豬瘟標(biāo)記疫苗研究現(xiàn)狀.docx

1、i專論與講座%豬瘟標(biāo)記疫苗研究現(xiàn)狀鄒海濤撤，蘭鄒然2，姜平I(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京210095,2.山東省動物疫病預(yù)防與控制中心，山東濟(jì)南250022)摘要：豬瘟是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的烈性傳染病，病死率很高，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須報告的動物傳染病。在我國，豬瘟弱毒疫苗的應(yīng)用一定程度上控制了該病的暴發(fā)和流行，但是目前尚沒有方法可以區(qū)別豬瘟疫苗免疫抗體和野毒感染抗體，豬瘟病毒的隱性感染和散發(fā)仍然影響我國生豬產(chǎn)品質(zhì)量及出口。因此，新型豬瘟標(biāo)記疫苗的研制成為目前豬瘟防控工作的迫切需求。論文在介紹豬瘟病毒分子特征及傳統(tǒng)疫苗的基礎(chǔ)上，對國內(nèi)外新型豬瘟標(biāo)記疫苗研究取得的進(jìn)展進(jìn)行

2、了系統(tǒng)的闡述。關(guān)鍵詞：豬瘟；豬瘟病毒；標(biāo)記疫苗中圖分類號:S852.659文獻(xiàn)標(biāo)識碼：H文章編號：1007-5038(2011)11-0111-05豬瘟(Classicalswinefever,CSF)是由豬瘟病毒(Classicalswinefevervirus,CSFV)引起的以急性出血和發(fā)熱為主要特征的烈性傳染病，病死率很高，對養(yǎng)豬業(yè)危害極大，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須報告的動物傳染病。近年來，該病在美洲、亞洲、歐洲等國家和地區(qū)呈現(xiàn)復(fù)發(fā)的趨勢，一些宣布已消滅豬瘟的國家(如德國、比利時等)又見豬瘟復(fù)發(fā)的報道。在我國，弱毒疫苗的廣泛使用使豬瘟得到一定程度控制，發(fā)病率和病死率均明顯降

3、低。但是弱毒疫苗最大的缺陷就是無法鑒別免疫抗體和野毒感染抗體，這使豬瘟的撲滅成為難題，導(dǎo)致目前豬瘟流行呈現(xiàn)典型豬瘟和非典型豬瘟共存、持續(xù)感染與隱性感染共存、免疫耐受和帶毒綜合征共存等現(xiàn)象。豬瘟的隱性感染/帶毒現(xiàn)象加劇，導(dǎo)致繼發(fā)和并發(fā)感染嚴(yán)重，藥物使用大幅增加，食品安全問題日益突出。美國、歐盟等國家地區(qū)早已禁止使用豬瘟弱毒疫苗，它們選擇通過撲殺來凈化疫區(qū)。由于擔(dān)心在普通免疫的“保護(hù)傘”下隱藏有豬瘟野毒，所以上述國家及地區(qū)往往不從任何有豬瘟疫情或注射豬瘟弱毒疫苗的國家進(jìn)口生豬及相關(guān)產(chǎn)品，這對我國影響極大。況且C株疫苗已延用了半個多世紀(jì)，在長期的免疫壓力下，豬瘟流行毒株已向遠(yuǎn)離疫苗毒的方向演化，豬瘟

4、弱毒疫苗的免疫效力也越來越多的受到質(zhì)疑。因此，新型豬瘟標(biāo)記疫苗的研制成為當(dāng)前我國豬瘟防控工作的迫切要求。1.豬瘟病毒收稿日期：2011-05-27作者簡介：鄒海濤(1987-)，男.山東青島人，碩士，主要從事動物傳染病防治與檢測研究。*通訊作者豬瘟病毒(CSFV)是一種有囊膜的正股單鏈RNA病毒，屬黃病毒科(Flaviviridae).瘟病毒屬(Pestivirus)。病毒基因組長約12.3kb,分為三部分,依次為5,無帽非編碼區(qū)(5，UTR)、開放編碼框(ORF)、3,無poly(A)尾非編碼區(qū)(3-UTR)。CSFV的ORF可編碼一個多聚蛋白，該多聚蛋白可被剪切為4種結(jié)構(gòu)蛋白(C、Erns

5、、El、E2)以及8種非結(jié)構(gòu)蛋白(N阿、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。其中E2蛋白是最主要的保護(hù)性抗原，它不僅是主要的B細(xì)胞抗原，同時也是重要的T細(xì)胞抗原。它也是CSFV毒力的決定因子之一，若將CSFV強(qiáng)毒株的E2基因進(jìn)行替換，毒株的毒力將明顯大幅減弱。E2蛋白在CSFV各毒株間的保守性要遠(yuǎn)低于E-*蛋白，其抗原性呈復(fù)雜性與多樣性發(fā)展，因此CSFV在自然進(jìn)化過程和長期的疫苗選擇壓力下，可能會通過改變其抗原性來逃避宿主的免疫監(jiān)控，達(dá)到持續(xù)性感染的目的。Eg與CSFV對宿主細(xì)胞的嗜性以及致病性有密切關(guān)系，但并非CSFV復(fù)制所必須。有RNase活性，可降解病毒和細(xì)胞

6、的RNA。作為惟一分泌到CSFV感染細(xì)胞上清中的糖蛋白，在機(jī)體內(nèi)可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和譜很窄的抗體，使機(jī)體獲得有限CSFV的免疫力。2新型豬瘟標(biāo)記疫苗從20世紀(jì)90年代初開始，各國就開始通過不同的手段和方法來研發(fā)新型CSFV標(biāo)記疫苗，諸如重組活載體疫苗、基因缺失疫苗、DNA疫苗、亞單位疫苗等，并取得了一定的進(jìn)展。2.1重組豬癟活載體疫苗某些病原體對宿主不產(chǎn)生致病作用，但是利用其內(nèi)購在動物體內(nèi)感染并復(fù)制的特點，我們可以將之改造為理想的疫苗載體。目的基因通過載體在宿主體內(nèi)得到表達(dá)，從而產(chǎn)生長期的體液及細(xì)胞免疫應(yīng)答。由于插入的目的基因只是原病毒基因的一部分，因此可以比較容易設(shè)計出相應(yīng)的ELISA檢測方法來區(qū)

7、分免疫動物與感染動物。2.1.1痘病毒栽體疫苗痘病毒（Poxvirus）的基因組較大，可以插入大片段的外源基因（超過25kb）,同時表達(dá)多個目的基因，且各基因表達(dá)彼此不干擾，遺傳穩(wěn)定。痘病毒僅在感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行復(fù)制，不會整合到宿主基因當(dāng)中，不存在產(chǎn)生插入突變的隱患，具有較高的生物安全性。痘病毒具有多種感染途徑，可以通過皮下、肌肉和黏膜等多種方式接種。從20世紀(jì)90年代起，國內(nèi)外就開始利用痘病毒作為疫苗載體，進(jìn)行豬痕標(biāo)記疫苗的研究。VoigtH等6】首先對試驗豬外周血中的淋巴細(xì)胞進(jìn)行抑制性處理，然后采用多點肌下接種的方法使用重組口瘡病毒ORFVVrV-E2對試驗豬進(jìn)行免疫。攻毒后，免疫豬未

8、表現(xiàn)出臨床癥狀，血液中也未檢測到CSFV存在。李譜華等則選擇雞痘病毒（Fowlpoxvirus）作為載體，將CSFV石門株的Era*和E2基因克隆入雞痘病毒表達(dá)載體FPV-P11中，成功構(gòu)建了重組雞痘病毒，免疫豬后用100LD”的強(qiáng)毒進(jìn)行攻擊，結(jié)果顯示免疫組保護(hù)率達(dá)到75%,為進(jìn)一步研制豬痕活載體疫苗奠定了基礎(chǔ)。2.1.2偽狂犬病病毒（PRV）栽體疫苗豬偽狂犬病病毒（PRV）基因組為單分子雙股DNA,大小約為150kb,外源基因可以穩(wěn)定的插入其中。目前，PRV基因缺失疫苗株多是通過缺失gE、gI、gG、gC、TK等非必需基因，現(xiàn)有的PRV基因缺失疫苗已在世界上廣泛應(yīng)用，安全性已得到了有效驗證。

9、重組PRV還具有毒力不返強(qiáng)，易于與野毒區(qū)別的特點。因此PRV越來越多的被作為一種活載體，用以研制各類動物疫苗。PeeterS等將CSFVE2基因插入到PRVgE基因缺失突變株的gD位點，構(gòu)建了表達(dá)E2蛋白的gE、gD雙基因缺失重組病毒ID57.1。該重組病毒的復(fù)制僅局限于注射部位，從而消除了其水平傳播的可能，提高了生物安全性。其后的攻毒保護(hù)試驗中，接種動物接受致死劑慌的攻毒，存活率為100%。劉燕等將SV40啟動子控制下的LacZ報告基因表達(dá)盒與分別在CMV啟動子控制下的含有CSFVE2基因及PRRSVGP5基因的表達(dá)盒插入到PRVBartha-K61株TK基因中，通過藍(lán)斑篩選獲得了一株插入E

10、2、GP5與LacZ基因的柬組偽狂犬病病毒，命名為rPRV-E2-GP5°經(jīng)Westernblot、間接免疫熒光試驗證實E2、GP5基因在重組病毒感染細(xì)胞中獲得表達(dá)。由此可以看出PRV載體在構(gòu)建CSFV與其他豬病的多聯(lián)疫苗上具有相當(dāng)大的發(fā)展前景。2.1.3 腺病毒栽體疫苗腺病毒（AdV）載體具有可感染分裂和非分裂細(xì)胞、高滴度制備、易純化、外源基因裝載容量大等優(yōu)點，故其現(xiàn)被廣泛用于疫苗的設(shè)計。相關(guān)研究還發(fā)現(xiàn)在豬群感染AdV野毒并不會影響重組腺病毒疫苗的免疫效果口°】。這可能與疫苗包含了完整的AdV基因組有關(guān)。孫元等將CSFV石門株的E2全長基因片段，定向克隆到重組腺病毒AdE

11、asy-1系統(tǒng)的穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV±,然后在大腸埃希菌與骨架載體AdEasy中進(jìn)行同源重組，最后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，成功包裝出重組腺病毒rAdV-E2,分別在兔體和豬體上進(jìn)行動物試驗。試驗結(jié)果顯示兔體交換試驗中的兔只未出現(xiàn)定型熱反應(yīng)，接種rAdV-E2的試驗豬則能完全抵抗CSFV強(qiáng)度石門株的攻毒。目前，該研究已進(jìn)入疫苗開發(fā)程序。何雷等口幻在此基礎(chǔ)上將IL-2基因加入到腺病毒載體中，使之與E2基因共表達(dá)，其后的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗和動物試驗結(jié)果均表現(xiàn)了其良好的免疫效力。孫宏宇等日將PRRSV的GP5和CSFV的E2基因通過口稀疫病毒（FM-DV）2A序列連接，形成一個完整的ORF

12、,最后插入到腺病毒載體中，得到重組腺病毒rAdV-GP52AE2.間接免疫熒光試驗和Westernblot證實2種蛋白均得到表達(dá)，小鼠免疫效力試驗也取得理想的效果，故其有望開發(fā)為一種新型多聯(lián)疫苗。2.1.4 牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）載體疫苗作為CSFV的同屬病毒，BVDV與CSFV具有明顯的交叉反應(yīng)性。CSFV僅以家豬和野豬為自然感染宿主，而BVDV則能夠越過種間障礙感染包括豬、牛等一系列家畜和野生動物。BVDV-2中的一部分弱毒株對豬沒有致病力，并且不能在豬群間傳播。這些弱毒可以保護(hù)豬群抵抗CSFV感染，同時也不影響CSFV的血清學(xué)診斷。這表明一些BVDV弱毒株可能是CSFV標(biāo)記疫苗的理

13、想載體。ReimannI等詢以BVDV弱毒CP7株為框架，通過反向遺傳學(xué)方法用CSFVAlfort/187株的E2基因替換CP7株的相應(yīng)區(qū)段，構(gòu)建了嵌合病毒CP7-/E2PacI,接種后可以保護(hù)豬只抵抗CSFV的致死性感染。對免疫后3周動物g清進(jìn)行ELISA檢測，結(jié)果只能檢測到針對CSFVE2蛋白的特異性抗體，而檢測不到針對CSFVE"蛋白的抗體。后來ReimannI等川】在此基礎(chǔ)上又用CSFVAlfort/187株的E1、E2基因分別替換CP7的相應(yīng)片段。為了使其與野毒相區(qū)別，他們又將CSFVE2基因中的抗原性表位TAVSPTTLR用BVDVCP7株的相應(yīng)表位進(jìn)行替換，從而獲得重組

14、嵌合病毒CP7-ElE2aIf-TLAO在其后的攻毒保護(hù)試驗中，該嵌合體雖然在免疫保護(hù)效力上與C株相差不大，但是并沒有獲得預(yù)想中與野毒的可區(qū)分性。總的來說，BVDV載體疫苗具有較高的免疫原性，但在配套檢測和生物安全性上還有待驗證和提高。目前國內(nèi)尚無此類研究的報道。2.2基因缺失/突變疫苗隨著對CSFV分子病毒學(xué)的發(fā)展，研究者們發(fā)現(xiàn)CSFV感染過程中誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體主要是與非結(jié)構(gòu)蛋白NS3以及囊膜蛋白E-.E2發(fā)生反應(yīng)。但是，NS3中所含的抗原表位在瘟病毒屬成員中間具有相當(dāng)高的保守性，很難進(jìn)行鑒別區(qū)分博）。因此，£血和E2更適合作為基因缺失/突變位點來設(shè)計基因缺失疫苗。另外，敲除/突變C

15、SFV的其他基因區(qū)段（如NPe）也可減弱病毒毒力。卬皿是一種阻遏物，能夠阻止dsRNA介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程以及IFN-a/p的生成。在CSFV感染細(xì)胞中，它能夠抑制IRF-3的轉(zhuǎn)錄表達(dá)MayerD等如使用鼠的泛素來替換村即，分別在強(qiáng)毒株Alfort/187和Eystrup的基礎(chǔ)上，構(gòu)建出了2個穩(wěn)定的CSFV弱毒株。試驗動物在接種一次弱毒以后能夠抵抗強(qiáng)毒株Eystrup的攻毒。但NP"蛋白在感染動物體內(nèi)產(chǎn)生的抗體并不能達(dá)到ELISA檢測水平，所以N期基因缺失株必須同時進(jìn)行額外的修飾來達(dá)到可鑒別的目的。HolinkaLG等口們則采用另一種思路設(shè)計出一種雙標(biāo)記弱毒疫苗。他們將一個名為“Fla

16、g”的標(biāo)記性抗原表位插入到E1蛋白序列當(dāng)中。同時他們對單克隆抗體WH303位于E2基因中的結(jié)合表位進(jìn)行改造。由于該表位為CSFVE2特異性表位且具有高度的保守性，故他們選擇將該表位敲除，最后拯救出重組病毒FlagT4v。其后的動物試驗數(shù)據(jù)表明，該重組病毒接種后，僅需2d3d即可產(chǎn)生保護(hù)力對抗強(qiáng)毒Brescia株的攻毒。從接種動物血清樣本中分離的抗體可以與Flag表位發(fā)生特異性結(jié)合，但不能與根據(jù)WH303表位合成的多肽結(jié)合，實現(xiàn)了可鑒別性。2.3DNA疫苗與其他疫苗相比，DNA疫苗具有一系列的自身優(yōu)勢:設(shè)計簡單，易于進(jìn)行修飾操作。能夠同時誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)力的體液和細(xì)胞免疫。安全性良好，不與野毒發(fā)生基因

17、重組，也不會整合到宿主基因組。不受母源抗體干擾。同時重組DNA質(zhì)?？赏ㄟ^發(fā)酵培養(yǎng)的方法來大量制備，又具有相對較好的穩(wěn)定性，并且大容量的質(zhì)粒還可同時容納多種病毒的免疫原基因，因此，DNA疫苗技術(shù)具有廣闊的發(fā)展前景。雖然是一種新興疫苗，但DNA疫苗在豬瘟標(biāo)記疫苗領(lǐng)域取得了相當(dāng)大進(jìn)展。李娜等河構(gòu)建了基于甲病毒SFV復(fù)制子的DNA疫苗pSFVlCS-E2,隨后的兔體交換試驗和豬體攻毒保護(hù)試驗均顯示了良好的免疫保護(hù)效果。后來，趙和平等】又在PSFV1CS-E2中插入PRV的VP22基因，構(gòu)建能夠表達(dá)E2與VP22融合蛋白的衍變體pSFVlCS-E2,然后與PSFV1CS-E2-UL49分別接種小鼠，進(jìn)行

18、對比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)衍變體PSFV1CS-E2-UL49產(chǎn)生的細(xì)胞免疫要明顯強(qiáng)于PSFV1CS-E2.這暗示PRV的VP22基因能夠有效增強(qiáng)DNA疫苗的免疫原性。萬超等西發(fā)現(xiàn)Toll樣受體調(diào)節(jié)分子TRIF也能夠增強(qiáng)DNA疫苗的免疫效果。這些發(fā)現(xiàn)為如何提高DNA疫苗的免疫原性帶來了新思路。孫元等E-24J則針對DNA疫苗抗原性低、起效慢等弱點，設(shè)計了基于DNA疫苗和重組腺病毒載體疫苗的Prime-boost聯(lián)合免疫策略，并進(jìn)行了動物試驗評估，為DNA疫苗的實際使用提供了參考。另外，E2蛋白跨膜區(qū)（TMR）在DNA疫苗上的作用一直存在爭議。這些爭議可能是由于試驗體系不同所造成的。缺失跨膜區(qū)可以使抗原更容

19、易分泌到細(xì)胞外的空間，加強(qiáng)了體液免疫應(yīng)答；反之，則側(cè)重于將E2蛋白保留在細(xì)胞膜上遞送給T細(xì)胞.加強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答。2.4亞單位疫苗E2亞單位疫苗是最早投入使用也是目前惟一投入使用的豬瘟標(biāo)記疫苗，其商品化產(chǎn)品為德國拜耳醫(yī)藥出品的BAYOVAC®CSFmarker和荷蘭英特威公司出品的Porcilis®Pesti,前者早在1998年即已被列入歐洲藥典。在E2蛋白基礎(chǔ)上開發(fā)的亞單位疫苗不僅能夠?qū)笴SFV野毒株，而且很容易通過檢測抗Em，蛋白的抗體將免疫的和感染的豬區(qū)分開來。國外普遍采用桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)來對重組E2蛋白進(jìn)行高水平表達(dá)。重組蛋白在昆蟲細(xì)胞內(nèi)能夠得到糖基化等加工處

20、理，所得產(chǎn)物具有天然構(gòu)象，生物活性高。張文杰等采用與國外相同的桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞技術(shù)路線取得成功。2009年臺灣研究者利用巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)成功的表達(dá)重組E2蛋白，并在其后的動物試驗中也取得成功I”】。不過，亞單位疫苗的缺陷也很明顯。目前來看，亞單位疫苗雖然具有良好的個體保護(hù)效果，但其接種動物血清中的E2抗體滴度上升較慢，也不能阻止CSFV病毒的水平傳播。而且接種動物血清中的E"抗體在接種后短時間內(nèi)無法達(dá)到可檢水平，這就造成了配套抗體鑒別檢測相當(dāng)大的局限性。國內(nèi)外許多機(jī)構(gòu)正在研究改進(jìn)亞單位疫苗的佐劑以及配套的ELISA檢測，取得了一定的進(jìn)展，為亞單位疫苗的發(fā)展帶來了一絲曙光。如果在今

21、后的研究中能夠解決亞單位疫苗的上述缺陷，亞單位疫苗的實際應(yīng)用必然會達(dá)到令人滿意的效果。3展望隨著獸醫(yī)生物制品技術(shù)的日新月異，CSF標(biāo)記疫苗也隨之不斷發(fā)展。雖然CSF標(biāo)記疫苗取得了長足進(jìn)步,但各種備選疫苗都還存在一定缺陷，比如免疫原性、配套DIVA(differentiatinginfectedfromvaccinatedanimals)血清學(xué)檢測、造價、抗體效價等，阻礙了其投入應(yīng)用的進(jìn)程。因此今后CSF標(biāo)記疫苗的研究不僅是開發(fā)新的具有可行性的CSF標(biāo)記疫苗設(shè)計策略，更重要的是要逐步解決已有備選CSF標(biāo)記疫苗的優(yōu)化問題，使其能夠真正的形成商品化產(chǎn)品，用來有效控制和預(yù)防CSF的暴發(fā)和流行,乃至徹底

22、消滅CSF。各國研究者已經(jīng)對此進(jìn)行了一定探索，主要內(nèi)容包括疫苗佐劑的選擇和優(yōu)化、Prime-boost聯(lián)合免疫策略的應(yīng)用、檢測方法改進(jìn)等。疫苗的設(shè)計策略是多種多樣的，我們?nèi)f網(wǎng)很難確定哪種方案才是最理想的選擇。在不同的研究中，疫苗劑量、免疫次數(shù)、免疫途徑、免疫攻毒之間的時間間隔均不相同，攻毒所用試驗動物、病毒毒株、攻毒劑最與途徑以及用來評估疫苗效果的標(biāo)準(zhǔn)也不相同。因此筆者認(rèn)為非常有必要根據(jù)上述因素建立一套通用的CSF疫苗效果評估參考標(biāo)準(zhǔn)，以此標(biāo)準(zhǔn)來對不同的CSF標(biāo)記疫苗策略進(jìn)行評估，從而選擇最適合我國豬瘟防控需求的疫苗策略。參考文獻(xiàn)：1 謝S.A華.新型豬瘟疫苗研究進(jìn)展J.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展.2008

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