實時熒光PCR和RT

1、實時熒光PCR和RT                 作者：劉建軍，古麗巴哈爾，陽 帆，陳家敏，何雅青，楊 洪【摘要】 目的 通過2種檢測登革病毒方法的比較，以提高檢測登革病毒的靈敏度和特異性。方法 利用Taqman MGB技術，根據登革病毒3端非編碼區(qū)的一段高度保守序列，設計登革14型熒光PCR通用引物和TaqmanMGB探針，以登革熱毒株作為標準，以乙腦毒株作對照，建立實時熒光PCR檢測登革病毒的快速方法。并對10份ELISA法檢測

2、陽性的臨床血清標本進行RT-PCR及熒光PCR擴增。結果 RT-PCR檢測10份臨床血清標本，2份陽性，陽性率為20%。實時熒光PCR檢測登革病毒與乙腦病毒無交叉反應，檢測10份臨床血清標本，5份陽性，陽性率為50。從RNA提取到檢測結果僅需4h。結論 Taqman MGB實時PCR檢測方法快速、敏感性高、特異性強，可作為登革病毒的快速檢測方法，應用于登革熱的臨床早期診斷?！娟P鍵詞】 登革病毒；RT-PCR；Taqman GMB實時PCR【Abstract】 Objective In order to improve the sensitivity and specificity of det

3、ecting dengue viruses， two methods for detecting dengue viruses were compared.Methods Using Taqman MGB technique， a pair of universal primers and Taqman MGB probe were designed according to a highly reserved sequence of the 3-noncoding region of dengue viruses type 1-4. Dengue virus strains were use

4、d as standard and Japanese encephalitis virus strains were used as control， the real-time PCR assay for specific and sensitive detection of the dengue viruses was established. While 10 serum specimens of ELISA positive were detected by the RT-PCR and fluorescent PCR.Results There was no cross-reacti

5、on with Japanese encephalitis virus. Of 10 specimens， 2 was positive by RT-PCR and 5 was positive by real-time PCR. The test could be completed in 4 hours.Conclusion The Taqman MGB real-time PCR assay was fast， sensitive and specific. It could be applied to the quick early diagnosi (此 資 料 轉 貼 于 ) s

6、of dengue viruses.【Abstract】 dengue virus；RT-PCR；Taqman GMB real-time PCR登革熱是流行于熱帶、亞熱帶地區(qū)的一種急性蟲媒傳染病，其病原體為登革病毒，近年來隨著全球氣候變暖和國際旅游的增多，登革病毒感染呈擴大蔓延之勢，發(fā)病率不斷升高。由于缺乏疫苗和有效的防治措施，因此對該疾病實行早期診斷十分必要。登革病毒屬于黃病毒科黃病毒屬， 為單股正鏈病毒，基因組長約11。依抗原性不同分為1、2、3、4四個血清型(14)1，2。登革病毒感染的實驗室診斷，傳統方法是從患者血清中分離病毒，或用血清學方法檢測病毒的特異性抗體。但病毒分離費時，檢測

7、血清抗體需分別在患者感染的急性期及恢復期采集雙份血清， 同時存在廣泛的交叉反應而受到干擾3，這些均不利于疾病的早期診斷。近年來國內外均有報道應用RT-PCR檢測登革熱病毒4，但RT-PCR方法容易造成污染，同時也存在從臨床血清標本中檢測登革病毒敏感性不夠的問題。這就需要建立一種更敏感、特異和快速的檢測鑒定方法，以實現對登革熱患者的早期快速診斷，為預防控制登革熱的流行贏得時間。本研究比較了利用TaqmanMGB探針技術的實時熒光PCR和RT-PCR方法檢測登革病毒特異性，以期選擇特異性好、靈敏度高的檢測方法，達到快速診斷登革熱的目的。1 材料與方法1.1 毒株及血清標本 登革病毒14型標準株由廣

8、東省疾病預防控制中心提供，乙腦病毒疫苗株、乙腦病毒強毒株由成都生物制品所提供。血清標本采自深圳市近幾年發(fā)病2周內的疑似登革熱病人和發(fā)病10天內的疑似乙腦病人，-80保存。1.2 主要試劑 病毒RNA提取試劑盒為Roche公司產品，TaqDNA聚合酶、PCRbuffer、MgCl2、隨機引物購自Invitrogen公司，dNTP購自上海生工公司， AMV逆轉錄酶、RNaseinhibitor購自大連寶生物公司，引物和熒光探針由上?；瞪锛夹g有限公司合成及標記，并用聚丙烯酰胺凝膠電泳純化。1.3 主要儀器設備 Centrifuge 5415D臺式高速離心機購自德國Eppendorf公司， Ult

9、rospec 2000紫外可見光蛋白核酸分析儀購自美國GE公司， 9700基因擴增儀購自美國ABI公司，Gene Genius凝膠成像分析系統購自英國Syngene公司， Mx4000熒光PCR儀購自美國Stratagene公司。1.4 引物及探針設計 在GeneBank上檢索登革病毒4個血清型中都一致的高度保守序列，根據登革病毒(DEN)聚合蛋白基因的一段高度保守序列，設計登革14型RT-PCR通用引物，擴增片段長度為511bp。根據DEN 3端非編碼區(qū)的一段高度保守序列，設計登革14型熒光PCR通用引物和Taqman探針，探針5用FAM報告熒光基團標記，3用MGB淬滅熒光基團標記，擴增片段

10、長度為68bp。登革病毒RT-PCR通用引物：Den-D1： 5 TGAATATGCTGAA (此 資 料 轉 貼 于 ) ACGCGCGAGAAACCG3Den-D2： 5 TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC3登革病毒熒光PCR通用引物：Den-FP： 5 GCATATTGACGCTGGGAGAGA3Den-RP： 5GGCGTTCTGTGCCTGGAAT3登革病毒通用探針：Den-Probe：5 FAMCAGAGATCCTGCTGTCTCMGB3引物和探針均由上?；瞪锛夹g有限公司合成及標記。1.5 病毒RNA提取 14型登革病毒標準株用1640培養(yǎng)液溶解，接種C

11、6/36細胞，傳代次，按病毒RNA提取試劑盒說明書操作，提取病毒RNA，RNA置-80保存?zhèn)溆谩?.6 反轉錄及普通PCR RNA逆轉錄 反應總體積為20l，在反應管內依次加入：5×緩沖液5l，2.5mmol/L 4×dNTP 1l，0.3g/l Random（Invitrogen公司生產）引物1l，提取的RNA 12l，AMV逆轉錄酶（10u/l）1l混勻。反應條件為：42 60min95加熱5min4保存。然后將產物放置于-20備用。 PCR擴增 反應總體積為20l，在反應管內依次加入：10×緩沖液2l，2.5mmol/L，4×dNTP 1l，25m

12、mol/LMgCl2 2.5l，通用引物D1、D2（5mol/L）各1l，RT產物0.5l（型，型，型）、2l（型，血清標本，陰性對照），Taq酶（5u/l） 0.25l，加H2O補足體系。反應條件為：94 5min94 30s，60 30s，72 30s，循環(huán)40次72延伸10min4保存。 擴增產物電泳分析 配制含溴乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠，取10lPCR產物電泳，在凝膠成像儀上觀察并照相記錄實驗結果。1.7 實時熒光PCR 反應總體積為25l，在反應管內依次加入：10×緩沖液2l，10mmol/L 4×dNTP 0.75l，50mmol MgCl2/L 2.5l，引物

13、Den-FP，Den-RP（10mol/L）各0.5l，探針Den-probe（5mol/L）0.6l，RT產物0.5l（型，型，型）、2l（型，血清標本，陰性對照），Taq酶（5u/l）0.25l，加H2O補足25l體系。反應條件是：50 2min95 10min95 30s60 30s，循環(huán)40次4保存。采用MX4000實時熒光PCR擴增儀進行擴增，延伸階段檢測熒光。2 結果2.1 普通RT-PCR檢測結果 14型登革病毒標準株、10份發(fā)病2周內疑似登革病毒感染病人血清，其IgM、 IgG檢測為陽性，乙腦病毒疫苗株、乙腦病毒強毒株進行RT-PCR檢測，在511bp處14型登革病毒標準株都出

14、現了目的基因條帶，10份疑似登革病毒感染病人血清只有2份出現目的基因條帶，其他標本都為陰性，見圖1。說明此RT-PCR檢測體系具有良好的特異性。注： DNA分子質量標準；14分別為型登革毒株；513血清標本（其中5和8為同一標本）；14、15為乙腦病毒對照；-為空白對照     2.2 登革病毒Taqman MGB PCR體系檢測結果 有效性檢驗 按1.7方法，分別提取登革病毒14標準株RNA，進行反轉錄的實時PCR，14型均觀察到熒光信號增強。 特異性分析 登革病毒14標準株、乙腦病毒疫苗株、乙腦病毒強毒株經TaqmanMGB體系檢測，只有登革病毒14

15、標準株觀察到熒光信號增加外，乙腦病毒疫苗株、乙腦病毒強毒株均沒有熒光增加信號，見圖2。這證明了此TaqmanMGB檢測體系的特異性。 登革病毒TaqmanMGB PCR檢測體系的應用 用型登革病毒作為陽性對照，對10份發(fā)病2周內疑似登革病毒感染病人血清，其IgM、 IgG檢測為陽性，8份發(fā)病10天內疑似乙腦病毒感染病人血清作為對照，其IgM、 IgG檢測為陽性。進行TaqmanMGB PCR檢測，結果只有5份疑似登革病毒感染病人血清出現熒光信號增加，其他血清標本均無熒光信號。見圖3。注：1、2、3、4分別為、登革病毒標準株圖3 血清標本熒光PCR檢測結果3 討論Taqman探針是一條與病原體核

16、酸特異性結合的熒光素標記探針，它的結合位點位于普通PCR的2條引物之間5。探針的5端和3端分別標記報告熒光基團和淬滅熒光基團，PCR擴增在加入一對引物的同時加入熒光探針，探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收。PCR擴增時， Taq酶發(fā)揮它的53的外切酶功能，將探針切成單核苷酸，5端發(fā)出的熒光信號不再被3端所吸收而能被儀器檢測到。每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。因此，隨著PCR產物的不斷增加，儀器所檢測到的熒光信號越來越強。當標本中不含病原體時，PCR反應不發(fā)生，不產生熒光信號，其擴增曲線為一水平線。TaqmanMGB探針是在T

17、aqman原理基礎上提出的6。TaqmanMGB探針的突出優(yōu)點是實驗優(yōu)化、步驟簡單，提高了配對與非配對模板間的Tm值差異，由于在探針的3端的淬滅基團為不發(fā)光的熒光基團，并且與報告基團在空間位置更接近，使雜交的穩(wěn)定性和重復性大大提高，實驗的結果更精確，分辨率更高。筆者在TaqmanMGB技術基礎上，建立了實時PCR檢測14型登革病毒的方法。上述研究結果表明：（1）本檢測方法可靠性好、敏感性高，比普通PCR方法靈敏度提高30%，可檢測發(fā)病10天內的臨床血清標本，而傳統的登革病毒分離方法要求發(fā)病5天內的標本，才有可能分離出陽性。（2）特異性強，收集熒光在較高的退火溫度(60)進行，排除了模板的非特異

18、性擴增，同時，與容易造成血清學交叉反應的乙腦病毒及其臨床標本都無交叉反應，可用于登革病毒特異性的實時PCR檢測。（3）操作簡單，結果觀察直觀明了，采用閉管檢測和熒光技術，避免了普通PCR方法容易產生交叉污染而發(fā)生非特異性擴增的缺陷，并可防止病毒擴散及環(huán)境污染，以及強致癌物溴乙錠對操作人員的危害。（4）快速。傳統的登革病毒分離方法耗時較長，至少需半個月，而本方法所需時間僅4h，比傳統方法大為縮短，適用于登革病毒的快速準確的檢測。                              virus， rift valley fever virus， dengue virus， and yellow f