服務(wù)內(nèi)容和要求

1、服務(wù)內(nèi)容和要求（一） 服務(wù)內(nèi)容 對560株細(xì)菌進(jìn)行全基因組DNA序列框架圖測定，獲得基因組序列，后期通過生物信息學(xué)分析找到每株菌株所含有的功能基因。（二）服務(wù)要求1、測序要求使用Illumina Novaseq測序平臺進(jìn)行測序，測序讀長為2X150bp，進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA序列測定。由于本項(xiàng)目是框架圖測序，因此所建文庫為350bp小片段文庫，測序質(zhì)量Q20 95%、Q30 90%。2、測序深度為每個(gè)樣本不低于100X的測序深度。3、在收到每批樣本并質(zhì)檢合格后，保證每一批次樣本在30個(gè)自然日內(nèi)完成項(xiàng)目內(nèi)容?？傆?jì)560株樣本需在40個(gè)工作日內(nèi)完成項(xiàng)目內(nèi)容。4、要求操作人員有嚴(yán)格的培訓(xùn)和評估并且有嚴(yán)

2、格的流程管理。 5、數(shù)據(jù)分析過程要求5.1數(shù)據(jù)質(zhì)控及產(chǎn)出統(tǒng)計(jì)5.2框架圖初步組裝5.3框架圖組裝結(jié)果情況的評估5.4框架圖基因組組分分析（1）編碼基因預(yù)測（2）重復(fù)序列（3）非編碼RNA預(yù)測（4）基因島（5）前噬菌體（6）CRISPR5.5 通用基因功能注釋(NR、GO、COG、KEGG、Pfam、SwissProt)5.6 病原細(xì)菌致病性和耐藥性分析（適用于病原菌）（1）分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白預(yù)測(革蘭氏陰性菌)（2）病原與宿主互作數(shù)據(jù)庫（PHI）注釋（3）細(xì)菌致病菌毒力因子（VFDB）注釋（4）耐藥基因（ARDB、CARD）注釋（5）信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)及分泌蛋白預(yù)測（6）次級代謝產(chǎn)物基因簇注釋（7

3、）膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白數(shù)據(jù)庫（TCDB）注釋5.7 細(xì)菌群體多樣性分析（1）ANI分析（2）群體系統(tǒng)進(jìn)化樹分析（3）群體PCoA分析（三）驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn) 1、每個(gè)樣品的測序總數(shù)據(jù)量達(dá)到1G以上。2、每個(gè)樣品的測序深度不低于100X的測序深度。3、原始數(shù)據(jù)的測序質(zhì)量Q20 95%、Q30 90%。4、采用SOAP denovo，SPAdes和ABySS三個(gè)軟件同時(shí)進(jìn)行組裝，并優(yōu)化到最優(yōu)組裝結(jié)果。5、框架圖基因組組分分析（1）編碼基因預(yù)測：使用GeneMarkS軟件對新測序的基因組進(jìn)行編碼基因預(yù)測。（2）重復(fù)序列：通過RepeatMasker軟件進(jìn)行散在重復(fù)序列預(yù)測，TRF（Tandem Repeats Find

4、er,）搜尋DNA序列中的串聯(lián)重復(fù)序列。（3）非編碼RNA預(yù)測tRNA：通過tRNAscan-SE軟件對tRNA進(jìn)行預(yù)測；rRNA：一是通過與近緣參考序列的rRNA庫比對，二是用rRNAmmer軟件預(yù)測；sRNA：首先進(jìn)行Rfam database的比對注釋，接著用cmsearch程序確定最終的sRNA。（4）基因島：基于序列組成，采用IslandPath-DIOMB軟件預(yù)測基因島，其通過檢測序列中二核苷酸偏向性（phylogentically bias）和移動(dòng)性基因（mobility genes，如轉(zhuǎn)座酶或整合酶）以判定基因島以及潛在的水平基因轉(zhuǎn)移。（5）前噬菌體：通過phiSpy軟件預(yù)測樣

5、品基因組上的前噬菌體。（6）CRISPR：利用CRISPRdigger對樣品基因組進(jìn)行CRISPR預(yù)測。6 通用基因功能注釋，包括：NR、GO、COG、KEGG、Pfam、SwissProt。7 病原細(xì)菌致病性和耐藥性分析（1）分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白預(yù)測(革蘭氏陰性菌)使用SignalP、TMHMM工具進(jìn)行預(yù)測，檢測是否含有信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)，綜合預(yù)測蛋白序列是否是分泌蛋白。（2）病原與宿主互作數(shù)據(jù)庫（PHI）注釋該數(shù)據(jù)庫中的每個(gè)基因都包含核酸和氨基酸序列，以及感染宿主過程中預(yù)測的蛋白功能的詳細(xì)描述。（3）細(xì)菌致病菌毒力因子（VFDB）注釋使用 Diamond 軟件，把目標(biāo)物種的氨基酸序列，與VFDB

6、數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，把目標(biāo)物種的基因和其相對應(yīng)的毒力因子功能注釋信息結(jié)合起來，得到注釋結(jié)果。（4）耐藥基因（ARDB、CARD）注釋使用Diamond軟件，把目標(biāo)物種的氨基酸序列，與ARDB數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，把目標(biāo)物種的基因和其相對應(yīng)的耐藥功能注釋信息結(jié)合起來，得到注釋結(jié)果。（5）信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)及分泌蛋白預(yù)測使用信號肽預(yù)測工具 SignalP 進(jìn)行預(yù)測，檢測是否含有信號肽及跨膜結(jié)果，綜合預(yù)測 蛋 白序列是否是分泌蛋白。 （6）次級代謝產(chǎn)物基因簇注釋采用antiSMASH程序?qū)蚪M進(jìn)行預(yù)測。（7）膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白數(shù)據(jù)庫（TCDB）注釋TCDB，全稱是Transporter Classification Database，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分類數(shù)據(jù)庫，是膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，包括離子通道（ion channels）的分類系統(tǒng)（TC system）。TCDB數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)移系統(tǒng)以5個(gè)級別進(jìn)行分類。8.細(xì)菌群體多樣性分析（1）ANI分析將其中一個(gè)基因組序列依次打斷成 1020bp 的片段，將這些片段與另一基因組進(jìn)行 blastn 比對，選出每個(gè)片段最好的比對結(jié)果。進(jìn)一步篩選 identity 大于等于 30%，alignment 長度大于等于 70%的片段，這些結(jié)果identity 的平均值即為 ANI 值。（2