基因診斷在遺傳病檢測(cè)中的應(yīng)用

1、基因診斷在遺傳病監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用 目前發(fā)現(xiàn)人類遺傳性疾病有3 000多種，如果僅依靠以往的染色體分析技術(shù)或?qū)虍a(chǎn)物與代謝物的測(cè)定，我們只能對(duì)其中為數(shù)極少的一部分疾病在發(fā)病前或產(chǎn)前進(jìn)行診斷。因?yàn)樵S多基因的表達(dá)有時(shí)相性和組織特異性（如有些基因在胎兒早期并不表達(dá)、苯丙氨酸羥化酶只在肝組織中表達(dá)）。用常規(guī)的方法采集的胎兒標(biāo)本或其他人體材料，常常不能測(cè)出這些基因的產(chǎn)物或代謝產(chǎn)物。然而，作為構(gòu)成機(jī)體基本單位的細(xì)胞，無(wú)論其來(lái)自何種器官或組織，它們的基因組成卻是完全一致的；雖然在某些特異化的組織細(xì)胞中某些基因并不表達(dá)，但那些基因的突變卻存在于一切細(xì)胞之中。如果采用基因分析的方法進(jìn)行監(jiān)測(cè)，在個(gè)體發(fā)育的任何階段，以

2、任何一種有核細(xì)胞為檢材，基因的缺陷都能被監(jiān)測(cè)出來(lái)。這就是近十幾年來(lái)飛速發(fā)展的重組DNA技術(shù)給遺傳病的早期（癥狀前和出生前）診斷帶來(lái)的福音。重組DNA技術(shù)不僅極大地豐富了我們對(duì)人類遺傳病分子病理學(xué)的知識(shí)，而且同時(shí)也提供了從DNA水平對(duì)遺傳病進(jìn)行基因診斷的手段。自從1978年發(fā)現(xiàn)第一個(gè)限制酶切位點(diǎn)多態(tài)性并應(yīng)用于遺傳病（鐮形細(xì)胞貧血）的基因診斷以后，能夠進(jìn)行基因診斷的病種不斷增加，方法和途徑越來(lái)越多。 一、基因突變的類型造成基因突變的原因很多，有自發(fā)的也有外界理化因素的影響。從DNA序列改變的角度來(lái)看，不外乎單核苷酸的取代和DNA片段的插入或缺失兩大類型。所產(chǎn)生的后果取決于突變發(fā)生的位置和性質(zhì)，只要

3、影響了基因表達(dá)過(guò)程中的任何一個(gè)環(huán)節(jié)，都會(huì)導(dǎo)致遺傳性疾病。歸納起來(lái)如表1所示表1 基因突變及效應(yīng)一覽表 DNA序列的改變突變發(fā)生的部位mRNA水平的表現(xiàn)基因產(chǎn)物的改變 舉 例1.大片段缺失或插入 整個(gè)基因缺如缺如地中海盆血 基因片段異常功能缺陷DMD、BMD2.少數(shù)核苷酸的缺失或插入 外顯子與內(nèi)含子接界拼接異常缺如 3的整數(shù)倍外顯子縮短或延長(zhǎng)異常（氨基酸缺失或插入）Hb Leiden非3的整數(shù)倍外顯子縮短或延長(zhǎng)異常（移碼突變）地中海盆血3.單核苷酸取代 啟動(dòng)子減少減少地中海盆血 剪接信號(hào)剪接異常缺如地中海盆血 PolyA信號(hào)不穩(wěn)定減少地中海盆血 密碼子中性突變正常 密碼子錯(cuò)義突變氨基酸取代異常血

4、紅蛋白 密碼子或內(nèi)含子剪接異常缺如或移碼突變地中海盆血 密碼子無(wú)義突變肽鏈提前終止地中海盆血 終止密碼 肽鏈延長(zhǎng)，量減少Hb Canstant spring起始密碼地中海盆血缺如地中海盆血二、遺傳病基因診斷的途徑在了解了基因突變的各種類型之后，對(duì)應(yīng)用何種方法來(lái)診斷它們便很容易理解了。例如某種遺傳病是由于基因缺失造成的，可通過(guò)監(jiān)測(cè)受檢者是否缺失該基因來(lái)直接判斷其基因型。如果某遺傳病是核苷酸取代造成的點(diǎn)突變，便可以通過(guò)監(jiān)測(cè)該突變的方法（ASO探針或酶切位點(diǎn)監(jiān)測(cè)）來(lái)進(jìn)行診斷。如果致病突變或病因還不清楚，但有相關(guān)的基因探針或已知其與某位點(diǎn)的RFLP緊密連鎖，便可進(jìn)行家系分析，通過(guò)該位點(diǎn)狀態(tài)的連鎖分析進(jìn)

5、行監(jiān)測(cè)。下面根據(jù)不同的情況，舉例說(shuō)明基因診斷中常用的方法。1.直接監(jiān)測(cè) （1）應(yīng)用基因探針或PCR進(jìn)行缺失型基因監(jiān)測(cè) 部分地中海貧血和三分之二以上的杜氏及貝氏進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良（DMD及BMD）是整個(gè)基因或基因片段的缺失造成的。應(yīng)用基因探針（基因組DNA或cDNA探針）進(jìn)行Southern印跡雜交，如果某些雜交片段消失或片段長(zhǎng)度改變（不是由于限制酶識(shí)別位點(diǎn)的改變?cè)斐傻腞FLP），即可判定受檢者有基因缺失。應(yīng)用近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的PCR技術(shù)，也可進(jìn)行缺失基因的監(jiān)測(cè)。根據(jù)缺失發(fā)生區(qū)域的DNA序列，合成一對(duì)引物進(jìn)行基因擴(kuò)增（反應(yīng)體系中必須包含有另一無(wú)關(guān)DNA片段的擴(kuò)增引物，作為反應(yīng)是否成功的內(nèi)對(duì)照），通過(guò)

6、凝膠電泳檢查，如果沒有擴(kuò)增片段，便說(shuō)明該基因或該DNA片段缺失，對(duì)地中海盆血中的Hb Bart水腫胎兒的產(chǎn)前診斷和DMD/BMD的產(chǎn)前基因診斷都是應(yīng)用此法進(jìn)行。（2）造成特異限制酶切位點(diǎn)改變的突變基因的監(jiān)測(cè) 有時(shí)，某些“點(diǎn)”突變（一般為單個(gè)核苷酸的取代或少數(shù)幾個(gè)核苷酸的缺失或插入）正好影響了某種限制酶的識(shí)別位點(diǎn)（丟失或增加），對(duì)這些與基因突變相關(guān)的酶切位點(diǎn)的改變，可用來(lái)進(jìn)行突變基因的直接監(jiān)測(cè)。例如珠蛋白基因密碼子6處有一Mst的識(shí)別位點(diǎn)（CCTGAGG），而在HbS病人的珠蛋白基因，因其密碼子6由GAG（谷氨酸）突變?yōu)镚TG（纈氨酸），破壞了Mst的識(shí)別序列。使得正常的兩個(gè)雜交片段（1.15k

7、b,0.2kb）消失，而出現(xiàn)一個(gè)異常的1.35kb(1.15+0.2=1.35)片段。許多實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用-S基因的這個(gè)特異標(biāo)志，直接用Mst酶解珠蛋白基因相應(yīng)區(qū)域的PCR產(chǎn)物進(jìn)行HbS病的產(chǎn)前基因診斷。（3）突變位點(diǎn)特異性監(jiān)測(cè)ASO探針斑點(diǎn)雜交 絕大多數(shù)“點(diǎn)”突變不改變酶的識(shí)別位點(diǎn)，但經(jīng)DNA序列分析明確基因的突變的細(xì)節(jié)之后，可人工合成針對(duì)突變位點(diǎn)的特異寡核苷酸（allele specific oligonucleotide,ASO）探針，進(jìn)行突變基因的直接監(jiān)測(cè)。ASO探針的長(zhǎng)度一般為19個(gè)堿基，分別與被測(cè)定的突變所在區(qū)域的正常和異常DNA序列互補(bǔ)。在一定的雜交和洗脫條件下，只要有一個(gè)堿基不匹配，

8、就不能形成穩(wěn)定的雜交鏈，正常探針只能與正常基因序列雜交而不能與突變基因的序列雜交，反之亦然。1983年Conner等首先應(yīng)用ASO探針進(jìn)行鐮形細(xì)胞貧血的基因監(jiān)測(cè)，現(xiàn)在已廣泛應(yīng)用于地中海貧血及其他遺傳性疾病的基因診斷。PCR技術(shù)的發(fā)明使ASO探針的使用更加快速簡(jiǎn)便。用PCR產(chǎn)物進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，不僅降低了同源序列的背景干擾，而且降低了對(duì)探針?lè)派鋸?qiáng)度的要求?？梢杂梅欠派湫晕镔|(zhì)進(jìn)行探針標(biāo)記，操作安全，并且不受同位素半衰期的限制。目前對(duì)地中海貧血、經(jīng)典型PKU等基因的診斷，都是應(yīng)用此途徑。2.間接分析監(jiān)測(cè)致病基因RFLPs連鎖分析 進(jìn)行限制酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）連鎖分析，目前還是施行基因診斷的主要

9、手段。對(duì)于遺傳性疾病，目前了解其病因的只是其中的一小部分。即使對(duì)那些已經(jīng)知道了結(jié)構(gòu)基因的遺傳病，由于其致病突變的細(xì)節(jié)（即核苷酸序列的改變）一時(shí)還不了解，還不能合成相應(yīng)的寡核苷酸探針進(jìn)行PCR/ASO監(jiān)測(cè)。更不用說(shuō)那些目前連其遺傳缺陷的生化機(jī)理尚不明確的遺傳性疾病了。對(duì)于這一類基因缺陷的監(jiān)測(cè)，只能通過(guò)間接的途徑，即應(yīng)用RFLP連鎖分析進(jìn)行基因診斷。一般說(shuō)來(lái)RFLP分析所監(jiān)測(cè)到的DNA多態(tài)性通常是中性突變，與基因的致病突變之間不存在連鎖不平衡性，因此一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)存在與否并不說(shuō)明基因是否異常。只有在特定的家系中才具有一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系。多態(tài)性位點(diǎn)在基因連鎖分析中的應(yīng)用價(jià)值，除了它與致病突變之間連鎖的緊密

10、程度以外，還與它的雜合頻率有關(guān)。連鎖越緊密所得結(jié)果越可靠；雜合頻率越高應(yīng)用價(jià)值越大。我們用多態(tài)性信息量（polymorphism information contents,PIC）來(lái)衡量，PIC是指某一家系可以利用RFLP作為遺傳標(biāo)志進(jìn)行基因連鎖分析的概率；就整個(gè)群體而言，它是指在群體中利用這些RFLP進(jìn)行基因診斷的診斷率。有時(shí)單單分析一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，還不能將某一家系中的致病基因所在染色體與正常染色體區(qū)分開來(lái)，必須分析多個(gè)位點(diǎn)的狀態(tài)，綜合起來(lái)才能獲足夠的信息。我們將一條染色體上兩個(gè)或兩個(gè)以上與致病基因密切連鎖的多態(tài)性位點(diǎn)狀態(tài)的組合叫作染色體單倍體型（haplotype）。無(wú)論是何種遺傳性疾病，

11、只要有與之密切連鎖的RFLP位點(diǎn)（基因本身或鄰近的DNA序列），便可應(yīng)用核心家系成員（先證者及父母）的DNA進(jìn)行RFLP分析，確立致病基因所在染色體與RFLP位點(diǎn)狀態(tài)的連鎖關(guān)系。但只有在那些連鎖關(guān)系明確、正常與異常染色體能夠區(qū)別的家系中，才能對(duì)家系成員進(jìn)行癥狀前或產(chǎn)前基因診斷。（1）應(yīng)用基因探針進(jìn)行RFLPs分析 應(yīng)用基因探針（基因組DNA或cDNA探針）所監(jiān)測(cè)到的RFLP位點(diǎn)在基因的內(nèi)部或基因附近，它與基因突變位點(diǎn)之間連鎖非常緊密，通常情況下很少發(fā)生重組（除非基因本身非常龐大，如抗肌萎縮蛋白基因，2300kb），因此非?？煽?。DNA序列已經(jīng)明確的基因內(nèi)或旁側(cè)序列中的酶切位點(diǎn)的多態(tài)性狀況還可以

12、用PCR方法來(lái)監(jiān)測(cè)。PCR擴(kuò)增后用相應(yīng)的限制酶來(lái)酶解擴(kuò)增產(chǎn)物，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳確定DNA片段是否被酶解成小片段；或者將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行ASO斑點(diǎn)雜交判斷基因座的狀態(tài)。用基因探針直接和間接分析法可診斷的遺傳病見表2和表3。表2 用RFLPs直接分析法可診斷的遺傳?。ú煌耆y(tǒng)計(jì)） 遺傳病基因探針軟骨發(fā)育不全型膠原蛋白腎上腺皮質(zhì)增生癥類固醇21羥化酶淀粉樣多發(fā)神經(jīng)病變前白蛋白抗凝血酶缺乏癥抗凝血酶Ehlers-Danlos綜合征1(1)膠原蛋白 第10因子缺乏癥第10因子A型血友病第8因子及合成寡核苷酸B型血友病第9因子高膽固醇血癥低密度脂蛋白受體HPRT缺乏癥HPRT免疫球蛋白k鏈缺乏癥免疫球

13、蛋白CkLesch-Nyhan綜合征HPRTMarfan綜合征微纖維元基因FN1型成骨不全原1（1）膠原蛋白地中海貧血珠蛋白 珠蛋白合成寡核苷酸抗胰蛋白酶缺乏癥合成寡核苷酸DMD、BMD抗肌萎縮蛋白基因表3 用RELPs間接分析法可診斷的遺傳病(不完全統(tǒng)計(jì)) 遺傳病基因探針淀粉樣變性前白蛋白1抗胰蛋白酶缺乏癥1抗胰蛋白酶載脂蛋白C缺乏癥載脂蛋白C動(dòng)脈粥樣化載脂蛋白A型生長(zhǎng)激素缺乏癥生長(zhǎng)激素A型血友病第8因子B型血友病第9因子甲狀腺機(jī)能低下甲狀腺球蛋白高膽固醇血癥低密度脂蛋白受體基因高脂血癥載脂蛋白A高甘油三酯血癥載脂蛋白ALesch-Nyhan綜合征HPRT苯丙酮尿癥苯丙氨酸羥化酶地中海貧血珠

14、蛋白血栓形成抗凝血酶DMD、BMDPERT87-8 P20（2）應(yīng)用染色體DNA片段作探針進(jìn)行RFLPs分析 除了基因探針之外，還有一些探針是基因組DNA片段。這些從基因組文庫(kù)中分離獲得的DNA片段，在確定了其能監(jiān)測(cè)出某些限制酶的RFLP后，便可用作探針的候選者。經(jīng)過(guò)染色體定位，大致判定其是否與目前已知的遺傳性疾病有連鎖關(guān)系，然后再通過(guò)對(duì)此遺傳性疾病家系的RFLP連鎖分析和優(yōu)勢(shì)對(duì)數(shù)計(jì)分（Lod score），確定是否密切連鎖。如是，便可用作基因分析以至基因診斷的探針，如-3HVR序列用于APKD的基因分析（表4）。表4 用DNA片段為探針監(jiān)測(cè)的遺傳?。ú煌耆y(tǒng)計(jì)） 遺傳病 基因探針腎上腺白質(zhì)營(yíng)

15、養(yǎng)不良（adrenoleukodystrophy）Stl4成人型多囊腎珠蛋白遺傳性腎炎DXS3 DSS1纖維囊性變LAM4-917脆X綜合征第9因子5q-綜合征C-fmsBechwith-Wiedmann綜合征第11號(hào)染色體DNA片段貓叫綜合征第5號(hào)染色體DNA片段成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤綜合征第13號(hào)染色體DNA片段Wilms瘤第11號(hào)染色體DNA片段Wolf-Hirschhorn綜合征第4號(hào)染色體DNA片段Huntington舞蹈病G8通過(guò)RFLP連鎖分析，還可進(jìn)行反向遺傳學(xué)的研究，即尋找那些目前尚未獲得的致病基因的DNA序列及其基因產(chǎn)物。某些遺傳病的致病基因（進(jìn)而正?；颍┚褪峭ㄟ^(guò)這個(gè)途徑被揭示出

16、來(lái)的，如DMD/BMD、囊性纖維變。PCR/ASO分析方法與RFLP連鎖分析比較，它具有直接、簡(jiǎn)化、快速、不需家系分析、用材少等優(yōu)點(diǎn)，更適用于產(chǎn)前基因診斷。但要對(duì)一種遺傳病的診斷達(dá)到如此的地步，要經(jīng)過(guò)一段漫長(zhǎng)而曲折的路。對(duì)于遺傳病的基因分析，總是先從臨床家系分析入手，了解它的遺傳規(guī)律，通過(guò)與其他遺傳標(biāo)志的連鎖關(guān)系或伴隨發(fā)生的染色體缺陷，進(jìn)行基因的染色體定位，再?gòu)娜旧w基因圖上尋找合適的連鎖的RFLP探針，進(jìn)行染色體步行（chromosome walking）或染色體跳躍（chromosome jumping），獲得新的連鎖更緊密的RFLP探針，最后獲得基因DNA片段本身。隨后再進(jìn)行DNA或相應(yīng)

17、的cDNA序列分析，明確基因的細(xì)微結(jié)構(gòu)及突變基因的致病突變細(xì)節(jié)，到此才有可能合成相應(yīng)的PCR引物和ASO探針（或者監(jiān)測(cè)基因內(nèi)或近旁的RFLP位點(diǎn)用的PCR引物及探針）。才有可能簡(jiǎn)化基因分析的程序。三、血友病的產(chǎn)前基因診斷舉例血友病是遺傳性凝血疾患中最為常見的一種，是由凝血因子的缺陷引起的。為X-連鎖隱性遺傳。根據(jù)因子缺陷的類型不同，血友病主要有甲、乙兩型。甲型血友病系由血漿中凝血因子（F）活性缺陷所致，約占全部遺傳性凝血疾病的75%。乙型血友病是因凝血因子（F）缺陷所致，發(fā)病率約為甲型的20%。也有F、F同時(shí)缺陷的，但不常見，稱為甲乙混合型血友病。1.血友病甲的臨床表現(xiàn) 血友病甲又稱經(jīng)典型血友

18、病，發(fā)病率約為1/10 000男性。女性患者極為少見。血友病患者多有家族史，新生突變者大約占20%30%。甲型血友病臨床表現(xiàn)為凝血困難及自發(fā)性出血傾向，如頻發(fā)的關(guān)節(jié)及軟組織出血，以大關(guān)節(jié)、下肢關(guān)節(jié)及其附帶肌群出血為常見?；颊甙l(fā)病早，自兒童期即有表現(xiàn)，出血頻度及嚴(yán)重程度與血漿中F活性水平相平行，50%患者血漿F活性水平僅為正常人的1%5%，臨床表現(xiàn)較嚴(yán)重。其余患者的F活性浮動(dòng)于正常值的5%20%之間，表現(xiàn)較輕。有些患者，其F水平可達(dá)正常的25%50%，幾乎沒有臨床癥狀，只是在外傷或手術(shù)時(shí)才發(fā)現(xiàn)有凝血障礙。這種異質(zhì)性可能與基因的缺陷類型不同有關(guān)。對(duì)于血友病的治療主要靠輸血療法。長(zhǎng)期反復(fù)的輸入全血或

19、凝血因子，經(jīng)濟(jì)上是一筆可觀的負(fù)擔(dān)；同時(shí)輸血反應(yīng)也是不可忽視的副作用，如免疫反應(yīng)、特別是目前引人注目的血源性病毒感染如AIDS、乙肝等疾病。此外邊遠(yuǎn)地區(qū)有限的醫(yī)療條件或突發(fā)無(wú)援的創(chuàng)傷所造成的對(duì)生命的威脅，亦使人們?nèi)ふ倚碌挠行緩絹?lái)施行產(chǎn)前基因診斷，配合選擇性人工流產(chǎn)以控制患兒出生。曾經(jīng)采用血液學(xué)和免疫生物學(xué)指標(biāo)進(jìn)行患者診斷、攜帶者的檢出，及應(yīng)用胎兒鏡采集胎兒血進(jìn)行F的分析進(jìn)行產(chǎn)前診斷。但這些方法或是準(zhǔn)確性差或是取血風(fēng)險(xiǎn)大，已經(jīng)被淘汰。1984年，國(guó)際上首次報(bào)告了應(yīng)用DNA RFLPs分析方法進(jìn)行甲型血友病的基因診斷。此法除可進(jìn)行胎兒的產(chǎn)前基因診斷外還可進(jìn)行基因攜帶者的監(jiān)測(cè)，風(fēng)險(xiǎn)小、準(zhǔn)確率高，因

20、此迅速被人們廣泛采用。2.凝血因子的基因缺陷 F基因位于Xq28，在Deuteran色盲基因和G6PD基因附近。F基因全長(zhǎng)約186kb,由26個(gè)外顯子和25個(gè)內(nèi)含子組成。其外顯子長(zhǎng)度從69bp到310bp不等，內(nèi)含子長(zhǎng)度變化于207bp32.4kb之間。F mRNA約長(zhǎng)9kb,cDNA長(zhǎng)9 009bp,5非翻譯區(qū)長(zhǎng)150bp，3非翻譯區(qū)長(zhǎng)1 806bp。產(chǎn)物由2 351個(gè)氨基酸組成，N端19個(gè)氨基酸為信號(hào)肽。成熟的F含2 332個(gè)氨基酸，分子量為264 763。分子可分成三個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域（A，B，C）：A1-A2-B-A3-Cl-C2。因子活化時(shí)，B結(jié)構(gòu)被水解。通過(guò)DNA序列分析，發(fā)現(xiàn)了不同類

21、型的點(diǎn)突變（表5），這些突變基因的產(chǎn)物可能是不完整的、無(wú)活性的或不穩(wěn)定的F肽鏈，因而臨床表現(xiàn)為輕重不一。表5 F基因的點(diǎn)突變類型 mRNA加工信號(hào)突變IVS-2CT,TCIVS-25AG無(wú)義突變1 941 ArgTermCGAUGA2 209 ArgTermGGAUGA2 166 ArgTermUGA2 307 ArgTermUGA錯(cuò)義突變291 GluGlyGAAGGA2 228 ArgGlnCGACAA此外還有些致病基因是基因片段缺失的結(jié)果但是大部分甲型血友病基因的突變細(xì)節(jié)仍不清楚，對(duì)這些基因的產(chǎn)前診斷只能靠RFLPs連鎖分析。3.甲型血友病的產(chǎn)前基因診斷 應(yīng)用印跡雜交技術(shù)進(jìn)行RFLPs連

22、鎖分析 在F基因內(nèi)及其旁側(cè)有多組RFLPs位點(diǎn)可供產(chǎn)前診斷（表6）。國(guó)內(nèi)沈巖等人應(yīng)用一系列探針（表7）對(duì)中國(guó)人F基因進(jìn)行了RFLPs分析（表8），發(fā)現(xiàn)了一組新的Stl4/Bct多態(tài)性位點(diǎn)，并成功地進(jìn)行了甲型血友病的產(chǎn)前基因診斷。表6 F基因內(nèi)及其旁側(cè)的RFLPs 限制酶位點(diǎn)探針片段長(zhǎng)度（kb）及頻率Bcle18P114.120.88(0.71)/1.77(0.29)Bgle26P1.85(0.74)/20(0.26)HindIVS-19 2.6(0.30)/2.7(0.70)Mspe26下游 7.5(0.68)/4.3+3.2(0.32)XbaIVS-19P482.64.8(0.59)/9.6

23、(0.41)BglDXS15DX132.8(0.5)/5.8(0.5)TaqDXS52St14-16.6(0.005)/5.4,5.2(0.045) 4.8(0.12)/4.5(0.36)/4.1,4.0(0.205) 3.9(1.105)/3.6(0.005)/3.4(0.155)表7 進(jìn)行甲型血友病基因分析所用的探針 質(zhì)粒名稱抗性宿主菌載體插入位點(diǎn)插入片段（kb）探針片段長(zhǎng)度（kb）p114.12AmpJM 101pUC12Stu/Sac0.65BamH/Sac 0.65p482.6AmpHB 101pUC8EcoR9.6EcoR/Sac 1.1St14-1Amp,TetHB 101pBR

24、322EcoR3.0EcoR 3.0DX13AmpHB 101pSP64EcoR2.2EcoR 2.214-E18AmpJM 101pUC18Sma/Hinc0.65/0.8EcoR/Hind 1.45pY3.4Amp,TetHB 101pBR322EcoR3.4EcoR 3.4表8 中國(guó)人F基因內(nèi)及其旁側(cè)RFLPs 位點(diǎn) 探針限制酶 RFLPs(kb)PIC外顯子18p114.12Bcl1.2(0.25)/0.9(0.75)0.38內(nèi)含子22p482.6Xba9.6(0.44)/4.8(0.56)049DXS52St14-1Bcl4.0(0.09)/3.3(0.12)/3.0(0.44)/2

25、.3(0.35)0.66 Taq6.6(0.01)/5.3(0.12) 4.8(0.17)/4.5(0.06)/4.1,4.0(0.02) 3.9(0.15)/3.3(0.31) 3.0(0.44)/2.3(0.35)0.81DXS15DX13Bgl5.8(0.19)/2.8(0.8)0.31在中國(guó)人中，F(xiàn)基因內(nèi)部的RFLPs與國(guó)外的報(bào)道基本一致，而基因外RFLPs則有很大差異如白種人中DX13位點(diǎn)Bgl的頻率為0.5，而中國(guó)人高達(dá)0.81；歐美人群的St14/Taq片段4.5kb和4.1kb出現(xiàn)頻率較高，而3.6kb較低，在中國(guó)人中正好相反。說(shuō)明結(jié)構(gòu)基因內(nèi)多態(tài)性位點(diǎn)具有較高的保守性，而基因外DNA序列變異較大，存在著群體差異。因此在應(yīng)用RFLPs進(jìn)行連鎖分析時(shí)，應(yīng)注意本民族本地區(qū)人群的RFLPs特點(diǎn)。此外，在進(jìn)行RFLPs連鎖分析診斷血友病時(shí)，應(yīng)該遵循以下三點(diǎn)：其一，首先確定攜帶者的基因型，尋找雜合的RFLPs位點(diǎn)。優(yōu)先