細胞培養(yǎng)基質量規(guī)范及檢驗方法

1、歡迎閱讀細胞培養(yǎng)基質量標準及檢驗方法中國醫(yī)藥生物技術協(xié)會二0一一年四月編寫說明1、 根據中國醫(yī)藥生物技術協(xié)會 2010年9月20日組織召開的動物細胞培養(yǎng)基生產管理及質量控制學術研討會紀要，結合我國的實際情況制定本標準。2、 本標準以中國藥典2010版和哺乳類動物細胞培養(yǎng)基(HG/T3935-2007)行業(yè)標準為依據，結合生物制品對細胞培養(yǎng)基原材料的特殊要求制定，增加了牛血清白蛋白殘留量、抗生素殘留量等檢測項目。3、 本標準分為細胞培養(yǎng)基檢驗項目和每個項目的檢驗方法兩部分，為評判細胞培養(yǎng)基產品質量提供了依據和方法，從而規(guī)范我國細胞培養(yǎng)基行業(yè)健康發(fā)展。4、 結果評定依據本標準和方法對細胞培養(yǎng)基樣品

2、進行全項檢驗，所有項目均符合標準要求，判 定該樣品為合格；若有一項不符合標準要求，則判定樣品為不合格。細胞培養(yǎng)基質量標準及檢驗方法一、細胞培養(yǎng)基質量標準細胞培養(yǎng)基質量應符合表1所示的技術要求。表1技術要求檢驗項目限度要求檢驗方法澄清度澄清中華人民共和國藥典 2010年版二部附錄IX B進 行。pH值(每升標示量/L)pH允許偏差范圍為土 0.30中華人民共和國藥典2010年版附錄VIH進行。滲透壓(mOsm/kgH2)滲透壓允許偏差范圍為土5%中華人民共和國藥典2010年版二部附錄IX G滲 透壓摩爾濃度測定法進 行。干燥減量的質量分數(為<5.0按中華人民共和國藥典 2010年版二部附

3、錄VM 干 燥失重測定法進行。細菌內毒素（EU/ml）< 10按中華人民共和國約典 2010年版附錄XIE細菌內 毒素檢查法中的凝膠法進 行。微生物限度細菌數(CFU/g)<200按中華人民共和國藥典 2010年版附錄XIJ微生物 限度檢查法進行，檢查項 目為細菌數、毒菌數。檢 查法采用平皿法。毒菌數(CFU/g)<50細胞生長試 驗（vero細 胞）細胞形態(tài)成纖維樣貼壁生長，形態(tài)正 常無變異按中華人民共和國化工行 業(yè)標準哺乳類動物細胞 培養(yǎng)基HG/T3935-2007 第7.7條進行。細胞數量培養(yǎng)72h細胞數量不低于1X105cells/ml ；繼續(xù)維持48h細胞數重不低于

4、 1 X105cells/ml牛血清白蛋白不得檢出依據中華人民共和國藥典 2010年二部附錄Vffl I牛血 清白蛋白殘留量測定法進 行，不得檢出牛血清白蛋 白?？股夭坏脵z出依據中華人民共和國藥典 2010年二部附錄IX A抗生 素殘留量測定法進行，不 得檢出青霉素、鏈霉素及 慶大毒素。檢驗方法除非另有說明，檢驗中僅使用確認為分析純的試劑和中華人民共和國藥典2010年版中規(guī)定的純化水。2.1 澄清度的測定稱取每升標示量的實驗室樣品，置于1000ml燒杯中，加水950ml,攪拌至溶解，補加水至1000ml, 攪拌均勻。按中華人民共和國藥典 2010年版二部附錄DCB進行。2.2 pH值的測定稱

5、取每升標示量的實驗室樣品，置于 1000ml燒杯中，加水950ml,攪拌至溶解，補加水至1000ml,攪拌均勻。按中華人民共和國藥典 2010年版三部附錄V A進行。2.3 干燥減量的測定按中華人民共和國藥典2010年版三部附錄叫L干燥失重測定法進行。2.4 滲透壓的測定稱取每升標示量的實驗室樣品，置于 1000ml燒杯中，加水950ml,攪拌至溶解，補加水 至1000ml,攪拌均勻。按中華人民共和國藥典 2010年版三部附錄V H滲透壓摩爾濃度測定法 進行。取兩次平行測定結果的算術平均值為測定結果,兩次平行測定結果的絕對差值不大于這 兩個測定值的算術平均值的5%2.5 細菌內毒素的測定按中華

6、人民共和國藥典2010年版三部附錄刈E細菌內毒素檢查法中的凝膠法進行。2.6 微生物限度的測定I / .按中華人民共和國藥典2010年三部附錄刈G散生物限度檢查法進行，檢查項目為細菌數、 霉菌數。檢查法采用平皿法。2.7 細胞生長試驗2.7.1 貼壁型細胞生長試驗2.7.1.1 方法提要1）本試驗所用容器具及溶液均為無菌，試驗操作過程均為無菌操作。2）細胞在37c恒溫條件下，在含體積分數3%£ 10%勺小牛血清的細胞培養(yǎng)液中生長 72h, 觀察細胞形態(tài)并進行細胞計數；細胞生長72h后，更換不含小牛血清的細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h,觀察細胞形態(tài)并進行細胞計數。2.7.1.2 試劑和材料

7、1）牛血清：符合中華人民共和國藥典 2010年版三部附錄Xin d I I2）平衡鹽溶液：稱取氯化鉀0.2g ,精確至0.01g ;無水磷酸二氫鉀0.2g ,精確至0.01g ; 氯化鈉8.0g,精確至0.01g;無水磷酸氫二鈉1.15g,精確至0.001g;加純化水1000ml,混 勻，測pH值，pH值應在7.5 ±0.3,過濾除菌即得。3）細胞：vero細胞（或根據不同的細胞培養(yǎng)基種類選擇適應的細胞 ）:細胞代次不超過150 代。4）細胞培養(yǎng)液：按產品使用說明書要求配制；3）胰蛋白酶溶液：稱取胰蛋白酶（1:250） 2.5g,精確至0.01g,力口 1000ml平衡鹽溶液， 混勻

8、、測pH值，用1mol/LNaOH或1mol/LHCl調pH值7.67.8 ,過濾除菌即得。2.7.1.3 儀器1）醫(yī)用凈化工作臺：潔凈級別為百級.2）二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱：能通二氧化碳氣體并且保持二氧化碳體積分數為（5±0.1） %,能在（37±1） C恒溫。歡迎閱讀3）細胞培養(yǎng)瓶：T25型、無菌。4）顯微鏡：倒置、相差。5）血球計數板。6）蓋玻片：無水乙醇浸泡并擦干。2.7.1.4 試驗步驟1）制備細胞懸液A取長成致密單層的細胞種子，將原細胞培養(yǎng)液從細胞培養(yǎng)瓶內吸出，用適量平衡鹽溶 液洗細胞一次，棄洗液（去除死細胞）。B向細胞培養(yǎng)瓶內加入胰蛋白酶溶液 1ml,消化一定時間

9、，在顯微鏡下觀察，當細胞變圓 接近脫壁時，將胰蛋白酶溶液倒掉。C根據細胞數量加入一定量細胞培養(yǎng)液，用吸管吹打，使細胞脫壁制成細胞懸液Ao2）細胞培養(yǎng)A吸取一定量的細胞懸液 A,加到細胞培養(yǎng)瓶內。B向細胞培養(yǎng)瓶內加至10ml含體積分數為3%£ 10%勺小牛血清的細胞培養(yǎng)液，使細胞接 種數量為5X104細胞/ml。C將細胞培養(yǎng)瓶送入培養(yǎng)箱，在（37± 1） C溫度條件及（5±0.1） %二氧化碳條件下進 行培養(yǎng)。D培養(yǎng)72h,觀察細胞形態(tài)，按照2.7.1.4步驟1）方法制備細胞懸液，進行活細胞計數。E培養(yǎng)72h后，更換不含牛血清的細胞培養(yǎng)液10ml,繼續(xù)培養(yǎng)48h,觀

10、察細胞形態(tài)，按照2.7.1.4 I .試驗步驟1）方法制備細胞懸液，進行活細胞計數。3）細胞計數A等需要計數的細胞按按照2.7.1.4步驟1）方法制備細胞懸液Bo吸取細月fi懸液B100N l轉移至離心管中，視細胞量確定是否稀釋及稀釋倍數。等蓋玻片蓋于計數板中心的計數室上方。調整計數板中的細胞數量在（100300）個。沿蓋玻片邊緣點加細胞懸液使其通過毛細作用自然滲入，不要留有氣泡，不要外溢，顯微鏡 下計數。匚觀察計數板四角大方格中的細胞數，細胞壓中線時，一般遵循“計左不計右，計上不計下”的原則。將計數板觀察細胞數代入下列公式：計數板觀察細胞數X 104 X稀釋倍數/4 =細胞數/ml2.7.1

11、.5分析結果的表述歡迎閱讀培養(yǎng)72h的細胞，細胞形態(tài)應正常，活細胞數量應達到 1X105個/ml以上。繼續(xù)維持培養(yǎng) 48h的細胞形態(tài)應正常，活細胞數量應不小于 1X105個/ml以上。2.7.2 懸浮型細胞生長試驗2.7.2.1 方法提要本試驗所用容器具及溶液均為無菌，試驗操作過程均為無菌操作。細胞在37c恒溫條件下，在細胞培養(yǎng)液中懸浮生長 72h,觀察細胞形態(tài)，進行72h細胞計 數。試劑和材料I / _1）細胞：已適應待檢細胞培養(yǎng)基的懸浮細胞株。2）細胞培養(yǎng)液：按產品使用說明書要求配制；儀器1）醫(yī)用凈化工作臺：潔凈級別為百級；2）恒溫震蕩培養(yǎng)箱：能在（37 ± 1） C恒溫；3）細

12、胞培養(yǎng)瓶：250ml搖瓶，應無菌；4）顯微鏡：倒置、相差；細胞培養(yǎng)1）用方瓶或搖瓶擴增細胞；2）離心細胞，用待測細胞培養(yǎng)液重懸細胞，計數，計算出所需要的細胞數；3）將細胞轉至搖瓶中，細胞數量接種數量為 2.5X105個/ml,加液量20ml左右；4）將搖瓶細胞移至恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉速 90100rpm,溫度37C；5）培養(yǎng)72h,記錄細胞數量和活率（采用0.4%的臺盼藍染色法計數及計算活率）。1）細胞染色：取吸管1支，伸入培養(yǎng)瓶中，輕輕反復吹打細胞懸液使細胞重懸均勻后，立 即吸細胞懸液少許，向另一離心管中滴入細胞懸液 1份，冉滴入臺盼藍染液1份，混勻，置2 3分鐘。2）計數：步驟1）進行。鏡下觀察可見細胞分散各處，健康細胞胞體完整，透明不著色， 凡著色細胞均為死細胞。記錄活細胞數及細胞總數。3）活率計算細胞活率二（活細月fi數量/細胞總