纖維素酶最適反應(yīng)溫度的測(cè)定

1、本科學(xué)生實(shí)驗(yàn)報(bào)告學(xué)號(hào) 104120434 姓名 穆志國 學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院 專業(yè)、班級(jí) 10生物技術(shù) 實(shí)驗(yàn)課程名稱 纖維素酶最適反應(yīng)溫度的測(cè)定 指導(dǎo)教師及職稱 李俊俊 開課時(shí)間 2012 至 2013 學(xué)年 下 學(xué)期填報(bào)時(shí)間 2013 年 4 月 17 日一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解不同溫度條件對(duì)酶活性的影響2、掌握酶最適反應(yīng)溫度的測(cè)定方法二、實(shí)驗(yàn)原理 溫度對(duì)酶促反應(yīng)速率的影響有兩方面：一方面，溫度升高可加快分子運(yùn)動(dòng)速率，提高分子碰撞概率，從而使反應(yīng)速率加快；另一方面，溫度升高可能使酶蛋白逐步變性而失活，從而降低酶促反應(yīng)速率。溫度對(duì)酶促反應(yīng)速率的影響是這兩方面作用的綜合結(jié)果。所以只有在某一溫度范圍內(nèi)時(shí)

2、，酶促反應(yīng)速率才會(huì)隨著溫度的升高而升高，達(dá)到最大反應(yīng)速率時(shí)的溫度稱為酶作用的最適溫度（Optimum Temperature）。 將其它條件（如酶濃度、底物濃度、pH、反應(yīng)時(shí)間等）固定在最適狀態(tài)，然后在一系列不同溫度條件下進(jìn)行酶活力測(cè)定。繪制得到溫度酶活力曲線。 酶的最適溫度并不是酶的特征常數(shù)，受其它因素的影響。3、 實(shí)驗(yàn)試劑1、檸檬酸鈉緩沖液，0.05mol/L pH4.（適用于酸性纖維素酶）2、磷酸緩沖液， 0.1mol/L pH6.0（適用于中性纖維素酶）3、CMC-Na溶液（底物溶液，pH4.8和pH6.0 ）4、DNS試劑（CMCA-DNS）5、纖維素酶液（ pH4.8和pH6.0）

3、4、 實(shí)驗(yàn)儀器 1、分光光度計(jì) 2、沸水浴 3、恒溫水?。?00±0.1） 4、分析天平（感量0.1mg） 5、移液器 6、計(jì)時(shí)器 7、磁力攪拌器5、 實(shí)驗(yàn)方法1、 本實(shí)驗(yàn)在室溫至90之間選擇不同溫度測(cè)定酶活力，以找出纖維素酶在此條件下的最適溫度。2、 待測(cè)酶液制備 稱取固體纖維素酶1g，精確至0.1mg，用蒸餾水溶解，準(zhǔn)確稀釋定容（使試樣液與空白液的吸光度之差落在0.20.5范圍內(nèi)，不在此范圍內(nèi)，酶液要進(jìn)行重新稀釋），待測(cè)。3、測(cè)定步驟（1）取3支25mL刻度具塞試管（1支做空白管，2支做樣品管）。（2）分別向3支管中準(zhǔn)確加入用相應(yīng)pH緩沖液配制的CMC-Na溶液2.00mL 注意

4、：加入CMC-Na溶液時(shí)應(yīng)緩慢，不可粘在試管壁上。（3）分別準(zhǔn)確加入稀釋好的待測(cè)酶液0.5mL于2支樣品管中（空白管不加） 用渦旋混合器混勻。（ 注意：酶液一定要垂直加在底物上面，不可順 著試管壁加入）（4）將3支試管同時(shí)置于不同溫度水浴中，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，反應(yīng)30min，取出。（5）迅速準(zhǔn)確地向3支管中加入3mLDNA試劑（加液順序和加酶液順序相同以保證反應(yīng)時(shí)間相同），振蕩搖勻，于空白管中準(zhǔn)確加入稀釋好的待測(cè)酶液0.5mL，搖勻。將3支管同時(shí)放入沸水浴中，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，煮沸10min取出，迅速冷卻至室溫，用水定容至25mL。（6）以空白管調(diào)零，在分光光度計(jì)540nm波長下，用1cm比色皿，分別測(cè)量2支

5、樣品管中樣液的吸光度OD值，分別記為ODE1、ODE2 ，取二者平均值。帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算酶活力。注意：不同溫度指室溫、30 、 40 、 50 、 60 、 70 、 80 、 90 4、纖維素酶酶活力計(jì)算纖維素酶酶活力（U/g）=(K×平均OD+b) ×N / 0.5×0.5式中： K標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率b標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距N試樣的總稀釋倍數(shù)0.5反應(yīng)酶液的體積，mL0.5反應(yīng)時(shí)間，h酶活力的計(jì)算值保留3位有效數(shù)字注意：同一試樣兩個(gè)平行測(cè)定值的相對(duì)偏差在±8%以內(nèi)，二 者的平均值為最終的酶活力測(cè)定值。5、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖一:葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（注：在前面的實(shí)驗(yàn)中

6、已經(jīng)測(cè)得，可以沿用前面中實(shí)驗(yàn)所得的結(jié)果）6、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（1）、實(shí)驗(yàn)所測(cè)得的數(shù)據(jù)溫度（）平均OD值平均OD值（PH=4.8）平均OD值（PH=6.0）室溫（約為26）0.22050.0685300.28450.2475400.28300.340500.38300.2205600.39550.189700.50250.145800.4390.089900.0820.049表一：在不同溫度條件下，當(dāng)PH值分別為4.8和6.0是測(cè)得的吸光度注：當(dāng)溫度為50和60時(shí)，使用的酶液稀釋倍數(shù)為10000倍，而其它的溫度時(shí)刻，稀釋的倍數(shù)都是為5000倍（2） 、應(yīng)用公式進(jìn)行計(jì)算酶活，可以得到下表當(dāng)Ph=4.8時(shí)

7、 溫度（）酶活（u/ml)室溫（約為26）2025.12302834.08402815.12508158.24608474.24705589.6804786.9690274.48表二：PH=4.8時(shí)，不同溫度下的酶活當(dāng)PH=6.0時(shí)溫度（）酶活（u/ml)室溫（約為26）103.84302366.4403535.6504050.24603253.92701070.880362.9690-142.64表二：PH=6.0時(shí)，不同溫度下的酶活為更直觀的表示，纖維素酶在不同溫度下的變化，做出如下散點(diǎn)圖圖二：不同溫度下的酶活力的變化（3） 、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析、由圖二可以看出，當(dāng)PH為4.8時(shí)比PH=6.0時(shí)酶的活力更高，說明在偏酸性的時(shí)候，纖維素酶的活力更強(qiáng)；、由圖二可以看出，隨溫度的變化，酶的活力呈正態(tài)分布，溫度過低時(shí)酶的活力較低，而溫度過高時(shí)酶的活力也會(huì)變低，甚至失活；、由圖二可以看出，當(dāng)PH=4.8時(shí)，溫度為60時(shí)，為纖維素酶的最適酶活力溫度；、由圖二可以看出，當(dāng)PH=6.0時(shí)，溫度為50時(shí)，為纖維素酶的最適酶活力溫度；（4） 、實(shí)驗(yàn)總結(jié) 通過本實(shí)驗(yàn)，在不同的溫度條件下纖維素的酶活，讓我們掌握了變溫對(duì)酶活力的影響，同時(shí)也對(duì)溫度對(duì)酶活力的影響有一個(gè)直觀的了解。同時(shí)在實(shí)驗(yàn)中需