低氧預(yù)適應(yīng)對(duì)小鼠海馬組織Fas-L表達(dá)的影響

1、低氧預(yù)適應(yīng)對(duì)小鼠海馬組織Fas-L表達(dá)的影響 11-01-20 14:09:00 編輯：studa20 作者：姜樹原 高麗君 張勝 周立社 邵國(guó)【摘要】 目的:觀察重復(fù)性低氧對(duì)小鼠海馬組織內(nèi)Fas-L蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。方法:小鼠低氧0 次(H0)、1 次(H1)、4 次(H4)后取海馬組織,應(yīng)用 Western Blot 技術(shù),檢測(cè)小鼠海馬組織內(nèi)Fas-L的蛋白表達(dá)變化。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)H0、H1和H4組海馬組織內(nèi)Fas-L有表達(dá)，H4組與H0組之間沒有差異，H1組顯著升高（P0.05，與H0和H1比較）。結(jié)論:急性低氧預(yù)適應(yīng)使小鼠海馬組織Fas-L表達(dá)改變。 【關(guān)鍵詞】 低氧預(yù)適應(yīng);海馬;Fa

2、s-L Abstract Objective：To detect the effect of hypoxia preconditioning on Fas-L expression in acute repeated hypoxic mice hippocampus. Methods：Mice were divided into 3 groups randomly and were exposed to hypoxia for 4 runs (H4 group)，1 run (H1 group) and 0 run (control group),respectively. Western w

3、as used to examine the Fas-L level in mice hippocampus after exposure to hypoxia, with total protein extracted from mice hippocampus for Western blot. Results： Fas-L was found in H0, H1 and H4 group. Fas-L protein levels were found to be increased in H1 (P0.05, vs.H4 and H0). There is no difference

4、between H4 and H0. Conclusion： The change of Fas-L protein level is closely related to protection of the brain and the formation of preconditioning in hypoxic preconditioned mice. Key words Hypoxic preconditioning ; Hippocampus ;Fas-L 低氧/缺血是造成腦組織損傷的最常見的臨床因素，嚴(yán)重影響人類的健康。腦雖然對(duì)低氧/缺血極為敏感，但神經(jīng)細(xì)胞對(duì)低氧/缺血有一定的耐受性

5、。1990年Kitagawa等1發(fā)現(xiàn)腦組織存在低氧/缺血預(yù)適應(yīng)現(xiàn)象，即腦經(jīng)預(yù)先亞致死性的低氧/缺血暴露，可以增強(qiáng)腦對(duì)隨后致死性低氧/缺血的耐受力。到目前為止其具體機(jī)制尚不十分清楚，但腦保護(hù)效果卻很肯定。 呂國(guó)蔚教授上世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)小鼠經(jīng)間斷急性重復(fù)密閉低氧處理后，對(duì)低氧的耐受性隨低氧的次數(shù)的增加而遞增2。急性重復(fù)密閉低氧引起腦內(nèi)眾多物質(zhì)發(fā)生變化，其中具有腦保護(hù)作用的一些物質(zhì)發(fā)生上調(diào)，而具有腦損傷作用的物質(zhì)發(fā)生下調(diào)3。Fas-L是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要分子，有“死亡分子”之稱，但其在急性重復(fù)低氧預(yù)適應(yīng)中的作用尚無報(bào)道。本工作研究Fas-L表達(dá)在急性重復(fù)低氧小鼠海馬中的變化，探討急性重復(fù)低氧預(yù)適應(yīng)形

6、成腦保護(hù)過程中神經(jīng)細(xì)胞凋亡的情況。1 材料與方法1.1 動(dòng)物模型復(fù)制Bal b/c近交系雄性小鼠，68周齡，體重1822g，屬清潔級(jí)動(dòng)物，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。按以前報(bào)道復(fù)制模型3, 即將小鼠置于含有新鮮空氣、經(jīng)過標(biāo)定的150mL 廣口瓶?jī)?nèi),以橡皮塞密閉,記時(shí)。動(dòng)物一旦出現(xiàn)喘呼吸（低氧耐受極限標(biāo)志）,立即取出,轉(zhuǎn)移到另一相同體積、含有新鮮空氣的廣口瓶?jī)?nèi),密閉,記錄低氧耐受時(shí)間,依此類推共進(jìn)行4次低氧實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分H0、H1、H4三組，H0為正常對(duì)照組，H1為低氧1次組，H4為重復(fù)低氧4次組。隨后立即斷頭取腦，剝離海馬。1.2 Western Blot將海馬置凍存管液氮凍存,然后移入裂解液中，用超

7、聲粉碎儀勻漿，用BCA法進(jìn)行總蛋白定量，加入5上樣緩沖液，配制樣品，100加熱10min變性。從上述各組樣品中分別取75g的總蛋白上樣，用8%SDS-PAGE、4、20mA電泳，當(dāng)指示劑溴酚藍(lán)電泳到分離膠時(shí)調(diào)節(jié)電流為30mA繼續(xù)電泳3.5h；隨后立即于4、400mA條件下通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白從SDS-PAGE膠上轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素（NC）膜上，轉(zhuǎn)膜5h；將NC膜用TBS(10mmol/L Tris-Cl, pH7.5, 250mmol/L NaCl )振搖漂洗10min，10%脫脂牛奶封閉1h，再用TTBS(10mmol/L Tris-Cl, pH7.5, 250mmol/L NaCl, 0.25%

8、 Tween-20)振搖洗膜3次，每次10min；NC膜與用TTBS稀釋的Fas-L多克隆抗體（1500）或actin單克隆抗體（1400）常溫下孵育4h，用TTBS洗膜，方法同上，再與用TTBS稀釋的二抗孵育1h, TTBS洗膜，方法同上；ECL試劑11混合與膜反應(yīng)均勻，約5min。在暗室中與X光片曝光520min，再將膠片置于顯影液和定影液各2min后觀察。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果以xs 表示, 用SPSS10.0 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件ANOVA 和Tukey 對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析,以P0.05 為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。2 結(jié)果2.1 不同低氧次數(shù)對(duì)小鼠耐受時(shí)間的影響見圖1，由圖可見隨低氧次數(shù)的增加小鼠的低

9、氧耐受性增強(qiáng)。2.2 Western blot結(jié)果表明，F(xiàn)as-L在 H0、H1和H4組中均有表達(dá)，以-actin為內(nèi)參，計(jì)算各組蛋白質(zhì)的相對(duì)豐度值。H0、H1和H4組Fas-L的相對(duì)豐度分別為0.860.10、1.130.21、0.910.16（n=5）。Fas-L蛋白在低氧后增加，低氧預(yù)適應(yīng)后又向基礎(chǔ)水平回落，見圖2、圖3。3 討論 低氧/缺血可以影響神經(jīng)細(xì)胞的正常生理功能，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成神經(jīng)細(xì)胞的死亡。低氧/缺血條件下在非神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)的死亡誘導(dǎo)配體（death-inducing ligands，DILs）都涉及到細(xì)胞凋亡過程，DILs包括Fas-L (APO-1L/ CD95-L)、腫瘤壞死因子(TNF)相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL/APO-2L)以及腫瘤壞死因子-（TNF-）等4。Martin-Vill