分子生物學(xué)寫出一個(gè)研究功能基因組的思路剛

1、寫出一個(gè)研究功能基因組的思路研究功能基因組的思路分為三個(gè)重要階段,第一個(gè)階段是目的基因的精細(xì)定位,第二個(gè)階段是目標(biāo)候選基因的功能驗(yàn)證，第三個(gè)階段是基因的功能與基因進(jìn)化研究。由于基因在基因組中有相對(duì)穩(wěn)定的基因座位，在不清楚基因序列與所編碼的蛋白序列信息的情況下，先利用分子標(biāo)記技術(shù)（如Indel、SSR、SNP）對(duì)目的基因做精細(xì)定位。在獲得定位結(jié)果之后，對(duì)目標(biāo)區(qū)域的基因組序列進(jìn)行測(cè)序分析和序列比對(duì)、生物信息學(xué)分析、cDNA測(cè)序和序列比對(duì)、以及基因表達(dá)模式分析等，確定目標(biāo)候選基因。再用與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記篩選基因組文庫（如YAC、BAC、TAC、PAC），構(gòu)建目的基因區(qū)域的物理圖譜，再通過染

2、色體步移（walking）逐步逼近目的基因或通過染色體登陸（landing）的方法找到包含該目的基因的克隆。再進(jìn)行利用PCR技術(shù)獲得全長(zhǎng)目標(biāo)基因片段，組裝載體、遺傳轉(zhuǎn)化和功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)等工作，最終克隆到目的基因。最重要的實(shí)驗(yàn)是功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，我目前所了解的情況如下。我研究的內(nèi)容是水稻的某個(gè)雄性不育基因。在定位到該基因后，分兩步。首先要構(gòu)建干涉載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化野生型的植株，如果野生型轉(zhuǎn)化后表現(xiàn)為不育，則說明結(jié)果是陽性。然后要構(gòu)建誘導(dǎo)載體，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化不育株，如果不育株轉(zhuǎn)化后表現(xiàn)為可育，則說明結(jié)果是陽性。克隆到該基因之后再進(jìn)行基因功能與基因進(jìn)化的研究。以下列出幾種常用的研究功能基因組的方法。

3、1 RT-PCR & qRT-PCR RT-PCR 為反轉(zhuǎn)錄RCR（reverse transcription PCR）和實(shí)時(shí)PCR（real time PCR）共同的縮寫。逆轉(zhuǎn)錄PCR，或者稱反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ)DNA，再以此為模板通過PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增。實(shí)時(shí)PCR(real-time PCR)，屬于定量PCR（Q-PCR）的一種，以一定時(shí)間內(nèi)DNA的增幅量為基礎(chǔ)進(jìn)行DNA的定量分析。 real time PCR 的定量使用熒

4、光色素，目前有二種方法。一種是在ds DNA中插入特異的熒光色素，例如SYBR Green熒光染料；另一種使用一種能與增幅DNA序列中特定寡核酸序列相結(jié)合的一種熒光探針（probe），如Taqman探針。兩種方法原理不同。SYBR Green熒光染料游離時(shí)不發(fā)光，當(dāng)反應(yīng)體系中存在雙鏈DNA時(shí)，SYBR Green與雙鏈DNA結(jié)合，此時(shí)才發(fā)光。Taqman探針帶有一個(gè)熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅基團(tuán)，熒光基團(tuán)連接在探針的5末端，而淬滅基團(tuán)則在3末端。PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'3'外

5、切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，此時(shí)熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)可以被檢測(cè)到。 real time PCR 與 reverse transcription PCR 相結(jié)合，能用微量的RNA來找出特定時(shí)間、細(xì)胞、組織內(nèi)的特別表達(dá)的遺傳基因。這兩種RT PCR的組合又被稱之為“定量RT-PCR（quantitative RT-PCR）”2原位雜交技術(shù)（in situ hybridization）的基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基序列，將有放射性或非放射性的外源核酸(即探針)與組織、細(xì)胞或染色體上待測(cè)DNA或RNA互補(bǔ)配對(duì)，結(jié)合成專一的核酸雜交分子，經(jīng)一定的檢測(cè)手段將待

6、測(cè)核酸在組織、細(xì)胞或染色體上的位置顯示出來。為顯示特定的核酸序列必須具備3個(gè)重要條件：組織、細(xì)胞或染色體的固定、具有能與特定片段互補(bǔ)的核苷酸序列(即探針)、有與探針結(jié)合的標(biāo)記物(曾呈奎等2000)。 RNA原位核酸雜交又稱RNA原位雜交組織化學(xué)或RNA原位雜交。該技術(shù)是指運(yùn)用cRNA或寡核苷酸等探針檢測(cè)細(xì)胞和組織內(nèi)RNA表達(dá)的一種原位雜交技術(shù)。其基本原理是：在細(xì)胞或組織結(jié)構(gòu)保持不變的條件下，用標(biāo)記的已知的RNA核苷酸片段，按核酸雜交中堿基配對(duì)原則，與待測(cè)細(xì)胞或組織中相應(yīng)的基因片段相結(jié)合(雜交)，所形成的雜交體 (Hybrids)經(jīng)顯色反應(yīng)后在光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡下觀察其細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的mRNA、

7、rRNA和tRNA分子。RNA原位雜交技術(shù) 經(jīng)不斷改進(jìn)，其應(yīng)用的領(lǐng)域已遠(yuǎn)超出DNA原位雜交技術(shù)。尤其在基因分析和診斷方面能作定性、定位和定量分析，已 成為最有效的分子病理學(xué)技術(shù)，同時(shí)在分析低豐度和罕見的mRNA表達(dá)方面已展示了分子生物學(xué)的一重要方向。3 DNA microarray DNA微陣列技術(shù)是產(chǎn)生于90年代的一種分子生物學(xué)技術(shù)，也稱為芯片技術(shù)，其原理是：在一塊帶有DNA微陣列涂層的玻璃片上，利用光導(dǎo)化學(xué)合成、照相平板印刷、固相表面化學(xué)合成等技術(shù)合成數(shù)百萬個(gè)DNA探針，然后與用熒光或放射性同位素標(biāo)記的DNA雜交，繼而通過熒光強(qiáng)度或者同位素放射強(qiáng)度檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)雜交信號(hào)強(qiáng)弱，從而確定細(xì)胞中特

8、定分子的相對(duì)表達(dá)水平。4染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）也稱結(jié)合位點(diǎn)分析法，是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的有力工具，通常用于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)或組蛋白特異性修飾位點(diǎn)的研究。將ChIP與第二代測(cè)序技術(shù)相結(jié)合的ChIP-Seq技術(shù)，能夠高效地在全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段。ChIP-Seq的原理是：首先通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，并對(duì)其進(jìn)行純化與文庫構(gòu)建；然后對(duì)富集得到的DNA片段進(jìn)行高通量測(cè)序。研究人員通過將獲得的數(shù)百萬條序列標(biāo)簽精確定位到基因組上，從而獲得全基因

9、組范圍內(nèi)與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段信息。5酵母單雜交系統(tǒng)（Yeast one-hybrid system）是上世紀(jì)90年代中發(fā)展起來的研究DNA-蛋白質(zhì)之間相互作用的新技術(shù)。它的基本原理是將已知順式作用元件構(gòu)建到最基本啟動(dòng)子 （minimal promoter，Pmin）的上游，把報(bào)告基因連接到Pmin下游。將編碼待測(cè)轉(zhuǎn)錄因子cDNA與已知酵母轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域 （transcription-activating domain, AD） 融合表達(dá)載體導(dǎo)入酵母細(xì)胞，該基因產(chǎn)物如果能夠與順式作用元件相結(jié)合，就能激活 Pmin啟動(dòng)子，使報(bào)告基因得到表達(dá)。利用酵母單雜技術(shù)，可識(shí)別結(jié)合DNA的蛋白

10、質(zhì)；也可在酵母細(xì)胞內(nèi)研究真核生物中DNA-蛋白質(zhì)之間的相互作用；同時(shí)也能通過篩選DNA文庫直接獲得與靶序列相互作用蛋白的編碼基因。6酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeast two-hybrid system)的建立是基于對(duì)真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認(rèn)識(shí)。細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。反式轉(zhuǎn)錄激活因子，例如酵母轉(zhuǎn)錄因子 GAL4在結(jié)構(gòu)上是組件式的（modular），往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上結(jié)構(gòu)上可以分開，功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域（domain）構(gòu)成，其中含有DNA結(jié)合功能域(DNA binding domain, DNA-BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activation domain，DNA-AD）。

11、這兩個(gè)結(jié)合域?qū)⑺鼈兎珠_時(shí)仍分別具有功能，但不能激活轉(zhuǎn)錄，只有當(dāng)被分開的兩者通過適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時(shí)，才能重新呈現(xiàn)完整的GAL4轉(zhuǎn)錄因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游啟動(dòng)子，使啟動(dòng)子下游基因得到轉(zhuǎn)錄。 雙雜交系統(tǒng)的建立得力于對(duì)真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認(rèn)識(shí)。 細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。 80年代的工作表明， 轉(zhuǎn)錄激活因子在結(jié)構(gòu)上是組件式的(modular)， 即這些因子往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成, 其中有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA binding domain, 簡(jiǎn)稱為DB)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain, 簡(jiǎn)稱為AD), 它們是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必需的。 單獨(dú)的DB雖然能和啟動(dòng)子結(jié)合, 但是不能激活轉(zhuǎn)錄。 而不同轉(zhuǎn)錄激活因子的DB和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉(zhuǎn)錄的功能。 如酵母細(xì)胞的Gal4蛋白的DB與大