最新微生物限度檢查方法驗證方案

1、精選文檔微生物限度檢查方法驗證方案六、驗證內(nèi)容1 .供試液的制備1.1. 取供試品10g ，加 pH7.0 無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100ml ，充分振搖使混勻，作為1:10 的供試液。1.2. 取 1:10 供試品 10ml ，加 pH7.0 無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100ml ，充分振搖使混勻，作為1:100 的供試液。1.3. 取 1:100 供試品 10ml ， 加 pH7.0 無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100ml ， 充分振搖使混勻，作為1:1000 的供試液。備注：供試液制備若需加溫時，應均勻加熱，且溫度不超過45 。供試液從制備至加入檢驗用培養(yǎng)基，不得超過1 小時。2 . 菌液制備

2、2.1. 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆陳液體培養(yǎng)基中，30? 35 c培養(yǎng)1824小時；分別取上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液或 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，依次稀釋至、制成每1ml 含菌數(shù)為小于100cfu 的菌懸液。2.2. 接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，20? 25 C培養(yǎng)23天；取此培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液或pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，依次稀釋至，制成每 1ml含菌數(shù)為小于100cfu 的菌懸液。2.3. 將黑曲霉菌斜面的新鮮培養(yǎng)物接種至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，20? 25 培養(yǎng)5

3、? 7天，使大量的孢子成熟。加入3-5ml 含 0.05% （ ml/ml ）聚山梨酯80 的 0.9%無菌氯化鈉溶液或 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，將孢子洗脫。然后，采用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%（ ml/ml ） 聚山梨酯80 的 0.9%無菌氯化鈉溶液或pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液依次稀釋至，制成每1ml 含孢子數(shù)小于100cfu 的孢子懸液。2.4. 上述菌懸液制備后若在室溫下放置，應在2 小時之內(nèi)使用；若保存在28 ，可在 24 小時內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在28 ，在驗證過的貯存有效期內(nèi)使用。3 .計數(shù)方法的驗證3.1. 需氧菌、霉菌及酵

4、母菌計數(shù)（平皿法）所加菌液的體積不得超過供試液體積的1%。為確認供試品中的微生物能被充分檢出，首先應選擇最低稀釋級的供試液進行計數(shù)方法適用性檢查。3.1.1. 試驗組取上述制備好的供試液，加入試驗菌液、混勻，使每1ml 供試液或每張濾膜過濾的供試液中含菌量不大于100cfu 。取的供試液9.9ml 和小于 10000cfu 的銅綠假單胞菌菌懸液0.1ml 混勻后，吸取1ml 注入平皿中，立即傾注胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基1520ml ,混勻，凝固，于3035 c倒置培養(yǎng)3天點計菌落數(shù)。平行制備2 個平皿。取的供試液9.9ml 和小于 10000cfu 的金黃色葡萄球菌菌懸液0.1ml 混勻后，吸取1

5、ml 注入平皿中，立即傾注胰酉&大豆陳瓊脂培養(yǎng)基1520ml ,混勻，凝固，于3035 c倒置培養(yǎng)3 天點計菌落數(shù)。平行制備2 個平皿。取的供試液9.9ml 和小于 10000cfu 的枯草芽孢桿菌菌懸液0.1ml 混勻后，吸取1ml 注入平皿中，立即傾注胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基1520ml ,混勻，凝固，于3035 c倒置培養(yǎng)3天點計菌落數(shù)。平行制備2 個平皿。取的供試液9.9ml 和小于 10000cfu 的白色念珠菌菌懸液0.1ml 混勻后，吸取1ml 注入平皿中，立即傾注胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基1520ml ,混勻，凝固，于3035c倒置培養(yǎng)3天點計菌落數(shù)。平行制備2 個平皿。取的供試

6、液9.9ml 和小于 10000cfu 的黑曲霉菌懸液0.1ml 混勻后， 吸取 1ml 注入平皿中，立即傾注胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基1520ml ,混勻，凝固，于3035c倒置培養(yǎng)3大點計菌落數(shù)。平行制備2 個平皿。取的供試液9.9ml 和小于 10000cfu 的白色念珠菌菌懸液0.1ml 混勻后，吸取1ml 注入平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基1520ml ,混勻，凝固，于2025c倒置培養(yǎng)5天點計菌落數(shù)。平行制備2 個平皿。取的供試液9.9ml 和小于 10000cfu 的黑曲霉菌懸液0.1ml 混勻后， 吸取 1ml 注入平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基1520ml ,混勻，凝固

7、，于2025c倒置培養(yǎng)5大點計菌落數(shù)。平行制備2 個平皿。3.1.2. 菌液組取小于100cfu 的銅綠假單胞菌菌懸液、金黃色葡萄球菌菌懸液、枯草芽孢桿菌菌懸液、白色念珠菌菌懸液、黑曲霉菌懸液各1ml,注入平皿中，立即傾注胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基約 15 20ml ,混勻，凝固，于3035 c倒置培養(yǎng)3大點計菌落數(shù)。各平行制備2個平皿。取小于100cfu 的白色念珠菌菌懸液、黑曲霉菌懸液各1ml ，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基各1520ml ,混勻，凝固，于2025 c倒置培養(yǎng)5大點計菌落數(shù)。各平行制備2個平皿。3.1.3. 供試品對照組一取的供試液1ml,注入平皿中，分別立即傾注1520 ml溫

8、度不超過45 c胰酪大豆陳瓊脂 培養(yǎng)基和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基3035 c倒置培養(yǎng)3天點計菌落數(shù)，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 2025 c倒置培養(yǎng)5大點計菌落數(shù)。各組平行制備 2 個平皿。3.1.4. 結果判斷可編輯精選文檔3.1.4.1 計算公式：稀釋劑對照組菌數(shù)的回收率 =（稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)-供試品對照組的平均菌落數(shù)）/菌液組的平均菌落數(shù)試驗組菌數(shù)的回收率=（試驗組的平均菌落數(shù)-供試品對照組的平均菌落數(shù)）/菌液組的平均菌落數(shù)3.1.4.2 判定標準：實驗組、稀釋劑對照組（如有）的菌數(shù)回收率應在 0.52之間。若各試驗菌的回收 率均符合 規(guī)定，照所用的供試液

9、制備方法及計數(shù)方法進行該供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)。3.1.5. 驗結果供試品批號、。菌種類型試驗次數(shù)菌液組實驗組供試品對照組回收率銅綠假單胞菌1平均2平均3平均金黃色葡錮球菌1平均2平均3平均枯草芽抱桿菌1平均2平均3平均白色念珠菌（需氧菌驗證）1平均2平均3平均黑曲霉（需氧菌驗證）1平均2平均3平均白色念珠菌（霉菌、酵母菌1驗證）平均2平均3平均黑曲霉（霉菌、醉母菌驗證）1平均2平均3平均結果判定:驗證人：復核人：日期：日期：4 .控制菌檢查4.1. （大腸埃希菌）的驗證4.1.1. 試驗組取的供試液ml （取相當于1g或1ml供試品的供試液），小于100cfu的大腸埃希菌菌

10、懸液1ml ,加至約100ml的胰酪大豆豚液體培養(yǎng)基，于 3035c培養(yǎng)1824小時。4.1.2. 陰性對照組取pH7.0無菌氯化鈉蛋白凍緩沖液10ml ,加至約100ml的胰酪大豆豚液體培養(yǎng)基，于3035 c培養(yǎng)1824小時。4.1.3. 陽性對照組取小于100cfu的大腸埃希菌菌懸液1ml ,加至約100ml的胰酪大豆豚液體培養(yǎng)基，于 3035 c培養(yǎng)1824小時。4.1.4. 檢查取上述培養(yǎng)物1ml ,接種至含100ml麥康凱液體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，4244 c培養(yǎng)2448小時。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂平板上3035 C培養(yǎng)1872小時。檢查結果如下：第一次試驗結果：供試品批號：

11、廳P步驟實驗組陽性對照組陰性對照組1胰酪大豆陳液體培養(yǎng)基，30 35 C培養(yǎng)18 24小時2麥康凱液體培養(yǎng)基，42 44 c培養(yǎng)24 48小時3取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，3035c培養(yǎng)1872小時若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上后菌落生長，應進行分離、純化及適宜的鑒定試驗 ，確證是否為大 腸埃希菌；若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上沒啟菌落生長， 或雖由菌落生長但鑒定結果為陰性， 判 未檢出大腸埃希菌。4分離純化、染色鏡檢、生化試驗等結果：第二次試驗結果: 供試品批號:廳P步驟實驗組陽性對照組陰性對照組1胰酪大豆陳液體培養(yǎng)基，30 35 C培養(yǎng)18 24小時2麥康凱液體培養(yǎng)基，42 44 c

12、培養(yǎng)24 48小時3取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，3035c培養(yǎng)1872小時若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上后菌落生長，應進行分離、純化及適宜的鑒定試驗 ,確證是否為大 腸埃希菌；若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上沒啟菌落生長， 或雖由菌落生長但鑒定結果為陰性， 判 未檢出大腸埃希菌。4分離純化、染色鏡檢、生化試驗等結果：第三次試驗結果: 供試品批號:廳P步驟實驗組陽性陰性對照組對照組1胰酪大豆陳液體培養(yǎng)基，30 35 C培養(yǎng)18 24小時2麥康凱液體培養(yǎng)基，42 44 c培養(yǎng)24 48小時3取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，3035c培養(yǎng)1872小時若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上后菌落生長，應進行分離、純化及適宜的鑒定試驗 ,確證是否為大 腸埃希菌；若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上沒啟菌落生長， 或雖由菌落生長但鑒定結果為陰性， 判 未檢出大腸埃希菌。4分離純化、染色鏡檢、生化試驗等結果：標準：陽性對照和試驗組應檢出大腸埃希菌，陰性對照應無菌生長。結果判定：驗證人：復核人：日期：日期：備注：采用以上供試液制備方法，分別對需氧菌、霉菌及酵母菌計數(shù)和控制菌檢查法進行方法驗證時，若結果不能達到各標