 HGF 多克隆抗體 (武漢博士德生物工程公司)，以 PBS 代替一抗作陰性對(duì)照，置于濕盒內(nèi) 4 孵育過(guò)夜，PBS漂洗后，滴加異硫氰酸四甲基羅丹明 (TRITC) 標(biāo)記的羊抗兔 IgG (北京中山生物公司)，37 避光孵育 60 min 后 PBS 漂洗 5 min × 3 次，含有防淬滅劑的 50 % 甘油磷酸緩沖液封片，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。 1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用統(tǒng)計(jì)分析軟件 SPSS 12.0 進(jìn)行處理，計(jì)量資料以 ± s 表示，組

13、間比較用單因素方差分析 (OneWay ANOVA)，P< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2 結(jié) 果 2.1 Western blotting 分析 HGF 在正常脊髓中有表達(dá)，其 鏈的相對(duì)分子質(zhì)量約為 69 000，與理論值相一致 (圖 1)。坐骨神經(jīng)損傷后脊髓組織中 HGF 的表達(dá)并未隨時(shí)間升高，術(shù)后 1、7、14 d 時(shí)的灰度值比值與正常組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。應(yīng)用他克莫司治療后，相應(yīng)脊髓組織中 HGF 的表達(dá)呈明顯時(shí)間依賴(lài)性升高，術(shù)后 7 d 達(dá)峰值，14 d 仍有較明顯表達(dá)。治療組的灰度值比值與損傷組、正常組相比在術(shù)后 7、14 d 時(shí)

14、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05，P<0.01)(表 1)。表1 大鼠脊髓組織中 HGF 的表達(dá)變化 2.2 免疫熒光染色 在三組大鼠脊髓組織切片中均觀察到免疫熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞。在脊髓前角的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元內(nèi)有明顯的 HGF 陽(yáng)性熒光染色，主要分布于神經(jīng)元胞體和部分突起中，在灰質(zhì)中間帶和后角也可見(jiàn)有陽(yáng)性熒光染色的神經(jīng)元，熒光染色強(qiáng)度由弱至強(qiáng)不等，廣泛分布于灰質(zhì)-層大、中、小各類(lèi)神經(jīng)元的胞質(zhì)及突起中。正常組大鼠脊髓組織切片顯示，HGF 在正常脊髓中有恒定表達(dá)，但坐骨神經(jīng)損傷后 HGF 的表達(dá)并無(wú)明顯變化，其陽(yáng)性染色神經(jīng)元的數(shù)目及熒光強(qiáng)度并未增加。應(yīng)用他克莫司治療后 HGF

15、的表達(dá)增強(qiáng)，陽(yáng)性染色神經(jīng)元的數(shù)量多于損傷組 (圖 24)，與 Western blotting 的檢測(cè)結(jié)果相一致。圖2 正常大鼠脊髓組織中 HGF 的表達(dá) (免疫熒光染色，×200) 圖3 術(shù)后 7 d，損傷組大鼠脊髓組織中 HGF 的表達(dá) (免疫熒光染色，×200) 圖4 術(shù)后 7 d，治療組大鼠脊髓組織中 HGF 的表達(dá) (免疫熒光染色，×200) 3 討 論 周?chē)窠?jīng)損傷后的成功再生涉及一系列復(fù)雜的病理生理過(guò)程，其中 Fansa 等3將損傷神經(jīng)元胞體的存活列為首要因素。而神經(jīng)元作為一個(gè)整體，胞體與軸突之間的聯(lián)系是十分密切的，軸突損傷實(shí)質(zhì)上是一種細(xì)胞損傷，必然

16、會(huì)累及相應(yīng)的神經(jīng)元胞體，而神經(jīng)元的功能狀態(tài)也必將會(huì)影響軸突的再生及功能的恢復(fù)。因此，周?chē)窠?jīng)損傷后再生治療重點(diǎn)已經(jīng)從局部外科修復(fù)，發(fā)展到采用多因子、多因素防止神經(jīng)元胞體、神經(jīng)纖維、效應(yīng)器的變性，來(lái)保護(hù)損傷神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)再生。臨床廣泛應(yīng)用的免疫抑制劑他克莫司已被證實(shí)具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用4。在大鼠坐骨神經(jīng)切斷縫合術(shù)后局部應(yīng)用他克莫司緩釋膜片可保護(hù)脊髓神經(jīng)元免遭凋亡1。亦有文獻(xiàn)報(bào)道，他克莫司在體外可促進(jìn)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元軸突的延伸5。目前關(guān)于此種神經(jīng)保護(hù)藥物用于周?chē)窠?jīng)損傷修復(fù)的研究中，往往關(guān)注的是其在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械闹委熜Ч?，而他克莫司若要真正?yīng)用于臨床，尚需要從分子生物學(xué)的角度闡明其作用機(jī)制，

17、而明確誘導(dǎo)內(nèi)源性 HGF 的表達(dá)上調(diào)是否構(gòu)成周?chē)窠?jīng)損傷后他克莫司發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的因素之一則正是本研究意義所在。 HGF是由6.845萬(wàn)u 的 鏈和3.373萬(wàn)u 的 鏈組成的異二聚體蛋白，最初被鑒定為一種強(qiáng)大的原代肝細(xì)胞的絲裂原，現(xiàn)證實(shí)也是一種新的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，通過(guò)自分泌、旁分泌及經(jīng)典的軸突運(yùn)輸方式與特異性酪氨酸激酶受體 cMet 結(jié)合發(fā)揮其活性，在體內(nèi)和體外對(duì)中樞及周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)的多種神經(jīng)元具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用6。研究發(fā)現(xiàn) HGF 參與大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的發(fā)育過(guò)程，促進(jìn)軸突生長(zhǎng)及神經(jīng)元存活2。在正常生理?xiàng)l件下，HGFcMet 自分泌和/或旁分泌機(jī)制為脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元提供局部直接的營(yíng)養(yǎng)支持7。本實(shí)驗(yàn)

18、Western blotting 分析證實(shí)，正常脊髓中存在 HGF 的恒定表達(dá)，免疫熒光染色則顯示 HGF 主要分布于灰質(zhì) -層神經(jīng)元的胞質(zhì)及突起中，與國(guó)外學(xué)者8的報(bào)道相符，說(shuō)明脊髓前角、灰質(zhì)中間帶及后角神經(jīng)元在生理狀態(tài)下均合成 HGF，其營(yíng)養(yǎng)作用對(duì)于維持神經(jīng)元自身存活及行使正常生理功能是必需的。 盡管研究表明在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷2或缺血9等病理狀態(tài)下，HGF 在損傷周?chē)鷧^(qū)域表達(dá)上調(diào)，在脊髓損傷后再生和腦組織缺血后修復(fù)過(guò)程中起著關(guān)鍵性作用。但本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，損傷組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn) HGF 的表達(dá)與正常組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即坐骨神經(jīng)損傷后脊髓組織中 HGF 的合成并未增加。這一結(jié)果與 Hashim

19、oto 等8的報(bào)道一致。他們的研究顯示在脊髓和背根神經(jīng)節(jié)均檢測(cè)到 HGF mRNA，而坐骨神經(jīng)結(jié)扎并未改變其表達(dá)，與作者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互印證，除說(shuō)明周?chē)窠?jīng)損傷對(duì)中樞神經(jīng)元 HGF 表達(dá)的影響不同于中樞神經(jīng)系統(tǒng)本身的損傷外，也提示：對(duì)周?chē)窠?jīng)的傷害性刺激不足以啟動(dòng)內(nèi)源性 HGFcMet 系統(tǒng)來(lái)挽救損傷神經(jīng)元和防止軸突變性，而是需要通過(guò)其他途徑來(lái)上調(diào)周?chē)窠?jīng)損傷后 HGF 的表達(dá)。 鑒于神經(jīng)損傷后內(nèi)源性 HGF 的表達(dá)匱乏，人們致力于將重組 HGF 蛋白或病毒載體 HGF 基因轉(zhuǎn)移入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，期望外源性 HGF 能對(duì)受損神經(jīng)元起到神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用。如 Hayashi 等6在成年大鼠脊神經(jīng)根撕脫傷后

20、應(yīng)用重組腺病毒載體編碼的 hHGF 基因轉(zhuǎn)移防止運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的死亡。但上述方法由于重組蛋白的半衰期較短及血神經(jīng)屏障的存在，實(shí)際治療效果并不盡人意；病毒載體基因轉(zhuǎn)移具有潛在的危險(xiǎn)性，如產(chǎn)生免疫應(yīng)答，與病毒感染相關(guān)的各種毒副作用等都限制了其廣泛應(yīng)用，因此尋找新的以促進(jìn)內(nèi)源性 HGF 合成為靶點(diǎn)的治療策略成為研究熱點(diǎn)。本研究治療組的結(jié)果顯示，神經(jīng)損傷后皮下注射他克莫司可上調(diào)脊髓組織中 HGF 的表達(dá)，傷后7 d 達(dá)高峰，持續(xù)至傷后 14 d 仍較損傷組有明顯升高，表明他克莫司可有效誘導(dǎo)內(nèi)源性 HGF 的高表達(dá)，這可能是周?chē)窠?jīng)損傷后他克莫司發(fā)揮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用的因素之一。在此，他克莫司充當(dāng)了促進(jìn)

21、 HGF 合成的啟動(dòng)因子，而上調(diào)的 HGF 又可通過(guò)自身正反饋機(jī)制促進(jìn)損傷部位 HGF 的合成，與特異性受體結(jié)合發(fā)揮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用，從而保護(hù)相應(yīng)神經(jīng)元，誘導(dǎo)近側(cè)殘端或中樞神經(jīng)元軸突再生，重建神經(jīng)環(huán)路；同時(shí) HGF 也是一種高效的血管生成因子，通過(guò)軸突運(yùn)輸?shù)竭_(dá)損傷部位，介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化，促進(jìn)微血管形成10，為再生過(guò)程提供良好的微循環(huán)，這對(duì)神經(jīng)再生有著重要的意義。 本研究揭示了坐骨神經(jīng)損傷后內(nèi)源性 HGF 在脊髓組織中的表達(dá)、分布及時(shí)間變化規(guī)律，并從中樞神經(jīng)元的角度闡明了他克莫司通過(guò) HGF 促進(jìn)周?chē)窠?jīng)再生的機(jī)制，為臨床應(yīng)用他克莫司治療周?chē)窠?jīng)損傷進(jìn)一步的提供了理論依據(jù)。【參考文獻(xiàn)】 1 張

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