凋亡調節(jié)因子與藥物耐受性

1、凋亡調節(jié)因子與藥物耐受性    腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性是臨床化療失敗的重要原因。本文綜述細胞凋亡調節(jié)因子p53、bcl-2、bax等對腫瘤細胞耐藥機制的影響和p53蛋白等對P一糖蛋白和多藥耐藥相關蛋白表達的調節(jié)作用，并介紹部分多耐藥性新的研究進展。 放療和化療對腫瘤細胞有明顯殺傷作用。然而成功治療的一個重要障礙是腫瘤細胞對上述治療無反應，并出現(xiàn)耐受細胞群，導致惡性腫瘤復發(fā)或浸潤進展。因此了解細胞對化療藥物耐受基礎成為許多實驗研究的熱點。一般而言，研究的重點是解釋治療因子怎樣達到細胞內靶位點，并檢查藥物與靶位點相互作用的分子基礎，如高水平表達MDRI基

2、因能夠限制多種藥物在細胞內的濃度，并引起多耐藥性（MDR）。 最近幾年里，探索和了解細胞凋亡機制，對腫瘤細胞獲得或失去耐受細胞毒性機制有了新的認識。 1 凋亡調節(jié)因子對耐藥性的調節(jié)作用 許多藥物能誘導細胞凋亡，包括抗代謝藥、脫氧核苷酸合成抑制劑、DNA拓撲異構酶抑制劑、烷化劑及干擾微管藥物等1。化療藥物引起凋亡的過程還不十分清楚，可能是藥物打斷了正常的細胞生長周期所致2。凋亡是一種可以被激活或抑制的可調節(jié)過程，因此可能還有在某些情況下藥物耐受性的新解釋。 1.1 p53 野生型p53（wt-p53）在細胞生長過程中以“分子警察”身份監(jiān)視細胞內DNA狀態(tài)，當DNA受損后，p53通過轉錄后穩(wěn)定機制

3、抑制細胞停留在G1期，使細胞有時間修復，若修復失敗，wt-p53將角發(fā)細胞凋亡。wt-p53缺乏或發(fā)生突變，將失去“分子警察”作用，不能誘導受損細胞凋亡，而使受損細胞得以生存。但由于細胞失G1期細胞周期檢查點的DNA損傷監(jiān)視作用，易造成諸如缺失、擴增和易位等染色體畸變。 Malcomson3采用溫控p53表達載體轉染鼠胚胎成纖維細胞株，在鬼臼乙叉甙（VP-16）作用下，32條件時，wt-p53表達，細胞滯留在G1期，明顯表現(xiàn)出對藥物介導凋亡的耐受性；而在37時，表達突變型p53，細胞在VP-16作用下，無明顯生長抑制，繼續(xù)增殖，并顯示出劑量依賴性的細胞凋亡增多。提示wt-p53能介導細胞對VP

4、-16的耐受性。wt-p53介導的耐藥性可能與藥物作用特點有關。VP-16為細胞周期特異性藥，主要作用于細胞周期的S期，干擾DNA的合成。一定劑量的VP-16作用細胞后，wt-p53使得細胞滯留在G1期而不繼續(xù)增殖，因此，VP-16作用的靶位點減少，如同Topo酶含量下降介導的耐藥性一樣，引起細胞對VP-16的耐藥性。Wosikowski4檢測13例對阿霉素（ADM）、長春花堿、順鉑（CDDP）、VP-16和胺苯丫啶等耐藥的乳腺癌細胞株，僅1例發(fā)生p53基因突變。 但許多學者認為低濃度化療藥物可引起表達wt-p53的細胞凋亡，在缺乏wt-婦生基因突變后，須大劑量藥物方能引起細胞死亡5、wt-p

5、53的缺失或突變間接導致了藥物耐受性。Lowe6通過體內實驗發(fā)現(xiàn)，表達Wt-p53基因的腫瘤細胞在經(jīng)放射性和ADM治療后，絕大多數(shù)細胞發(fā)生凋亡；相反，相同因子治療p53基因缺陷的腫瘤細胞MEFS，對放療和幾種化療藥物有較強的耐藥性。但將wt-p53基因轉染到MEFS細胞，低劑量放療，或小劑量的ADM、VP-16等藥物處理后細胞迅速凋亡。另有報道wt-p53能促進體外培養(yǎng)的人粘液表皮樣癌細胞凋亡。 p53對細胞耐藥性的調節(jié)可能是雙向的，具體作用方式可能與細胞種類、狀態(tài)及藥物作用特點和劑量有關。如突變型p53可能更多引起細胞對細胞周期非特異性藥物耐受，而wt-p53介導細胞對某些細胞周期異性藥物耐

6、受。 1.2 Bcl-2家族 一些研究發(fā)現(xiàn)bcl-2基因家族蛋白表達水平變化，能顯著改變腫瘤細胞株對化療藥物誘導凋亡的阻抗。Dole7用bcl-2表達載體轉染人類神經(jīng)母細胞瘤細胞株Shep-1，發(fā)現(xiàn)高表達bcl-2克隆的細胞株對CDDP和VP-16引起的細胞毒性呈劑量依賴性阻抗。Miyashita1采用基因轉染方法，發(fā)現(xiàn)bcl-2能使細胞增加對地塞米松、氨甲喋呤、阿糖胞苷、長春新堿（VCR）、VP-16和CDDP等藥物耐受性。與對照組細胞相比， bcl-2蛋白并不影響藥物對腫瘤細胞增殖的抑制作用，但在維持細胞存活中起著重要調節(jié)作用。在VP-16和CDDP等化療藥物去除后，bcl-2蛋白能夠重新

7、啟動細胞增殖，使細胞獲得耐藥性。 Pantazis8研究VCR誘導人白血病細胞株U-937/WT形成VCR耐藥細胞亞株U-937/RV，在U-937/WT細胞中不能檢出凋亡抑制蛋白bcl-2和bcl-xl表達，而在U-9377/RV均可檢出；但在U-937/RV中亦可檢出bax蛋白表達，后者是一種凋亡啟動因子，是一種bcl-2蛋白的異源二聚體，可抵銷bcl-2的活性作用，而在敏感株中未檢出bax蛋白。由此可見bcl-2家族在細胞耐藥過程中的作用也是相互調節(jié)和相互制約的。 1.3 p53與bcl-2家庭間的相互影響 細胞凋亡是一個多因子參加的復雜的生理過程，藥物影響能誘發(fā)p53和bcl-2等蛋白

8、發(fā)生一系列變化，參與細胞的耐藥性。 Miyashi9研究發(fā)現(xiàn)wt-p53能與bcl-2基因上p53依賴性的負反應元件結合抑制bcl-2的表達。Eliopoulos10檢測p53和bcl-2蛋白在敏感和耐藥的卵巢癌細胞株中表達水平，結果顯示耐藥株過度表達p53和bcl-2蛋白，且bcl-2作用環(huán)節(jié)可能在p53之上。許多臨床資料亦發(fā)現(xiàn)突變型p53和bcl-2蛋白的高表達與不良預后有關。 Ju11將wt-p53傳染wt-p53陰性的HL-60細胞形成轉染株SN3，與母代細胞相比，對化療藥物的敏感性明顯增加，如對CDDP和胸苷（thymidine）的敏感性分別增加2倍和50倍；而用突變型p53傳染的細

9、胞無比現(xiàn)象。用胸苷合成酶抑制劑FdUrd觀察與p53相關聯(lián)基因表達變化，在各種濃度的FdUrd存在下，很大比例的SN3細胞發(fā)生凋亡，而不是停留在S期。母代細胞有不確定的bax水平和高水平的bcl-2表達。在SN3細胞bcl-2檢測不出，并維持適當基礎水平的bax。FdUrd治療后，wt-p53和bax水平增加，但bax誘導早于p53，且平行出現(xiàn)細胞凋亡的DNA條帶。Perego12檢測p53與順鉑導致耐藥性間的關系時，發(fā)現(xiàn)在卵巢癌藥細胞株中，突變型p53失去激活bax基因轉錄能力。 這些資料說明p53、bax-2和bax等凋亡調節(jié)因子在腫瘤細胞的耐藥機制中起重要作用，但作用方式是復雜多樣的。

10、2 p53對耐藥蛋白的調節(jié)作用 p53具有不同結構區(qū)域。wt-p53與DNA共有區(qū)結合后，能正向調節(jié)一系列下游基因的表達。另外，wt-姢負向調節(jié)許多缺乏wt-p53共有區(qū)結合位點基因，包括DNA topo、MDRI、c-fos和其它病毒和細胞的啟動子。 2.1 p53對多藥耐藥相關蛋白（MRP）表達的調節(jié) 轉錄因子spl是MRP基因啟動子的強激動劑，wt-姢與spl結合，消除spl作用，從轉錄水平調節(jié)MRP表達。Wang13將帶有蟲熒光素酶標記報告基因的MRP啟動子與wt-p53共同轉染p53陰性的人類非小細胞肺癌細胞株H1299和鼠（10）1細胞，結果顯示wt-p53能呈劑量依賴性地顯著抑制MRP啟動子活性，wt-忍氣吞聲作用位點為-91到+103bp，該處有數(shù)個spl結合位點；而突為型p53只有很弱的作用。同時研究還發(fā)現(xiàn)wt-p53還能抑制高表達MRP的CEM/VM-1-5細胞的內源性MRP表達。Oshika14采用免疫組化技術檢測107例非小細胞肺癌標本，MRP和突變型p53表達有明顯相關性，雙染色技術顯示p53和MRP在一些細胞上同時表達，這些病人預后明顯羅無MRP和突變型p53患者差。 2.2 p53CF p-糖蛋白（P-gp）表達的調節(jié) P-gp是有MDR1基因編碼的多藥耐藥蛋白。wt-作用