血球計(jì)數(shù)板的使用說(shuō)明

1、關(guān)于血球計(jì)數(shù)板的使用及問(wèn)題討論摘要：培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化是新課標(biāo)教材“必修3：穩(wěn)態(tài)與環(huán)境”中的學(xué)生分組實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)需要測(cè)定酵母菌細(xì)胞數(shù)量，教材采用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法，需要學(xué)生學(xué)會(huì)使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。但是該計(jì)數(shù)方法，對(duì)高中教師來(lái)說(shuō)，比較陌生，對(duì)學(xué)生而言，使用的難度較大。本文通過(guò)結(jié)合培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化這一實(shí)驗(yàn)，對(duì)血球計(jì)數(shù)板的使用原理和操作步驟、方法等進(jìn)行詳細(xì)地介紹，并分析有關(guān)血球計(jì)數(shù)板的命題。關(guān)鍵詞：血球計(jì)數(shù)板 使用原理、方法 問(wèn)題討論一、血球計(jì)數(shù)板的使用原理顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是將小量待測(cè)樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上（又稱(chēng)計(jì)菌器），于顯微鏡下

2、直接計(jì)數(shù)，然后推算出含菌數(shù)的一種方法。血球計(jì)數(shù)板是常用的計(jì)菌器之一。血球計(jì)數(shù)板是一種專(zhuān)門(mén)用于計(jì)算較大單細(xì)胞微生物的一種儀器，由一塊比普通載玻片厚的特制玻片制成的玻片中有四條下凹的槽，構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)。中間的平臺(tái)較寬，其中間又被一短橫槽隔為兩半，每半邊上面刻有一個(gè)方格網(wǎng)。方格網(wǎng)上刻有9個(gè)大方格，其中只有中間的一個(gè)大方格為計(jì)數(shù)室。這一大方格的長(zhǎng)和寬各為1mm，深度為0.1mm,其容積為0.1mm3，即1mm1mm0.1mm方格的計(jì)數(shù)板；大方格的長(zhǎng)和寬各2mm,深度為0.1mm,其容積為0.4mm3，即2mm2mm0.1mm方格的計(jì)數(shù)板。在血球計(jì)數(shù)板上，刻有一些符號(hào)和數(shù)字(見(jiàn)圖一)，其含義是：XB-K-

3、25為計(jì)數(shù)板的型號(hào)和規(guī)格，表示此計(jì)數(shù)板分25個(gè)中格；0.1mm為蓋上蓋玻片后計(jì)數(shù)室的高；1/400mm2表示計(jì)數(shù)室面積是1mm2，分400個(gè)小格，每小格面積是1/400 mm2。計(jì)數(shù)室通常也有兩種規(guī)格：一種是1625型，即大方格內(nèi)分為16中格，每一中格又分為25小格；另一種是2516型，即大方格內(nèi)分為25中格，每一中格又分為16小格。但是不管計(jì)數(shù)室是哪一種構(gòu)造，它們都有一個(gè)共同的特點(diǎn)，即每一大方格都是1625=2516=400個(gè)小方格組成。11625型的計(jì)數(shù)板 將計(jì)數(shù)室放大，可見(jiàn)它含16中格，一般取四角：1、4、13、16四個(gè)中方格（100個(gè)小方格）計(jì)數(shù)（見(jiàn)圖二）。將每一中格放大，可見(jiàn)25個(gè)小

4、格。計(jì)數(shù)重復(fù)3次，取其平均值。計(jì)數(shù)完畢后，依下列公式計(jì)算：酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)1mL=100個(gè)小方格細(xì)胞總數(shù)/100 40010000稀釋倍數(shù)22516型的計(jì)數(shù)板 中央大方格以雙線(xiàn)等分成25個(gè)中方格，每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格，供細(xì)胞計(jì)數(shù)用（見(jiàn)圖三）。一般計(jì)數(shù)四個(gè)角和中央的五個(gè)中方格（80個(gè)小方格）的細(xì)胞數(shù)。計(jì)數(shù)重復(fù)3次，取其平均值。計(jì)數(shù)完畢后，依下列公式計(jì)算：酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)1mL 80個(gè)小方格細(xì)胞總數(shù)/80 40010000稀釋倍數(shù) c d血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造（三）（2516）a頂面觀(guān) b側(cè)面觀(guān) c放大后的網(wǎng)格 d放大后的計(jì)數(shù)室二、血球計(jì)數(shù)板的使用方法步驟1鏡檢計(jì)數(shù)室。在加樣前，先對(duì)計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡

5、檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)。2加樣品。將清潔干燥的血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室上加蓋專(zhuān)用的蓋玻片，用吸管吸取稀釋后的酵母菌懸液，滴于蓋玻片邊緣，讓培養(yǎng)液自行緩緩滲入，一次性充滿(mǎn)計(jì)數(shù)室，防止產(chǎn)生氣泡，充入細(xì)胞懸液的量以不超過(guò)計(jì)數(shù)室臺(tái)面與蓋玻片之間的矩形邊緣為宜。多余培養(yǎng)液可用濾紙吸去。3計(jì)數(shù)。稍待片刻（約5min），待酵母菌細(xì)胞全部沉降到計(jì)數(shù)室底部后，將計(jì)數(shù)板放在載物臺(tái)的中央，先在低倍鏡下找到計(jì)數(shù)室所在位置后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀(guān)察、計(jì)數(shù)并記錄。三、血球計(jì)數(shù)板的使用注意事項(xiàng)培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化實(shí)驗(yàn)是一個(gè)歷時(shí)較長(zhǎng)（7天左右）的實(shí)驗(yàn)，事前一定要做好周密的計(jì)劃，定程序、定時(shí)間、定人員。每天

6、采用抽樣檢測(cè)法使用血球計(jì)數(shù)板對(duì)酵母菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，在計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)從以下幾方面注意：1每天同一時(shí)間，各組取出本組的試管，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)酵母菌個(gè)數(shù)，并作記錄，連續(xù)觀(guān)察7天。2從試管中吸出培養(yǎng)液進(jìn)行計(jì)數(shù)之前，要將試管輕輕震蕩幾下，這樣使酵母菌分布均勻，防止酵母凝聚沉淀，提高計(jì)數(shù)的代表性和準(zhǔn)確性，求得的培養(yǎng)液中的酵母菌數(shù)量誤差小。3如果一個(gè)小方格內(nèi)酵母菌過(guò)多，難以數(shù)清，應(yīng)當(dāng)對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋以便于酵母菌的計(jì)數(shù)。具體方法是：搖勻試管，取1mL酵母菌培養(yǎng)液，加入成倍的無(wú)菌水稀釋?zhuān)♂宯倍后，再用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，所得數(shù)值乘以稀釋倍數(shù)。以每小方格內(nèi)含有45個(gè)酵母細(xì)胞為宜。特別是在培養(yǎng)后期的樣液需要稀釋后計(jì)數(shù)。4活酵母

7、有芽殖現(xiàn)象，若芽體達(dá)到母細(xì)胞大小的一半時(shí)，即可作為兩個(gè)菌體計(jì)數(shù)，若芽體小于母細(xì)胞一半時(shí)為1個(gè)酵母細(xì)胞。5對(duì)于壓在方格界線(xiàn)上的酵母菌應(yīng)當(dāng)計(jì)數(shù)同側(cè)相鄰兩邊上的菌體數(shù)，一般可采取“數(shù)上線(xiàn)不數(shù)下線(xiàn)，數(shù)左線(xiàn)不數(shù)右線(xiàn)”的原則處理，另兩邊不計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí)，如果使用16格25格規(guī)格的計(jì)數(shù)室，要按對(duì)角線(xiàn)位，取左上、右上、左下、右下4個(gè)中格(即100個(gè)小格)的酵母菌數(shù)；如果規(guī)格為25格16格的計(jì)數(shù)板，除了取其4個(gè)對(duì)角方位外，還需再數(shù)中央的一個(gè)中格(即80個(gè)小方格)的酵母菌數(shù)。6計(jì)數(shù)一個(gè)樣品要從兩個(gè)計(jì)數(shù)室中計(jì)得的平均數(shù)值來(lái)計(jì)算，對(duì)每個(gè)樣品可計(jì)數(shù)三次，再取其平均值。計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)不時(shí)調(diào)節(jié)焦距，才能觀(guān)察到不同深度的菌體。按公式

8、計(jì)算每1ml（或10mL）菌液中所含的酵母菌個(gè)數(shù)。7血球計(jì)數(shù)板的清潔血球計(jì)數(shù)板使用后，用自來(lái)水沖洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干，或用95%的乙醇、無(wú)水乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑脫水使其干燥。通過(guò)鏡檢觀(guān)察每小格內(nèi)是否殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)清洗直到干凈為止四、關(guān)于血球計(jì)數(shù)板的命題由于實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化是新教材新增加的實(shí)驗(yàn)，在各地各類(lèi)命題中都關(guān)注了這一實(shí)驗(yàn)，并對(duì)血球計(jì)數(shù)板的使用進(jìn)行了命題設(shè)計(jì)。從近年來(lái)的各類(lèi)試題來(lái)看，試題考查的角度不同，大多數(shù)是關(guān)于細(xì)胞數(shù)量的計(jì)算，也有關(guān)于使用原理和方法的考查，但有的試題明顯與血球計(jì)數(shù)板的實(shí)際使用不相符。例1 在用血球計(jì)

9、數(shù)板（2mm2mm方格）對(duì)某一稀釋50倍樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)，發(fā)現(xiàn)在一個(gè)方格內(nèi)（蓋玻片下的培養(yǎng)液厚度為0.1mm）酵母菌平均數(shù)為16，據(jù)此估算10mL培養(yǎng)液中有酵母菌 個(gè)。（參考答案： 2107）例2 在“探究培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量的變化”實(shí)驗(yàn)中，某同學(xué)用顯微鏡觀(guān)察計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)血球計(jì)數(shù)板的小方格(2 mm2 mm)內(nèi)酵母菌數(shù)量的平均值為13個(gè)。假設(shè)蓋玻片下的培養(yǎng)液厚度為0.1 mm，那么10mL培養(yǎng)液中酵母菌的個(gè)數(shù)約為 個(gè)。 （參考答案：）A5.2104 B3.25105 C5.2103 D.3.25104解析一：例1例2兩題，均將整個(gè)計(jì)數(shù)室2mm2mm方格作為實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)的空間，并按照公式：a/41

10、05（稀釋倍數(shù)）來(lái)計(jì)算10mL培養(yǎng)液中的酵母菌的數(shù)量（a為所計(jì)數(shù)酵母菌的平均數(shù)）。與血球計(jì)數(shù)板的實(shí)際操作不相符，特別是例2中將2mm2mm的計(jì)數(shù)室當(dāng)成一個(gè)小方格了，存在有科學(xué)性錯(cuò)誤。例3 通常用血球計(jì)數(shù)板對(duì)培養(yǎng)液中酵母菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，若計(jì)數(shù)室為1mm1mm0.1mm方格，由400個(gè)小方格組成，如果一個(gè)小方格內(nèi)酵母菌過(guò)多，難以計(jì)數(shù)，應(yīng)先后再計(jì)數(shù)。若多次重復(fù)計(jì)數(shù)后，算得每個(gè)小方格中平均有5個(gè)酵母菌，則10mL該培養(yǎng)液中酵母菌總數(shù)有個(gè)。（參考答案：稀釋?zhuān)?108）解析二：例3設(shè)計(jì)了血球計(jì)數(shù)板的規(guī)格，還考查了血球計(jì)數(shù)板的使用方法，較例1例2更科學(xué)合理。根據(jù)公式：540010000102108。例4 檢測(cè)員將1 mL水樣稀釋10倍后，用抽樣檢測(cè)的方法檢測(cè)每毫升藍(lán)藻的數(shù)量；將蓋玻片放在計(jì)數(shù)室上，用吸管吸取少許培養(yǎng)液使其自行滲入計(jì)數(shù)室，并用濾紙吸去多余液體。已知每個(gè)計(jì)數(shù)室由2516400個(gè)小格組成，容納液體的總體積為01 mm3?，F(xiàn)觀(guān)察到圖中該計(jì)數(shù)室所示a、b、c、d、e