中藥含藥血清藥理研究方法

1、中藥含藥血清藥理研究方法Pharmacological method of the drug-contained serum for Chinese Materia Medica in vitro概述中藥血清藥理研究方法：是指動(dòng)物灌胃給予中藥及制劑，經(jīng)吸收進(jìn)入機(jī)體血液循環(huán)，在一定時(shí)間內(nèi)采取血液，分離所得血清，必定含有一定量的該藥物成分，此時(shí)的血藥濃度反映了機(jī)體的真實(shí)血藥濃度，以此血清加入到體外細(xì)胞培養(yǎng)體系，觀察其藥理作用的體外實(shí)驗(yàn)方法。中藥血清藥理學(xué)研究方法的意義：1、 采取的含藥物血清與機(jī)體內(nèi)環(huán)境相一致且排除了中藥制劑的各種影響因素（如pH，滲透壓等），將其加入到體外細(xì)胞培養(yǎng)體系，觀察其藥理

2、作用，具有更好的科學(xué)性，可行性；同時(shí)，使中藥的研究易于深入到細(xì)胞分子水平，對(duì)于創(chuàng)建中藥細(xì)胞分子藥理學(xué)研究具有重要的促進(jìn)作用。2、 于灌胃給藥后不同時(shí)間采取的血清，其體外藥理實(shí)驗(yàn)的效應(yīng)及其變化，可以反映機(jī)體真實(shí)的血藥濃度及其變化，無疑開創(chuàng)了對(duì)于許多成分不明或復(fù)方中藥制劑藥動(dòng)學(xué)研究的一種新方法。3、 如采用中藥血清藥理學(xué)方法進(jìn)行中藥藥效學(xué)研究時(shí)，同時(shí)分析測(cè)定血清中藥物成分的含量，具有極強(qiáng)的針對(duì)性，可避免盲目地篩選藥物有效成分的繁重工作，使中藥藥效與中藥成分的研究更能協(xié)調(diào)一致。從1988年日本學(xué)者田代真一正式提出了“血清藥理學(xué)”這一新概念，至今已有十余年時(shí)間。其研究主要經(jīng)歷了三個(gè)階段：1、 可行性探

3、索研究2、 方法學(xué)研究3、 應(yīng)用研究階段?？尚行蕴剿餮芯?以含藥血清進(jìn)行體外的藥效學(xué)試驗(yàn)，早在上世紀(jì)五十年代國(guó)內(nèi)即有所探索，自田代真一提出“血清藥理學(xué)”的概念以后，重新引起了學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了廣泛的可行性探索研究。一.抗菌、抗病毒的實(shí)驗(yàn)研究楊奎等應(yīng)用中藥血清藥理方法進(jìn)行了中藥體外抗菌實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)黃芩、藿香正氣水、藿香正氣液的血清分別具有明顯的抑菌作用，抑制率高達(dá)70以上。該研究發(fā)現(xiàn)一些含中藥血清相對(duì)于正常血清表現(xiàn)為促進(jìn)細(xì)菌繁殖作用，表明一些中藥可以降低機(jī)體抗御外邪的能力。同時(shí)，該研究還發(fā)現(xiàn)，不論是中藥復(fù)方，還是單味中藥，均可出現(xiàn)多個(gè)抑菌高峰，表明中藥抗菌有效成分復(fù)雜，其吸收高峰

4、不相一致，可以對(duì)細(xì)菌給予多次打擊，有利于抑制其繁殖。崔曉蘭等應(yīng)用口飼桂枝湯的含藥血清進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)每日1次連續(xù)3天，末次給藥后2小時(shí)的血清有明顯抑制副流感病毒致細(xì)胞病變的作用，該研究還發(fā)現(xiàn)，桂枝湯煎劑本身并無直接抗副流感病毒作用，而口飼桂枝湯后的中藥血清則有明顯作用。因此，血清藥理研究可以防止假陰性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的出現(xiàn)。二.對(duì)單核細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)生致熱原的研究楊奎等觀察了口飼黃芩、香薷、羌活勝濕湯、九味羌活丸的含藥血清對(duì)家兔單核細(xì)胞內(nèi)生致熱原產(chǎn)生過程中單核細(xì)胞內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)合成速度及Ca2+內(nèi)流的影響。結(jié)果顯示，口飼黃芩的含藥血清能明顯抑制單核細(xì)胞內(nèi)DNA合成，抑制Ca2+內(nèi)流，并推測(cè)出黃芩解熱機(jī)理之一

5、是通過抑制單核細(xì)胞內(nèi)DNA合成，抑制Ca2+內(nèi)流而阻斷內(nèi)生致熱原的合成。含香薷血清、含羌活勝濕湯血清、含九味羌活丸血清三者對(duì)單核細(xì)胞內(nèi)DNA合成均有明顯抑制作用；對(duì)單核細(xì)胞Ca2+內(nèi)流的影響，香薷和九味羌活丸均呈量效遞增性抑制作用；時(shí)效關(guān)系表明，九味羌活丸對(duì)Ca2+內(nèi)流的抑制作用在給藥后90min達(dá)高峰，對(duì)DNA合成的抑制作用在給藥后30min和90min作用較明顯。三.抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究王力倩等采用中藥血清藥理研究方法進(jìn)行離體試驗(yàn)，觀察了含苦參、仙鶴草的血清及其煎劑對(duì)腫瘤細(xì)胞體外生長(zhǎng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)苦參、仙鶴草煎劑及含苦參血清均有明顯的抗腫瘤活性，而含仙鶴草血清則無效。初步證明苦參對(duì)腫瘤細(xì)

6、胞體外生長(zhǎng)確實(shí)有一定的細(xì)胞毒性作用，而含仙鶴草血清及其煎劑出現(xiàn)了不同實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原因，可能與中藥粗制劑因素有關(guān)，也可能受藥物在體內(nèi)代謝過程及血清等因素的影響。該研究提示，含藥血清藥理研究對(duì)中藥抗腫瘤作用的評(píng)價(jià)有一定的意義。四.對(duì)造血系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究張英華等用血清藥理方法研究了當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)造血祖細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)含當(dāng)歸補(bǔ)血湯的血清對(duì)小鼠粒系一巨系造血祖細(xì)胞（CFUGM）、紅系造血祖細(xì)胞（CFUE）的增殖有明顯的促進(jìn)作用，隨著含藥血清量的增加，CFUGM、CFUE的增殖數(shù)越高。提示當(dāng)歸補(bǔ)血湯能刺激骨髓造血祖細(xì)胞，從而有可能增強(qiáng)粒系一巨系、紅系細(xì)胞的生長(zhǎng)、成熟而達(dá)生血補(bǔ)血的作用。拆方研究表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯刺激

7、粒系、巨系造血祖細(xì)胞增殖的作用主要源于當(dāng)歸，而對(duì)紅系造血祖細(xì)胞的作用以黃芪為主。表明當(dāng)歸、黃芪對(duì)不同的造血祖細(xì)胞的作用各有側(cè)重，又互相合作，共同調(diào)節(jié)機(jī)體的造血補(bǔ)血機(jī)能。而當(dāng)歸補(bǔ)血湯煎液對(duì)CFUGM的生長(zhǎng)有抑制作用，劑量越大，抑制作用越強(qiáng)；同時(shí)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯水煎液不能刺激CFUE的增殖。這與當(dāng)歸補(bǔ)氣補(bǔ)血的作用不相符。由此可見，血清藥理體外實(shí)驗(yàn)方法克服了中藥粗提物進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的弊端，是一種更為科學(xué)有效的中藥復(fù)方體外實(shí)驗(yàn)方法。五.對(duì)呼吸系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究 董自波等以金蕎麥片為供試藥物，觀察了含藥血清對(duì)離體豚鼠回腸的松弛作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，口服臨床等劑量的金蕎麥片的含藥血清能明顯抑制組胺引起的離體豚鼠回腸的收縮

8、，表明金蕎麥片具有H1受體阻斷劑的作用，能改善氣管炎過敏的臨床癥狀，時(shí)效關(guān)系表明等效劑量的金蕎麥片給予豚鼠40分鐘出現(xiàn)效應(yīng)，80分鐘到達(dá)峰值，160分鐘效應(yīng)開始衰減，效應(yīng)至少可以維持160分鐘。量效關(guān)系表明：3倍與9倍臨床等效劑量效應(yīng)呈比例的增加。黃堅(jiān)等發(fā)現(xiàn)小青龍湯藥物血清具有顯著抗組織胺引起的離體豚鼠氣管平滑肌收縮作用，且呈良好的量效關(guān)系，與直接煎劑進(jìn)行離體藥理實(shí)驗(yàn)具有相似的藥理效應(yīng)。該實(shí)驗(yàn)提示小青龍湯中的抗組織胺的有效成分可通過胃腸道吸收，進(jìn)入血液而起作用，其有效成分的達(dá)峰時(shí)間約為2小時(shí)，表明血清藥效實(shí)驗(yàn)的可靠性及可信度在某些方面優(yōu)于通常的藥理實(shí)驗(yàn)。六.對(duì)心血管系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究張群豪等采用血

9、清藥理方法觀察到口飼血府逐瘀濃縮丸的含藥血清對(duì)實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化家兔主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（SMC）增殖有明顯抑制作用，并呈劑量依賴性。血府逐瘀湯煎劑直接加入培養(yǎng)基中也呈現(xiàn)出對(duì)SME繁殖的抑制作用，且煎劑濃縮液作用強(qiáng)于含藥血清。表明血府逐瘀濃縮丸在體內(nèi)外確均有抑制SMC增殖的作用，血府逐瘀濃縮丸確含抗SMC增殖的有效成分，并且此成分口服有效。血府逐瘀煎劑濃縮液的抑制作用比含藥血清強(qiáng)，可能與某些有效成分未能從消化道吸收或經(jīng)體內(nèi)代謝失活有關(guān)。王偉等用血清藥理研究方法觀察到血府逐瘀膠囊、精制血府膠囊、硫氮酮三組藥物的含藥血清可顯著降低缺氧缺糖心肌細(xì)胞乳酸脫氫酶（LDHL）、肌酸激酶（CK）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（G

10、OT）的釋放，且精制血府膠囊組、硫氮酮組更為顯著。提示精制血府膠囊組對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用強(qiáng)于血府逐瘀膠囊。劉強(qiáng)等觀察了清心飲對(duì)大鼠心肌細(xì)胞感染柯薩奇B3病毒的影響，發(fā)現(xiàn)清心飲的含藥血清可明顯減輕實(shí)驗(yàn)性病毒心肌炎的細(xì)胞病變，改善細(xì)胞搏動(dòng)，降低細(xì)胞上清液中的病毒滴度，減少感染心肌細(xì)胞乳酸脫氫酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的釋放，顯著抑制柯薩奇B1病毒核糖的復(fù)制。清心飲的水煎劑液體體外實(shí)驗(yàn)也有上述藥理作用，由此提示清心飲中含抗病毒、保護(hù)心肌細(xì)胞的有效成分，口服有效。針對(duì)以往附子強(qiáng)心作用的研究均采用體外實(shí)驗(yàn)或靜脈直接給藥的方法，而無口服給藥的結(jié)論。陳長(zhǎng)勛等采用中藥血清藥理方法觀察了附子對(duì)離體豚鼠左心房收縮力的

11、影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未服藥動(dòng)物血清比較，口服附子粗制劑后動(dòng)物血清有明顯增強(qiáng)心肌收縮力和加快心肌收縮速度的作用，給藥后2小時(shí)血清作用達(dá)高峰。證明附子血清與附子制劑直接給藥兩者對(duì)心肌的正性肌力作用基本相似，說明其強(qiáng)心有效成分確能經(jīng)胃腸吸收入血，且不會(huì)經(jīng)吸收立即被代謝失活。七.對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究劉國(guó)卿等采用具有典型神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞特征的PC12細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，用血清藥理方法觀察了口飼“李氏5號(hào)方”的含藥血清對(duì)神經(jīng)元的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)含藥血清作用24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)時(shí)均能劑量依賴性地促進(jìn)PC12細(xì)胞的增殖，對(duì)NaCN加缺糖致PC12細(xì)胞缺血樣損傷模型表現(xiàn)出明顯的抑制和保護(hù)作用，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)

12、系。江雪華等采用新生小鼠大腦皮層進(jìn)行體外神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，建立離體的神經(jīng)細(xì)胞谷氨酸損傷模型，運(yùn)用血清方法，進(jìn)一步觀察了含“李氏5號(hào)方”的血清對(duì)原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)細(xì)胞谷氨酸損傷的影響。結(jié)果表明“李氏5號(hào)方”水煎劑（含揮發(fā)油成分）雖能抑制原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)細(xì)胞損傷，但作用不如其含藥血清強(qiáng)，同時(shí)，含藥血清抑制神經(jīng)損傷的藥理作用呈劑量依賴性，提示“李氏5號(hào)方”可拮抗興奮性氨基酸神經(jīng)毒性。八.對(duì)肝細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究劉成海等觀察了扶正化瘀方對(duì)培養(yǎng)大鼠貯脂細(xì)胞功能的影響，結(jié)果表明，該復(fù)方血清能明顯抑制貯脂細(xì)胞增殖，且抑制程度與藥物劑量及其血清濃度有關(guān)，而且對(duì)貯肝細(xì)胞內(nèi)外膠原生成也有一定的抑制作用。季光等研究發(fā)現(xiàn)，扶正化

13、瘀方血清能顯著促進(jìn)正常及損傷肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALT、AST活性，抑制正常及損傷肝細(xì)胞的膠原生成率。劉成海等采用扶正化瘀方的血清直接添加于培養(yǎng)的肝纖維化病理形成的重要細(xì)胞大鼠肝細(xì)胞及星狀細(xì)胞。結(jié)果表明：含藥血清能抑制星狀細(xì)胞增殖、促進(jìn)肝細(xì)胞增殖。提示扶正化瘀方有利于損傷肝細(xì)胞的修復(fù)、有助于抑制舌狀細(xì)胞活化及其細(xì)胞基質(zhì)生成，顯示該方的抗纖維化作用機(jī)理之一。王曉玲等采用血清藥理方法進(jìn)一步研究了扶正化瘀方抗肝纖維的配伍作用，結(jié)果表明，扶正化瘀方及其拆方含藥血清均可抑制星狀細(xì)胞的活化、增殖，抑制其膠原、TGF1的基因表達(dá)與蛋白生成。其中化瘀組抑制增殖和活化的作用最為突出，扶正組抑制膠原的作用最顯著，蟲

14、草菌絲的抑制TGF1作用最強(qiáng)。證實(shí)了“藥有個(gè)性之特長(zhǎng)，方有合群妙用”。九.對(duì)免疫功能調(diào)節(jié)的研究曾南等23觀察了含蟲草的血清對(duì)IL2活性的影響，發(fā)現(xiàn)1.25g/kg劑量組能增強(qiáng)IL2活性，但7.5g/kg、3.5g/kg劑量組作用不明顯，相反3.5g/kg劑量組卻出現(xiàn)抑制作用，這可能與血清的稀釋度及其內(nèi)容物有關(guān)。陰赪宏等應(yīng)用血清藥理方法觀察了當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)小鼠白細(xì)胞的活化作用。時(shí)效關(guān)系研究表明，當(dāng)歸補(bǔ)血湯13.2g飲片kg體重灌胃小鼠后660min等不同時(shí)相的含藥血清對(duì)小鼠白細(xì)胞均具有活化作用，量效關(guān)系表明，當(dāng)歸補(bǔ)血湯6.6033.0g飲片kg體重分別灌胃小鼠后的含藥血清對(duì)小鼠白細(xì)胞均具有活化作用

15、。十.對(duì)泌尿系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究趙宗江等用血清藥理方法，觀察了含溫陽降濁湯藥物成分的大鼠血清對(duì)體外培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞（MsC）增殖有明顯的抑制作用，且與血清中的藥物含量成正比例關(guān)系，提示溫陽降濁湯抑制MsC增殖可能是該藥防治腎小球硬化、延緩慢性腎功能衰竭進(jìn)展的重要機(jī)理之一。由此可見，中藥血清藥理研究方法開辟了中藥研究的新思路，拓寬了研究領(lǐng)域，提高了中藥（尤其是中藥復(fù)方）體外實(shí)驗(yàn)的可信度。在一定程度上揭示了中藥和復(fù)方在胃腸內(nèi)處置過程中活性成分的轉(zhuǎn)化和改變。中藥含藥血清藥理的方法學(xué)研究盡管在上世紀(jì)九十年代中期以前，對(duì)含藥血清的藥理作用及其價(jià)值作了探討，但對(duì)其實(shí)驗(yàn)方法的各個(gè)環(huán)節(jié)尚缺乏系統(tǒng)地研究；九十年中

16、期以來，國(guó)內(nèi)對(duì)中藥含藥血清藥理進(jìn)行了較系統(tǒng)的方法學(xué)研究，包括：1、建立中藥含藥血清體外藥理實(shí)驗(yàn)方法意義的論證。2、含藥血清制備技術(shù)的規(guī)范化研究。3、血清藥理方法體外反應(yīng)體系確定的規(guī)范化技術(shù)研究。為采用中藥血清藥理方法開展研究提出初步技術(shù)規(guī)范。一.建立中藥含藥血清體外藥理實(shí)驗(yàn)方法意義的論證 （一）含藥血清和原藥液體外試驗(yàn)的比較研究用原藥液和用含藥血清在體外實(shí)驗(yàn)中取得的比較研究發(fā)現(xiàn)，有的結(jié)果一致，有的結(jié)果不一致。如桂枝湯原藥液及含桂枝湯血清均有明顯抑制HSV-1病毒增殖作用；血府逐瘀濃縮丸原藥液及其兔含藥血清對(duì)家兔主動(dòng)脈SMC的DNA合成均有明顯抑制作用。用原藥液和用含藥血清在體外實(shí)驗(yàn)中亦可見不相

17、一致結(jié)果，如當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)小鼠肝過氧化脂質(zhì)的生成具有明顯的抑制作用，而當(dāng)歸補(bǔ)血湯水煎液對(duì)小鼠肝過氧化脂質(zhì)生成則呈現(xiàn)明顯的促進(jìn)作用；當(dāng)歸補(bǔ)血湯原藥液體外對(duì)小鼠NK細(xì)胞無激活作用，含藥血清及整體實(shí)驗(yàn)均有激活作用；桂枝湯原藥液在體外無直接抑制副流感病毒致細(xì)胞病變的作用，而給藥后2小時(shí)采集的含桂枝湯家兔血清則有明顯抑制作用。 用原藥液和用含藥血清所得結(jié)果的不一致，究竟何種結(jié)果更接近整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)際，這需要積累更多的對(duì)比性實(shí)驗(yàn)結(jié)果予以澄清。但從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，用含藥血清所得的結(jié)果似更符合中醫(yī)傳統(tǒng)的認(rèn)識(shí)和臨床或整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。 （二）含藥血清和整體給藥藥效相關(guān)性研究 含藥血清的體外藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果與

18、該中藥給予動(dòng)物所得得整體藥效反應(yīng)是否具有相關(guān)性，是評(píng)價(jià)含藥血清體外實(shí)驗(yàn)技術(shù)現(xiàn)實(shí)應(yīng)用性的關(guān)鍵。研究結(jié)果提示：（1）在相應(yīng)藥效指標(biāo)上，用含藥血清所得的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果與該藥口飼后所得的結(jié)果具有相似性。（2）用含藥血清體外實(shí)驗(yàn)與整體口飼給藥，對(duì)特定藥理指標(biāo)進(jìn)行量效和時(shí)效的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)二者在藥效動(dòng)力學(xué)上有良好的相關(guān)性。（3）用含藥血清給予模型動(dòng)物可以呈現(xiàn)該藥口飼模型動(dòng)物的相同藥效。 （三）含藥血清藥效和臨床療效相關(guān)性研究 用血府逐瘀丸含藥血清進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)和用血府逐瘀丸進(jìn)行臨床治療前后相關(guān)指標(biāo)觀察，二者在抑制血小板粘附聚集性及增加紅細(xì)胞變形性方面的作用基本一致，也即用含藥血清進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)所反映的結(jié)果基本和臨床

19、療效相吻合。 二.含藥血清制備技術(shù)的規(guī)范化研究 （一）采血時(shí)間的確定 藥物灌胃給動(dòng)物后，血藥濃度呈現(xiàn)由低到高、由高到低的時(shí)量過程，何時(shí)采血，是含藥血清制備技術(shù)中至關(guān)重要的一步，直接影響藥效的呈現(xiàn)。采血時(shí)間過早過晚，不僅不能很好的反映藥效，而且也與方便實(shí)驗(yàn)操作有關(guān)。因此，通過實(shí)驗(yàn)摸索出一個(gè)較為準(zhǔn)確而易行的采血時(shí)間是含藥血清制備技術(shù)中的重要一環(huán)。經(jīng)典方法建議，方劑給藥后可設(shè)定4-5個(gè)時(shí)間點(diǎn)采血，觀察藥效的時(shí)效過程，選擇藥效峰值時(shí)作為以后實(shí)驗(yàn)的采血時(shí)間。另一方面，許多研究顯示，雖然不同方劑藥效具有各自不同的時(shí)效過程，但藥效峰值一般在給藥后0.5-4h之間；各實(shí)驗(yàn)中，給藥后1-2小時(shí)采集的含藥血清均反

20、應(yīng)出藥效。也可以連續(xù)5個(gè)半衰期給藥達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度后采血。 （二）口飼給藥劑量的確定實(shí)驗(yàn)顯示，以相當(dāng)于臨床等效劑量的0.8-10倍口飼給動(dòng)物0.5-2小時(shí)所采集的含藥血清，在體外進(jìn)行相應(yīng)實(shí)驗(yàn)，能呈現(xiàn)藥理作用。或者遵照新藥藥效學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物給藥劑量計(jì)算方法確定給藥劑量。含藥血清的劑量表述也是一個(gè)值得探討的問題，這里涉及血清供體動(dòng)物的口飼給藥量以及體外試驗(yàn)時(shí)的含藥血清稀釋后終濃度量。為了更確切的表示劑量，在敘述結(jié)果時(shí)，應(yīng)說明供體動(dòng)物的口飼給藥劑量以及體外試驗(yàn)時(shí)含藥血清的終濃度或稀釋倍數(shù)，并以g生藥/kg體重/U表示劑量（如以含桂枝湯的大鼠血清對(duì)HSV-1病毒的作用實(shí)驗(yàn)為例：動(dòng)物口飼給藥量為10g生藥/

21、kg體重，實(shí)驗(yàn)時(shí)所用含藥血清的終濃度為1:12稀釋，則含藥血清的劑量為10/12=0.83g生藥/kg體重/U，這里U表示是血清在體外系統(tǒng)中終濃度時(shí)的稀釋倍數(shù)。 （三）給藥次數(shù)、給藥天數(shù)對(duì)藥效的影響 重復(fù)給藥是臨床常用的治療方法，給藥次數(shù)、給藥天數(shù)與含藥血清的藥效有關(guān)。確定一個(gè)有效而又簡(jiǎn)單易行的給藥方案，有利于血清藥理學(xué)的推廣和應(yīng)用。研究顯示，同一劑量一次給藥優(yōu)于分次給藥，同一劑量多次給藥優(yōu)于單次給藥，多日給藥優(yōu)于一日給藥。分析比較多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，參照中醫(yī)臨床用藥習(xí)慣，現(xiàn)代藥理學(xué)中關(guān)于血藥濃度和現(xiàn)有藥動(dòng)學(xué)中半衰期數(shù)值的實(shí)際，為了方便多次給藥后含藥血清的采集，可每日給藥二次，連續(xù)二天，第三天上午給

22、藥后1-2小時(shí)采血，以便獲得藥效作用強(qiáng)的含藥血清。 （四）采血部位對(duì)含藥血清藥效的影響選擇適當(dāng)?shù)牟裳课皇菫榱俗畲笙薅?、最方便地獲得含藥血清，從一些對(duì)比實(shí)驗(yàn)看，分別從動(dòng)脈、靜脈采血對(duì)藥效似無明顯影響。如果藥效物質(zhì)利用、代謝速度快的從動(dòng)靜脈中采集的血清，在藥效上可能會(huì)有所差異，由此，能否給我們對(duì)藥物作用維持時(shí)間的認(rèn)識(shí)有所啟示。另外，從門靜脈和肝靜脈分別采集含藥血清，比較他們的活性，能否也可給我們就肝臟對(duì)該藥物代謝的影響有所啟？這些是含藥血清應(yīng)用研究上應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行的工作。（五）動(dòng)物種屬的差異性通過對(duì)大鼠、小鼠、兔、犬、豚鼠及正常人血清及含藥血清對(duì)不同反應(yīng)體系作用的結(jié)果顯示，不同種屬動(dòng)物血清在不同實(shí)

23、驗(yàn)體系尋求合適的血清添加量（指含藥血清在反應(yīng)體系中的終濃度）對(duì)正確判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果是不可忽視的因素之一，應(yīng)在預(yù)實(shí)驗(yàn)中予于探討。一般來說，提供含藥血清的動(dòng)物種屬與提供反應(yīng)體系的動(dòng)物種屬越接近，血清的添加量越大。（六）供血的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)采集含藥血清所需動(dòng)物數(shù)應(yīng)遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的一般原則，如大鼠、小鼠或豚鼠每組動(dòng)物數(shù)應(yīng)不少于10只，家兔應(yīng)不少于8只，以避免動(dòng)物個(gè)體差異所致不均勻性。可以一個(gè)動(dòng)物一份血清，做個(gè)體含藥血清藥效測(cè)定，亦可將同組個(gè)體血清混合后作為一個(gè)樣本使用。（七）含藥血清的保存含藥血清經(jīng)低溫保存后是否對(duì)藥效產(chǎn)生影響與所觀察的藥效指標(biāo)和藥物本身有效成分的穩(wěn)定性有關(guān)。如抗病毒實(shí)驗(yàn)，血清可在4保存5天或-

24、20保存二月，藥效不受影響；在一些生化反應(yīng)體系中，含藥血清-20保存二月后，有的對(duì)藥效無明顯影響，有的對(duì)藥效能產(chǎn)生明顯影響，因此以采用新鮮血清為好。含藥血清藥理方法體外反應(yīng)體系確定的規(guī)范化技術(shù) （一）嚴(yán)格執(zhí)行正常血清對(duì)照 含藥血清中除藥物的成分、藥物的代謝產(chǎn)物和藥物引起的反應(yīng)產(chǎn)物外，還有血清中固有的生物活性成分和其他的干擾因素，能對(duì)體外系統(tǒng)起作用。為排除干擾，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)時(shí)設(shè)正常血清對(duì)照組。正常血清可在給藥前采集或另設(shè)一組動(dòng)物采集，含藥血清的作用強(qiáng)度，應(yīng)與正常血清比較而確定。（二）反應(yīng)體系中含藥血清添加量（即反應(yīng)體系中含藥血清的終濃度） 含藥血清在體外實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，一般常和反應(yīng)液或培養(yǎng)液共同培育。由

25、于種系不同，正常血清對(duì)反應(yīng)對(duì)象（細(xì)胞、酶等）會(huì)產(chǎn)生程度不同的影響，就需要有合適的血清添加量。一般而言，在一定范圍內(nèi)含藥血清的添加量與藥效物質(zhì)的含量成正比。與藥效強(qiáng)度成正比。但達(dá)到足夠添加量后，繼續(xù)增加含藥血清用量，或引起藥效強(qiáng)度的降低或引起反應(yīng)系統(tǒng)損傷。從現(xiàn)有研究結(jié)果可見，反應(yīng)體系中含藥血清終濃度一般在20%或以下較宜。增加口飼給藥劑量后，含藥血清的添加量應(yīng)相應(yīng)減少。 （三）血清凍干技術(shù)的應(yīng)用為了增加血清的添加量以更好的反映藥效，可將含藥血清制成凍干粉，使用時(shí)以維持液溶化。含藥血清制成凍干粉后可顯著增加反應(yīng)體系中血清添加量。 （四）含藥血清的滅活 正常血清中含有大量生物活性物質(zhì)，它們?cè)诤幯?/p>

26、的反應(yīng)體系是否產(chǎn)生干擾，血清經(jīng)56 30min滅活后是否可排除這些干擾，而且在排除干擾的同時(shí)對(duì)藥效有否影響，值得關(guān)注。研究結(jié)果提示，血清滅活后對(duì)藥效的影響與選擇的反應(yīng)體系及正常血清是否含有相關(guān)的活性物質(zhì)有關(guān)。在目前一些生化反應(yīng)體系中，血清對(duì)藥效似未產(chǎn)生顯著影響。在細(xì)胞培養(yǎng)的抗病毒實(shí)驗(yàn)中，由于正常血清中含有補(bǔ)體等生物活性物質(zhì)，可以較強(qiáng)干擾細(xì)胞和病毒的生長(zhǎng)和繁殖，滅活后使這些作用下降約50%；含藥血清中既有上述的生物活性物質(zhì)又有藥物的有效成分，滅活后排除了正常血清中的生物活性物質(zhì)，雖然使藥物作用強(qiáng)度下降，但可體現(xiàn)藥物本身作用，因此，在體外進(jìn)行抗病毒實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)采用滅活血清。 （五）預(yù)處理方法對(duì)血清活性

27、的影響有些體外實(shí)驗(yàn)和分析研究中需要去除血清中的蛋白，但血液中的藥物成分一部分是與血漿蛋白結(jié)合而存在，去蛋白的不同預(yù)處理后對(duì)藥效產(chǎn)生何種影響值得關(guān)注。以抗Ach收縮支氣管平滑肌為例，可見正常血清經(jīng)乙醇、丙酮、甲殼素處理去蛋白后，顯著降低其作用，而56 30分鐘使蛋白變性則無明顯影響。也有研究發(fā)現(xiàn)，含小青龍湯血清經(jīng)丙酮處理后對(duì)支氣管平滑肌抗His和Ach的抑制無明顯影響。血清去蛋白后，對(duì)特定的生理生化、效能指標(biāo)產(chǎn)生不同的影響，其重要因素是這些生物活性物質(zhì)和藥效物質(zhì)同血清蛋白的結(jié)合能力。我們似乎有可能用含藥血清去蛋白前后藥效的變化，來估算有效成分不單一、不清楚的中藥復(fù)方藥效成分的蛋白結(jié)合率。 含藥血

28、清藥理的應(yīng)用研究 一.含藥血清藥物動(dòng)力學(xué)研究 已有的實(shí)驗(yàn)工作表明，中藥復(fù)方含有多種有效成分，用通常的檢測(cè)某一種成分的血藥濃度經(jīng)時(shí)變化，不能代表全方的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，多個(gè)成分之間還會(huì)發(fā)生相互影響。用含藥血清研究他們對(duì)藥效的經(jīng)時(shí)變化，有可能對(duì)我們了解中藥復(fù)方作用的動(dòng)力學(xué)過程，指導(dǎo)臨床給藥方案，了解中藥復(fù)方的作用特點(diǎn)有所裨益。通過當(dāng)歸補(bǔ)血湯和大川芎丸含藥血清對(duì)不同藥效的動(dòng)力學(xué)研究過程可發(fā)現(xiàn)，同一復(fù)方不同藥效間的效應(yīng)消除半衰期數(shù)值比較接近，效應(yīng)達(dá)峰時(shí)間彼此間有相當(dāng)差異。已知消除半衰期是動(dòng)力學(xué)參數(shù)中重要的數(shù)值，對(duì)制定給藥方案有很大影響，是否有可能通過對(duì)該方某一藥效的效應(yīng)半衰期的估測(cè)，大體可作為確定給藥方

29、案的參考；達(dá)峰時(shí)間的差異，如與血清藥物化學(xué)相結(jié)合，能否作為研究確定不同藥效活性成分的參考，也是以后值得研究的內(nèi)容。此外，目前在中藥復(fù)方藥物動(dòng)力學(xué)研究中，還常采用以整體動(dòng)物藥理效應(yīng)為測(cè)試指標(biāo)的藥理效應(yīng)法和以整體動(dòng)物毒理效應(yīng)為測(cè)試指標(biāo)的藥物累積法。但以中藥血清藥理方法研究中藥復(fù)方藥物動(dòng)力學(xué)有以下特點(diǎn)：1.由于采用體外實(shí)驗(yàn)方法，可以進(jìn)行大量的藥理效應(yīng)試驗(yàn)觀察，較整體動(dòng)物易于控制。2.同一批試驗(yàn)，分離出的含藥血清可以進(jìn)行多項(xiàng)藥理效應(yīng)試驗(yàn)指標(biāo)觀察，求出多個(gè)藥理效應(yīng)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。3.如同步檢測(cè)含藥血清中的某一成分的血藥濃度，可以分析它與哪一項(xiàng)藥理效應(yīng)指標(biāo)有關(guān)聯(lián)。需要注意的是，在時(shí)間效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中所用劑量過小或過大，可能會(huì)干擾藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的測(cè)定，加之藥理效應(yīng)法較血藥濃度法測(cè)定誤差大，建議采用35種有效劑量(其中一種相當(dāng)于臨床等效劑量)平行地進(jìn)行時(shí)效測(cè)定與比較。二.中藥血清藥化學(xué)研究 “中藥血清藥化學(xué)”和“中藥血清藥理學(xué)”是80年代末由日本學(xué)者田代真一同時(shí)提出的，但發(fā)展速度較后者緩慢。除可見沿用傳統(tǒng)經(jīng)典的血藥濃度測(cè)定外，尚無獨(dú)具特征的研究新方法和思路。有人提出以構(gòu)建血清指紋圖方法來開展研究， 但相關(guān)具體研究報(bào)道較少。由于含藥血清中的化學(xué)成分與含藥血清的藥理效應(yīng)密切相關(guān)，因而中藥血清藥化學(xué)與中藥血清藥理協(xié)同研究，可能有助于研究的開展和深入。采用建立血清指紋圖方法開展中藥血清藥化學(xué)研究，