細胞培養(yǎng)技術

1、細 胞 培 養(yǎng) 原 理基礎技能n無菌操作技術： 用于防止微生物進入人體組織(外科手術)或其它無菌范圍的操作 技術稱為無菌操作。在各種生物實驗中，為了防止微生物生長和 繁殖影響實驗的進行，也要在無菌的環(huán)境下進行。n 要求：操作前將界面上的細菌和病毒等微生物殺滅 操作過程中界面與外界隔離，避免微生物的侵入操作環(huán)境,器具,試劑的滅菌/消毒操作過程規(guī)范 體外培養(yǎng)細胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定培養(yǎng)成功或 失敗的首要條件。即便使用設備完善的實驗室，若實驗者粗心大意， 技術操作不規(guī)范，也會導致污染。因而，為在一切操作中最大可能 地保證無菌，每一項工作都必須做到有條不紊和完全可靠。 避免污染的方法（一

2、） 滅菌(sterilization) 采用強烈的理化因素使任何物體內(nèi)外部的一切微生物（包括抵抗力最強的細菌芽孢）永遠喪失其生長繁殖能力的措施。n滅菌常用的方法： 干熱滅菌、濕熱滅菌、過濾除菌和輻射滅菌等。 可根據(jù)不同的需求，采用不同的方法。 干熱滅菌法:在干燥環(huán)境(如火焰或干熱空氣)進行滅菌的技術。n分類：n焚燒：用火焚燒是一種徹底的滅菌方法，破壞性大，僅適用于廢棄物品或動物尸體等；n燒灼：直接用火焰滅菌，通常將滅菌物品迅速通過火焰34次。適用于實驗室的金屬器械(鑷、剪、接種環(huán)等)、玻璃試管口和瓶口等的滅菌；n干烤：在干烤箱(hot air sterilizer)內(nèi)進行，加熱至160170維

3、持2小時，可殺滅包括芽胞在內(nèi)的所有微生物。適用于耐高溫的玻璃器皿、瓷器、 玻質(zhì)注射器等；n紅外線(infrared)：是波長為770nm1000m的電磁波，以1m10m波長的熱效應最強。紅外線的熱效應只能在照射到的表面產(chǎn)生，不能使物體 均勻加熱，常用于碗、筷等食具的滅菌；n微波(microwave)：波長為1mm1000mm的電磁波統(tǒng)稱為微波，可穿透 玻璃、塑料薄膜與陶瓷等物質(zhì)，但不能穿透金屬表面。微波爐的熱效應 分布不均勻，滅菌效果不可靠，用于非金屬器械及食具消毒。濕熱滅菌：以高溫高壓水蒸氣為介質(zhì)，由于蒸汽潛熱大，穿透力強，容易使蛋白質(zhì)變性或凝固，最終導致微生物的死亡，所以該法的滅菌效率比干

4、熱滅菌法高。n濕熱滅菌法分為：n煮沸滅菌法：滅菌效果較差，常用于注射器、注射針等器皿的 消毒。必要時可加入抑菌劑。n巴氏消毒法：利用較低的溫度既可殺死病菌又能保持物品中 營養(yǎng)物質(zhì)風味不變。n流通蒸汽滅菌法：適用于消毒以及不耐高熱制劑的滅菌， 但不能保證殺滅所有芽孢，是非可靠的滅菌方法。n間歇蒸汽滅菌法：方法同流通蒸汽滅菌法，但要重復3次以上。 不耐高熱的含糖或牛奶的培養(yǎng)基。n高壓蒸汽滅菌法： 將需滅菌的物品放在高壓鍋(autoclave)內(nèi)，加熱時蒸汽不外溢， 高壓鍋內(nèi)溫度隨著蒸汽壓的增加而升高。在103.4kPa蒸汽壓下， 溫度達到121.3，維持30min。 可殺滅包括芽胞在內(nèi)的所有微生物

5、，滅菌效果最好。適用于普通培養(yǎng)基、生理鹽水、手術器械(金屬)、玻璃容器、離心管、EP管、槍頭等耐高熱物品的滅菌。松下-高壓蒸汽滅菌器型號：MLS-3751L-PCu高壓蒸汽滅菌法注意事項： n包裹不應過大、過緊，一般應小于30cm30cm50cm；n高壓鍋內(nèi)的包裹不要排得太密，以免妨礙蒸氣透入，影響滅菌效果；n易燃、易爆物品，如碘仿，苯類等，禁用高壓蒸氣滅菌；n銳性器械，如刀、剪不宜用此法滅菌，以免變鈍；n瓶裝液體滅菌時，要用玻璃紙和紗布包扎瓶口；如有橡皮塞時，應插入針頭排氣； -瓶口不能封死，以免被壓變形n注明滅菌日期和物品保存時限，一般可保留l2周。過濾除菌： 用物理阻留的方法將液體或空氣

6、的細菌除去，以達到無菌目的。 主要用于血清、毒素、抗生素等不耐熱生物制品及空氣的除菌。 所用的器具是含有微小孔徑的濾菌器(filter)。 n常用的濾菌器是薄膜濾菌器（0.45m和0.22m孔徑）， 直接加在注射器頭部。繁殖型微生物約1m，芽孢為0.5m或以下，支原體為0.10.8m。 輻射滅菌： 利用電磁輻射產(chǎn)生的電磁波殺死大多數(shù)物質(zhì)上的微生物的一種有效方法。n用于滅菌的電磁波有：n微波：可以通過熱產(chǎn)生殺死微生物的作用。n紫外線：破壞微生物細胞中的DNA或RNA，抑制DNA的復制與轉(zhuǎn)錄。 -穿透力很弱，主要用來消毒。nX射線和射線： 射線的能量高、穿透力強，可使細胞內(nèi)各種活性物質(zhì)發(fā)生化學變化

7、，從而使細菌損傷或死亡。 -注意安全使用；成本高 常用的放射源：Co60-射線。（二）消毒(disinfection) ：指殺死病原微生物、但不一定能殺死細菌芽孢的方法。n常用的消毒法： n加熱消毒法：加熱使微生物細胞中的蛋白質(zhì)凝固、酶失活。最常用的加熱消毒法是煮沸。n藥劑消毒法：用于消毒的化學藥劑稱為消毒劑。 常用的消毒劑75%酒精，0.2%新潔爾滅(苯扎溴銨)。n紫外線消毒：紫外線能夠破壞微生物細胞中的DNA或RNA。缺點：紫外線穿透性差，光照強度隨距離增大而降低。 主要應用于空氣、物品表面的預防性消毒。（三）防腐(antisepsis)： 利用某種理化因素完全抑制微生物的生長繁殖。n常用

8、的防腐方法：n低溫：冷藏(+4)、冷凍(-20 ,-80 等)n缺氧：烘干、紫外線干燥n高滲：鹽腌、糖漬n防腐劑：大多數(shù)為化學合成產(chǎn)品，毒性較大。 -福爾馬林(3540甲醛)（四）抑菌(bacteriostasis)： 抑制細菌、真菌的生長繁殖。n抑菌劑-抗生素(antibiotics)：由微生物（包括細菌、真菌、放線菌屬或高等動植物在生活過程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性的一類次級代謝產(chǎn)物，能干擾其他生活細胞發(fā)育功能的化學物質(zhì)。n抗生素主要用于消毒培養(yǎng)液，是培養(yǎng)過程中預防微生物污染 的重要手段，也是微生物污染不嚴重時的“急救”方法。 不同抗生素殺滅微生物不同，應根據(jù)需要選擇。比較防腐劑抗生

9、素來源化工產(chǎn)品微生物天然產(chǎn)物/人工修飾作用目標大多數(shù)用于物大多數(shù)用于人作用方式外用內(nèi)用毒性毒性很大毒性很低選擇性選擇性差選擇性較好作用機理化學反應生物活性 甲醛：與蛋白質(zhì)上的氨基發(fā)生反應 。 青霉素：與細胞壁成分-粘肽結(jié)構(gòu)中的D-丙氨酰-D-丙氨酸近似， 可與后者競爭轉(zhuǎn)肽酶，阻礙粘肽的交聯(lián)，造成細胞壁的缺損， 使細菌失去細胞壁的滲透屏障，對細菌起到殺滅作用。培養(yǎng)前的準備工作n制定好實驗計劃，有關的數(shù)據(jù)計算要事先算好。n準備各種所需的器具和物品，清點無誤后放于操作場所(培養(yǎng)室,超凈工作臺)，然后開始消毒。避免開始實驗后，往返拿取物品而導致污染機會的增加。操作前的消毒n一些操作用具(如移液器、試管

10、架、離心管等)用75%酒精擦洗(噴灑酒精)后置于臺內(nèi)，隨后開啟紫外線消毒30min。n實驗前，超凈工作臺臺面要用75酒精擦洗。n工作臺面消毒時，切勿將培養(yǎng)細胞和培養(yǎng)用液同時照射紫外線。消毒時工作臺面上用品不要過多或重疊放置，否則會遮擋射線降低消毒效果。操作過程中n在利用超凈臺工作時，因整個前臂要伸入箱內(nèi)，應著長袖的清潔工作服，戴口罩。開始操作前要用75酒精消毒手。n如果實驗過程中手觸及可能污染的物品和伸出超凈工作臺外，都要重新用酒精消毒手。n在無菌環(huán)境進行培養(yǎng)或做其它無菌工作時，首先要點燃酒精燈。n之后的一切操作（如打開或封閉瓶口等），都需在 火焰近處并經(jīng)過燒灼進行。 n進行培養(yǎng)時，動作要準確

11、敏捷，但又不必 太快，以防空氣流動，增加污染機會。n不能用手觸及已消毒器皿(如EP管,鑷子, 剪刀)，可用無菌鑷子夾取。n如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。 細胞培養(yǎng)的基本過程 （一）取材： 在無菌環(huán)境下從機體取出某種組織細胞(視實驗目的而定)，經(jīng)過一定的處理(如消化分散細胞、分離等)后置于培養(yǎng)器皿中，這一過程稱為取材。n 如是細胞株的擴大培養(yǎng)則無取材這一過程。n 機體取出的組織細胞的首次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。幼體組織(尤其是胚胎組織)比成年個體的組織容易培養(yǎng)，分化程度低的組織比分化高的容易培養(yǎng)，腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。 n取材后應立即處理，盡快培養(yǎng)，因故不能 馬上培養(yǎng)時，可將組織塊切成

12、黃豆般大的 小塊，置4的培養(yǎng)液中保存。n取組織時應嚴格保持無菌，同時也要避免 接觸其他的有害物質(zhì)。n取病理組織和皮膚及消化道上皮細胞時 容易帶菌，為減少污染可用抗菌素處理。 （二）培養(yǎng)： 將取得的組織細胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程 稱為培養(yǎng)。n細胞培養(yǎng)，一般應在接入培養(yǎng)器皿之前進行細胞計數(shù)，按要求以一定的量（以每毫升細胞數(shù)表示）接入 培養(yǎng)器皿并直接加入培養(yǎng)基。n細胞進入培養(yǎng)器皿后，立即放入培養(yǎng)箱中，使細胞 盡早進入生長狀態(tài)。 n正在培養(yǎng)中的細胞應每隔一定時間觀察一次，觀察的 內(nèi)容包括：細胞是否生長良好，形態(tài)是否正常，有無 污染，培養(yǎng)基的pH是否太酸或太堿(由酚紅指示劑指示)，此外對培養(yǎng)溫度和C

13、O2濃度也要定時檢查。n原代培養(yǎng)一般有一段潛伏期(數(shù)小時到數(shù)十天不等)， 在潛伏期細胞一般不分裂，但可貼壁和游走。 過了潛伏期后細胞進入旺盛的分裂生長期。n細胞長滿瓶底后要進行傳代培養(yǎng)，將一瓶中的細胞消化懸浮后分至2-3瓶繼續(xù)培養(yǎng)。每傳代一次稱為“一代”。n二倍體細胞一般只能傳幾十代，而轉(zhuǎn)化細胞系或細胞株則可無限地傳代下去。轉(zhuǎn)化細胞可能具有惡性性質(zhì)，也可能僅有不死性(Immortality)而無惡性。 細胞計數(shù)血球計數(shù)板：則蓋上蓋玻片后，每個大方格的體積為1mm2 0.1mm = 1.010-4 mL(cm3)細胞計數(shù)血球計數(shù)板：細胞數(shù)的計算公式：4(2)個大方格的總數(shù)4(2) 104 稀釋倍

14、數(shù)則蓋上蓋玻片后，每個大方格的體積為1mm2 0.1mm = 1.010-4 mL(cm3)= 細胞數(shù)/mL 細胞培養(yǎng)基的基本要求(1)營養(yǎng)成分：n1. 氨基酸：是細胞合成蛋白質(zhì)的原料。所有細胞都需要12種必須氨基酸。 此外還需要谷氨酰胺，它在細胞代謝過程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶合成的來源，同樣也是合成3-,2-,1-磷酸酰苷所需要的基本物質(zhì)。 體外培養(yǎng)的各種培養(yǎng)基內(nèi)都含有必需氨基酸。n2. 單糖：培養(yǎng)中的細胞可以進行有氧與無氧酵解，六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。細胞對葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。體外培養(yǎng)動物細胞時，幾乎所有的培養(yǎng)基或培

15、養(yǎng)液中都以葡萄糖作為必含的能源物質(zhì)。 細胞培養(yǎng)基的基本要求(1)營養(yǎng)成分：n3. 維生素：主要扮演輔酶、輔基的角色，必不可少。 生物素(B7)、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、 核黃素、硫胺素、維生素B12都是培養(yǎng)基常有的成分。n4. 無機離子與微量元素：細胞生長除需要鈉、鉀、 鈣、鎂、氮和磷等基本元素，還需要微量元素， 如鐵、鋅、硒、銅、錳、鉬、釩等。 細胞培養(yǎng)基的基本要求(2)促生長因子及激素： 已證實各種激素、生長因子對于維持細胞的功能、保持細胞的狀態(tài)（分化或未分化）具有十分重要的作用。有些激素對許多細胞生長有促生長作用，如胰島素，它能促進細胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素對某一類細胞有明顯促

16、進作用，如氫化可的松(糖皮質(zhì)激素)可促進表皮細胞的生長，泌乳素有促進乳腺上皮細胞生長作用等。 細胞培養(yǎng)基的基本要求(3)滲透壓： 細胞必須生活在等滲環(huán)境中，大多數(shù)培養(yǎng)細胞對滲透壓有一定耐受性。人血漿滲透壓290mOsm/kg(毫滲摩爾每千克)，可視為培養(yǎng)人體細胞的理想滲透壓。鼠細胞滲透壓在320mOsm/kg左右。對于大多數(shù)哺乳動物細胞，滲透壓在260-320 mOsm/kg的范圍都適宜。 例如 ：0.9% 的氯化鈉的摩爾濃度為 154 mmol/L ，由于氯化鈉可以完全電離成鈉離子和氯離子，因此溶液中總的質(zhì)點數(shù)目為 308 mmol/L，那么其滲透壓為308 mOsmol/L。1mOsm/L

17、 = 2.573kPa(或19.3mmHg) 細胞培養(yǎng)基的基本要求(3)滲透壓：滲透摩爾滲透摩爾（osmole）：一種量度單位，簡寫為Osm， 用以描述滲透活性物質(zhì)滲透活性物質(zhì)的物質(zhì)的量物質(zhì)的量。滲透質(zhì)量摩爾濃度滲透質(zhì)量摩爾濃度（osmolality）：滲透活性物質(zhì)的質(zhì)量摩爾濃度質(zhì)量摩爾濃度,常用單位有Osm/kg和mOsm/kg。細胞培養(yǎng)基的基本要求(4)氣體及pH： 細胞生存所需氣體主要是O2和CO2。O2參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量供給細胞生長、增殖 和合成各種成分。一些細胞在缺氧情況下，借糖酵解也可獲取能量， 但多數(shù)細胞缺氧不能生存。在開放培養(yǎng)時，一般置細胞于95空氣加5CO2 的混合氣體

18、環(huán)境中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)基的基本要求(4)氣體及pH：CO2既是細胞代謝產(chǎn)物，也是細胞所需成分，它主要與維持 培養(yǎng)基的pH有直接關系。動物細胞大多數(shù)需要輕微的堿性條件，pH值約在7.27.4。在細胞生長過程中，隨細胞數(shù)量的增多和代謝活動的加強， CO2不斷被釋放，培養(yǎng)液變酸，pH值發(fā)生變化。由于NaHCO3容易分解為CO2 ，很不穩(wěn)定，致使緩沖系統(tǒng)難以精確地控制。故這一緩沖系統(tǒng)適合密閉培養(yǎng)。HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸,pH值緩沖范圍6.8-8.2。對細胞無毒性作用。)能較長時間控制恒定的pH范圍。結(jié)合NaHCO3使用，可提供更有效的緩沖體系，主要是防止pH值迅速變動，但最大缺點是在開放培養(yǎng)或

19、觀察時難以維持正常的pH值。細胞培養(yǎng)基的基本要求(4)氣體及pH：造成pH波動主要是代謝產(chǎn)生的CO2 ，在封閉式培養(yǎng)過程中CO2與水結(jié)合產(chǎn)生碳酸，培養(yǎng)基pH很快下降。為解決這一問題，合成培養(yǎng)基中使用了NaHCO3-CO2 緩沖系統(tǒng)，并采用開放培養(yǎng)，使細胞代謝產(chǎn)生的CO2 及時溢出培養(yǎng)瓶，再通過穩(wěn)定調(diào)節(jié)溫箱中CO2濃度 (5)，與培養(yǎng)基中的NaHCO3處于平衡狀態(tài)。 大多數(shù)培養(yǎng)液中含有酚紅作為pH指示劑，酸性培養(yǎng)液呈橙黃色，堿性培養(yǎng)液呈深紅色 培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基： 指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基， 如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。n但是由于天然培養(yǎng)基制作過程復雜、批間差異大， 因

20、此逐漸為合成培養(yǎng)基所替代。n目前廣泛使用的天然培養(yǎng)基是血清，另外各種組織提取液、促進細胞貼壁的膠原類物質(zhì)在培養(yǎng)某些特殊細胞也是必不可少。n血清(serum)：動物血清對細胞的生長繁殖發(fā)揮著重要 甚至是難以替代的作用。在動物血清的應用中牛血清 是最為廣泛的，所以血清是醫(yī)藥生物技術產(chǎn)品中重要 的原材料之一。 血清種類：目前用于組織培養(yǎng)的血清主要是牛血清，培養(yǎng)某些特殊細胞也用人血清、馬血清等。n牛血清是細胞培養(yǎng)中用量最大的天然培養(yǎng)基，含有豐富的細胞生長必須的營養(yǎng)成份，具有極為重要的功能。n選擇用牛血清培養(yǎng)細胞的原因：來源充足、制備技術成熟、經(jīng)過長時間的應用考驗人們對其有比較深入的理解。牛血清對絕大多

21、數(shù)哺乳動物細胞都是適合的，但并不排除在培養(yǎng)某種細胞時使用其他動物血清更合適。n 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)取自剖腹產(chǎn)的胎牛； 新牛血清取自出生24小時之內(nèi)的新生牛； 小牛血清(calf serum,CS)取自出生10-30天的小牛。n 顯然，胎牛血清是品質(zhì)最高的， 因為胎牛還未接觸外界，血清中所含的抗體、 補體等對細胞有害的成分最少。 血清的主要成分：n血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種很復雜的混合物，其組成成份雖大部分已知，但還有一部分尚不清楚，且血清組成及含量常隨供血動物的性別、年齡、生理條件和營養(yǎng)條件不同而異。n血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化

22、合物、生長因子、激素、無機物等，這些物質(zhì)對促進細胞生長或抑制生長活性是達到生理平衡的。提供基本營養(yǎng)物質(zhì)：氨基酸、維生素、無機物、脂類物質(zhì)、核酸衍生物等，是細胞生長必須的物質(zhì)。提供激素和各種生長因子： 胰島素、腎上腺皮質(zhì)激素(氫化可的松,地塞米松)、類固醇激素(雌二醇,睪酮,孕酮)等。 生長因子如成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、血小板生長因子等。提供結(jié)合蛋白：結(jié)合蛋白作用是攜帶重要的低分子量物質(zhì)，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等，轉(zhuǎn)鐵蛋白攜帶鐵。結(jié)合蛋白在細胞代謝過程中起重要作用。 血清主要作用：提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷。對培養(yǎng)中的細胞起到某些保護作用：有一些細胞，如內(nèi)皮

23、細胞、骨髓樣細胞可以釋放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用?？墒褂醚鍋斫K止胰蛋白酶的消化作用。因為胰蛋白酶已經(jīng)被廣泛用于貼壁細胞的消化傳代。 血清蛋白形成了血清的粘度，可以保護細胞免受機械損傷，特別是在懸浮培養(yǎng)攪拌時，粘度起到重要作用。血清還含有一些微量元素和離子，他們在代謝解毒中起重要作用，如SeO3，硒等。 血清主要作用： 血清的使用與儲存n使用前處理：大部分血清在使用前必須滅活處理，即5630min。滅活的目的是去除血清中的補體成分，避免補體對細胞產(chǎn)生毒性作用。對于一些品質(zhì)高的胎牛血清和新牛血清可以考慮不經(jīng)滅活直接用于細胞培養(yǎng)。n儲存條件：血清一般儲存于-20，同時應避免反復

24、凍融。購買大包裝的血清后，首先要滅活處理，然后分裝成 小包裝，儲存于-20，使用前融化。融化時最好現(xiàn)置于4。融化后的血清在4不宜長時間存放，應盡快使用。n使用濃度：自從有了合成培養(yǎng)基，血清就是作為一種 添加成分與合成培養(yǎng)基混合使用，使用濃度一般為 5-20，最常用是10。過多血清容易使培養(yǎng)中的細胞 發(fā)生變化，特別是一些二倍體的無限細胞系，迅速生長 之后容易發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。 培養(yǎng)基-合成培養(yǎng)基：n基本組分-四大類物質(zhì)：無機鹽、氨基酸、維生素、 碳水化合物。 無機鹽：CaCl2,KCl,MgSO4,NaCl,NaHCO3,NaH2PO4。對調(diào)節(jié)細胞滲透壓、某些酶的活性及溶液的酸堿度都是必須的。氨基酸

25、：纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)。它們都是細胞用以合成蛋白質(zhì)的必需原料，不能由其他氨基酸或糖類轉(zhuǎn)化合成。除此之外，還需要谷氨酰胺(glutamine)。是根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，用化學物質(zhì)模擬合成、人工設計、配制的培養(yǎng)基。它有一定的配方，是一種理想的培養(yǎng)基。 培養(yǎng)基-合成培養(yǎng)基：谷氨酰胺具有特殊的作用，它能促進各種氨基酸進入細胞膜；它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的來源，還是合成1-磷酸腺苷,2-磷酸腺甘和3-磷酸腺苷的原料。細胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏可導致細胞生長不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應補加一定量的谷氨酰胺。需注意，谷氨酰胺在

26、溶液中很不穩(wěn)定，故4下放置1周可分解50%，使用中最好單獨配制，置-20冰箱中保存，使用前加入培養(yǎng)液中。 維生素：是維持細胞生長的一種生物活性物質(zhì)，在細胞中大多形成酶的輔基或輔酶，對細胞代謝有重大影響。脂溶性維生素(A,D,E,K)常從血清中得到補充。水溶性維生素包括葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素和B12等。維生素C也是不可缺少的，對具有合成膠原能力的細胞更為重要。碳水化合物：是細胞生命的能量來源，有的是合成蛋白質(zhì)和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖和丙酮酸鈉等。體外培養(yǎng)動物細胞時，幾乎所有培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中都以葡萄糖作為必含的能源物質(zhì)。 培養(yǎng)基-無血清培養(yǎng)基 無血清培養(yǎng)基(s

27、erum free medium,SFM) 是不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養(yǎng)基，但是它們可能包含個別蛋白或大量蛋白組分。n用于生物制藥和疫苗生產(chǎn)的細胞在體外培養(yǎng)時，多數(shù)呈貼壁生長或兼性貼壁生長；而當其在無血清、無蛋白培養(yǎng)基中生長時，由于缺乏血清中的各種粘附貼壁因子如纖粘連蛋白、層粘連蛋白、膠原、玻表粘連蛋白，細胞往往以懸浮形式生長。n應用：如觀察一種生長因子對某種細胞的作用，這時需要排除 其他生長因子的干擾作用。而血清中可能含有各種生長因子； 又如需要測定某種細胞在培養(yǎng)過程中分泌某種物質(zhì)（抗體、 生長因子）的能力；或者要大規(guī)模的培養(yǎng)某種細胞，以獲得 它們的分泌產(chǎn)物

28、。n 無血清培養(yǎng)基的基本配方:基礎培養(yǎng)基和添加組分添加組分包括： 促貼壁物質(zhì)：許多細胞必須貼壁才能生長，這種情況下無血清培養(yǎng)基中一定要添加促貼壁和擴展因子，一般為細胞外基質(zhì)，如纖連蛋白、層粘連蛋白等。它們還是重要的分裂素以及維持正常細胞功能的分化因子，對許多細胞的繁殖和分化，起著重要作用。 促生長因子及激素：針對不同細胞添加不同的生長因子。激素也是刺激細胞生長、維持細胞功能的重要物質(zhì)，有些激素是許多細胞必不可少的，如胰島素。n無血清培養(yǎng)基的基本配方：基礎培養(yǎng)基和添加組分 酶抑制劑：培養(yǎng)貼壁生長的細胞，需要用胰酶消化傳代，在無血清培養(yǎng)基中必須含酶抑制劑，以終止酶的消化作用，達到保護細胞的目的。

29、結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運蛋白：常見如轉(zhuǎn)鐵蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比較大，可增加培養(yǎng)基的粘度，保護細胞免受機械損傷。許多旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基都含有牛血清白蛋白。 微量元素：硒是最常見的。 n 無血清培養(yǎng)基的使用方法:目前，血清仍是動物細胞培養(yǎng)中最基本的的添加物，尤其是在原代培養(yǎng)或者細胞生長狀況不良時，常常會先使用有血清的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，待細胞生長旺盛以后，再換成無血清培養(yǎng)液。細胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)要有一個適應過程，一般要逐步降低血清濃度，從10%減少到5%，3%，1%，直至無血清培養(yǎng)。在降低過程中要注意觀察細胞形態(tài)是否發(fā)生變化，是否有部分細胞死亡，存活細胞是否還保持原有的功能和生物學特

30、性等。在實驗后這些細胞一般不再繼續(xù)保留，很少有細胞能夠長期培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基而不發(fā)生改變的。細胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)之前，要留有種子細胞，種子細胞按常規(guī)培養(yǎng)于含血清的培養(yǎng)基中，以保證細胞的特性不發(fā)生變化。 細胞培養(yǎng)用液 n(1) 平衡鹽溶液（balanced salt solution,BSS）：主要是由無機鹽、葡萄糖組成，它的作用是 維持細胞滲透壓平衡，保持pH穩(wěn)定及提供簡單的營養(yǎng)。主要用于取材時組織塊的漂洗、細胞的漂洗、配制其他試劑等。n配好的平衡鹽溶液可以過濾除菌或高溫滅菌。 細胞培養(yǎng)用液 n(2) 消化液：取材進行原代培養(yǎng)時常常需要將組織塊消化 解離形成細胞懸液，傳代培養(yǎng)時也需要將貼壁細胞從

31、瓶壁 上消化下來。胰酶溶液：胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示，常見 有1:125和1:250，即一份胰酶可消化125或250份酪蛋白。 組織培養(yǎng)用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%濃度，配制時 要用不含Ca2+ 、Mg2+及血清的平衡鹽溶液，因為這些物質(zhì)會對胰酶產(chǎn)生抑制作用。胰酶作用及溶解的最佳pH是8-9，配制胰酶溶液應將液體調(diào)至pH8左右，充分溶解，過濾除菌。過濾后可再調(diào)至pH7.5，也可不調(diào)。(2) 消化液：EDTA溶液：EDTA溶液也常用來解離細胞，它的作用機制是破壞細胞間的連接。對于一些貼壁特別牢固的細胞，還可以用EDTA和胰酶的混合液進行消化。EDTA溶液的使用濃度為0.02%，

32、配制時應加堿助溶，配制后可過濾除菌，也可高溫消毒滅菌。膠原酶溶液：膠原酶在上皮類細胞原代培養(yǎng)時經(jīng)常使用，膠原酶作用的對象是膠原組織，因此不容易對細胞產(chǎn)生損傷。膠原酶的使用濃度為0.1-0.3mg/L或200000U/L，作用的最佳pH為6.5。膠原酶不受Ca2+ 、Mg2+及血清的抑制，配制時可用PBS。(3) pH調(diào)整液:n常用的有HEPES液和NaHCO3溶液。NaHCO3溶液： NaHCO3是培養(yǎng)基中必須添加的成分，一般情況下按說明書的要求準確添加，以保證培養(yǎng)基在5% CO2的環(huán)境下pH達到設計標準。如果是封閉式培養(yǎng)，即不與5%CO2的環(huán)境發(fā)生交換達到平衡，所使用的培養(yǎng)基就不能按照說明書

33、所要求加入NaHCO3 。此時常用5.6%或7.4%的NaHCO3溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基，使之達到所要求的pH環(huán)境。HEPES溶液：是一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，對細胞無毒性，主要作用是防止培養(yǎng)基pH迅速變動。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細胞時培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時可以維持pH7.0左右。一般在進行克隆化培養(yǎng)時要添加HEPES。(4) 抗生素:n常用的是青鏈霉素，俗稱“雙抗溶液”。 青霉素主要是對革蘭陽性菌有效， 鏈霉素主要對革蘭陰性菌有效。 加入這兩種抗生素可預防絕大多數(shù)細菌污染。n通常使用青霉素終濃度0.007-0.008g/

34、100ml, 鏈霉素終濃度0.01g/100ml。 一般配制成100倍濃縮液，可用PBS或培養(yǎng)基配制。 (5) 谷氨酰胺補充液:n谷氨酰胺在細胞代謝過程中起重要作用，合成培養(yǎng)基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容易降解，需單獨配制谷氨酰胺，以便臨時加入培養(yǎng)液內(nèi)。n谷氨酰胺使用終濃度為0.002mol/L。一般配制為100倍濃縮液，即濃度為200mmol/L（29.22g/L），配制時應加溫30，完全溶解后過濾除菌，分裝至小瓶，儲存于 -20。使用時，在每100ml培養(yǎng)液中加入0.52ml谷氨酰胺濃縮液，終濃度為14mmol/L。 (6) 二肽谷氨酰胺（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）nL-谷氨

35、酰胺是大部分細胞培養(yǎng)基的基本成分，是一種 不穩(wěn)定的氨基酸，在中性的水溶液中會自發(fā)降解； 需要頻繁地補加L-谷氨酰胺。n二肽谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)中穩(wěn)定而不降解，可高壓滅菌,釋放毒性氨最少。n二肽谷氨酰胺在細胞內(nèi)被氨肽酶水解，產(chǎn)生L-谷氨酰胺和L-丙氨酸；因此在大部分細胞系統(tǒng)中二肽谷氨酰胺就可以象L-谷氨酰胺同樣有效地被利用。n二肽谷氨酰胺是最優(yōu)替代物，它無需適應；既可用于貼壁細胞培養(yǎng)，也適合于懸浮細胞的培養(yǎng)。 (三) 細胞傳代方法游離期(10min-4h)貼壁期(10min-4h)潛伏期(6-42h,無細胞分裂)對數(shù)生長期(數(shù)量增長很快,活力最佳)平臺期(接觸抑制,密度依賴性)根據(jù)細胞生長的恃點，

36、傳代方法有3種： 懸浮生長細胞傳代n離心法傳代：離心1000r/min去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。n直接傳代法：懸浮細胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除 l/2-2/3，然后用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代。 半懸浮生長細胞傳代n此類細胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接 吹打法使細胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。 貼壁生長細胞傳代n采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。(三) 細胞傳代方法根據(jù)細胞生長的恃點，傳代方法有3種： 懸浮生長細胞傳代n離心法傳代：離心1000r/min去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。n直接傳代法：懸浮細胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去

37、除 l/2-2/3，然后用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代。 半懸浮生長細胞傳代n此類細胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接 吹打法使細胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。 貼壁生長細胞傳代n采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。(三) 細胞傳代方法n1 吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液n2 加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個瓶底為準）。靜置2-10 min（顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測）。n3 吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液。n4 用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復吹打瓶壁細胞，形成細胞懸液。n5 離心，細胞沉淀用培養(yǎng)液制成懸液。n5 吸取1/10-1/40細胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。n

38、6 加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細胞懸液的新培養(yǎng)瓶內(nèi)。n7 將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。貼壁生長細胞傳代方法：n任何培養(yǎng)瓶內(nèi)生長的細胞都由死細胞和活細胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細胞是困難的。n在細胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細胞， 總細胞中活細胞所占的百分比叫做細胞活力。 由組織中分離細胞一般也要檢查活力，以了解 分離的過程對細胞是否有損傷作用。復蘇后的 細胞也要檢查活力，了解凍存和復蘇的效果。 細胞活力測定 (1) 臺盼藍法方法： 1、將細胞懸液以0.5ml加入試管中； 2、加入0.5ml 0.4%臺盼蘭染液，染色2-3min； 3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片； 4、鏡下取幾個任意視野分別計死細胞和活細胞數(shù)， 計細胞活力； 原理：死細胞能被臺盼蘭染上色，