Fish在乳腺癌種的應(yīng)用課件資料

1、【概念及原理】熒光原位雜交技術(shù)是一門新興的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，其原理是采用熒光標(biāo)記的DNA探針，利用探針與被檢測樣本中 DNA堿基對的互補(bǔ)性，在探針與本¥本的 DN株交后，通過熒光顯微鏡檢測 熒光信號而得出結(jié)果，從而檢測細(xì)胞、組織樣本中的染色體或基因異常?！驹韴D】【技術(shù)特點(diǎn)】1 .操作簡單、檢測快速、結(jié)果易于觀察2 .重復(fù)性好、空間定位精準(zhǔn)3 .靈敏度和特異性高乳腺癌Her-2基因檢測相關(guān)資料介紹預(yù)覽HER-2基因擴(kuò)增檢測試劑盒1. 乳腺癌的流行病學(xué)：乳癌是女性常見的惡性腫瘤之一，歐美為高發(fā)地區(qū)，流調(diào)學(xué)顯示歐美的發(fā)病率在6080/10萬左右，位列女性惡性腫瘤發(fā)生的第一位，且發(fā)病率在

2、逐年上升。而乳癌的死亡率大約占女性惡性腫瘤死亡的15 %左右,僅次于月制S ( 25%)。我國的乳癌發(fā)病率在20/10萬左右，在女性惡性腫瘤中位列第三位，而且發(fā)病率也成逐年上升的趨勢。在一些大城市如上海，1999年的調(diào)查顯示，乳癌的發(fā)病率已經(jīng)達(dá)到 52.9/10萬。因此, 乳癌是威脅女性健康的重要惡性疾病12。2. Her-2與乳腺癌：在最近的20年中，乳癌的治療療效發(fā)生了根本性的變化。一些研究顯示，盡管乳癌的發(fā)生率仍在上升，但在一些地區(qū)已經(jīng)可以觀察到乳癌患者的死亡率在逐年下降3。這與新的治療理念如劑量強(qiáng)度和劑量密度以及新的治療藥物如紫杉在臨床上的應(yīng)用是密切相關(guān)的。這都使得患者的遠(yuǎn)期生存較以前

3、得到了明顯的改善4。不僅如此，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們認(rèn)識到一些信號傳導(dǎo)通路在乳癌的發(fā)生發(fā)展以及對治療療效的影響中也起著重要的作用。這其中最主要的就是EGFR家族。EGFR是表達(dá)在上皮來源組織細(xì)胞表面的一種受體，家族中共有 4位成員，分別位HeU、Her2、Her3和Her4 ,屬于酪氨酸激酶受體家族?；A(chǔ)研究顯示，這些受體通過同源二聚或異源二聚的方式發(fā)生偶聯(lián)，使受體胞內(nèi)部分的酪氨酸激酶激活，導(dǎo)致下游的蛋白發(fā)生磷酸化，從而發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞增殖以及血管生成等作用。而在部分乳癌患者中，上述蛋白表達(dá) 是明顯增加。其結(jié)果就使得該信號傳導(dǎo)通路被明顯激活，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。3. 檢測 HER-2 的臨

4、床意義：3.1 HER-2 擴(kuò)增的患者預(yù)后更差：Her2 基因的過表達(dá)除了與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)外，還是一個重要的臨床預(yù)后指標(biāo)5。 有研究顯示，具有 Her2基因過表達(dá)的患者OS 和 DFS 較短，而且這部分患者就診時的腫瘤負(fù)荷更大，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的幾率更高，激素受體陰性的比例更高，組織學(xué)分級更差，腫瘤的增殖指數(shù)更高，復(fù)發(fā)風(fēng)險更高6。3.2 正確判斷Her-2 狀態(tài)可以輔助臨床選擇更適合病人的內(nèi)分泌治療藥物，以及選擇療效最佳的輔助化療藥物，做到合理用藥：研究顯示，相對于無Her-2 基因擴(kuò)增的乳癌患者而言，具有Her-2 基因擴(kuò)增的患者應(yīng)用受他莫昔芬（TAM）治療后的死亡風(fēng)險明顯增高。提示具有Her

5、-2 基因擴(kuò)增的患者可能不適合應(yīng)用TAM 作為內(nèi)分泌治療的選擇10。對 ER 陽性的絕經(jīng)后患者, HER-2 陽性者,來曲唑的療效明顯高于TAM 。來曲唑?qū)ER-2 陽性患者的療效優(yōu)于陰性患者; TAM 則相反,對HER-2 陰性患者的療效明顯高于陽性患者10。HER-2 /neu 擴(kuò)增的乳腺癌患者對CMF 化療方案的反應(yīng)性降低；對 HER-2/neu 擴(kuò)增的患者,宜采用高劑量強(qiáng)度的蒽環(huán)類藥物方案；HER-2 陽性的乳腺癌患者對紫杉醇化療的反應(yīng)性明顯高出HER-2 陰性的患者7。3.3 Her-2 擴(kuò)增的患者能明顯受益于靶向治療藥物Hercepetin ：20XX年美國FDA批準(zhǔn)了一種全新的

6、藥物Herceptin 。到目前為止，已經(jīng)有多篇關(guān)于該藥物臨床應(yīng)用的W期隨機(jī)對照研究。結(jié)果表明，無論是與常規(guī)化療聯(lián)合用于乳癌患者的輔助治療，還是用于輔助治療后的維持治療，以及用于晚期乳癌患者的單藥或聯(lián)合治療，都能肯定的改善Her-2 過表達(dá)患者的生存，使乳癌患者在上述常規(guī)治療進(jìn)步的基礎(chǔ)上進(jìn)一步獲益89。 在該藥物的臨床應(yīng)用過程中，對 Her-2 基因的檢測是至關(guān)重要的。因?yàn)樵撍幬飳δ切┚哂谢驍U(kuò)增的患者具有良好的治療效果，而對于低度擴(kuò)增或者是不擴(kuò)增的患者療效不理想。3.4 FISH 技術(shù)檢測Her-2 狀態(tài)結(jié)果客觀準(zhǔn)確，為檢測Her-2 狀態(tài)的金標(biāo)準(zhǔn)：17 號染色體非整體性即每個細(xì)胞中17 號

7、染色體數(shù)多于（多體性）或少于（單體性或亞二性）2 個，是乳腺癌的遺傳學(xué)特征之一。而這種非整體形會造成一部分的病人免疫組化檢測（IHC ）的假陽性結(jié)果，這樣的病人在使用 Herceptin 時效果并不理想。FISH 檢測技術(shù)加入了17 號染色體著絲粒探針作為對照探針，因此能明確檢測出患者腫瘤細(xì)胞的倍體性，避免了Her-2 擴(kuò)增是由于17 號染色體非整體性造成的假陽性結(jié)果11。4. 結(jié)語：綜上所述，Her2 在乳癌患者的診療過程中起著重要的作用，它不僅可以用于估計患者的遠(yuǎn)期預(yù)后，還可以指導(dǎo)乳癌治療的藥物選擇。因此，目前對于就診的乳癌患者都常規(guī)行Her2 基因或其表達(dá)蛋白的檢測。國外的資料顯示，在乳

8、癌患者中，大約有2530%的患者會有Her2蛋白的高表達(dá)，而這其中9095%的蛋白高表達(dá)是由于Her2/neu 基因的擴(kuò)增引起的。因此， 臨床上無論是檢測腫瘤細(xì)胞表面的蛋白表達(dá)，還是檢測細(xì)胞內(nèi)基因的擴(kuò)增，理論上都是可以指導(dǎo)臨床的。TOP2A基因擴(kuò)增檢測試劑盒（熒光原位雜交法）疾病 名稱檢測探針標(biāo)記顏色探針定位探針名稱乳腺癌GLP TOP2A/CSP 17紅/綠TOP2A : 17q21.1CSP17 : 17p11.1-q11.1TOP2A基因擴(kuò)增檢測試劑盒（熒光原位 雜交法）|愉床意義，腺癌是婦女中常見的惡性腫瘤之一，在西方國家其發(fā)病率和病死率居腫瘤之首。近年來，在我國發(fā)病率也呈直線上升的趨

9、勢。研究表明，對于her-2擴(kuò)增陽性的乳腺癌患者，使用赫賽汀后會得到更好的預(yù)后效果，并且，使用大劑量慈環(huán)類藥物的治療效果要優(yōu)常規(guī)劑量的治療效果。由于TOP2A基因也定位與17q染色體，并且與Her-2基因相隔很近，而且，TOP2A基因所編碼的蛋白拓?fù)洚悩?gòu)酶II是慈環(huán)類抗生素的靶酶，因此有推斷稱使用TOP2A基因狀態(tài)來預(yù)測患者對含意環(huán)類藥物治療方案，更為準(zhǔn)確2。在對晚期乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，Topo 口 a的基因表達(dá)和腫瘤細(xì)胞對拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑的敏感性明顯相關(guān)10 TOP2A基因異常的病人可以明顯受益于含有拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑的輔助化療方案。TOP2A擴(kuò)增的病人使用CEF方案進(jìn)行治療可以降低 61%的

10、復(fù)發(fā)風(fēng)險和51%的死亡風(fēng)險，而沒有 TOP2A擴(kuò)增的患者使用 CEF方案只能降低6%的復(fù)發(fā)風(fēng)險和10%的死亡風(fēng)險11。而且，且TOP2A基因異常的病人預(yù)示著更短的無復(fù)發(fā)生存期（ recurrence-free survival , RFS ）但總生存期并無改變，TOP2A缺失的病人預(yù)后更差11。因此，檢測乳腺癌患者腫瘤組織中TOP2A基因狀況可以：2對患者預(yù)后風(fēng)險進(jìn)行判斷。TOP2A基因異常的病人預(yù)示著更短的無復(fù)發(fā)生存期（ recurrence-free survival , RFS ） , TOP2A缺失的病人預(yù)后更差11。2指導(dǎo)臨床使用含意環(huán)類的輔助化療藥物，存在 TOP2A基因異常（缺失

11、或擴(kuò)增）的患者，使用慈環(huán)類治療方案效果要好于使用非意L類治療方案4）轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性腫瘤（IV 期）。3. 乳腺癌的治療：概括地說，乳腺癌的治療手段包括對局部病灶進(jìn)行手術(shù)治療、 放射治療，或兩者聯(lián)合，以及對全身性疾病進(jìn)行細(xì)胞毒化療、內(nèi)分泌治療、生物治療或以上手段的聯(lián)合應(yīng)用。對各種全身和局部治療手段的需求和選擇要依據(jù)多種預(yù)后和預(yù)測因素來判斷。這些因素包括腫瘤組織學(xué)特征、原發(fā)腫瘤的臨床和病理學(xué)特征、腋窩淋巴結(jié)狀況、腫瘤激素受體水平和HER-2 狀態(tài)、有無可檢測到的轉(zhuǎn)移病灶、合并癥情況、患者的年齡以及絕經(jīng)狀態(tài)。研究表明，對于her-2 擴(kuò)增陽性的乳腺癌患者，使用赫賽汀后會得到更好的預(yù)后效果，并且，使用

12、大劑量蒽環(huán)類藥物的治療效果要優(yōu)于常規(guī)劑量的治療效果。由于TOP2A基因也定位與17q染色體，并且與 Her-2基因相隔很近，而且，拓?fù)洚悩?gòu)酶II是慈環(huán)類抗生素的靶酶，因此有推斷稱使用TOP2A 基因狀態(tài)來預(yù)測患者對含蒽環(huán)類藥物治療方案，更為準(zhǔn)確2。4. DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II的結(jié)構(gòu)、分布及功能在生物體的整個生命過程中，細(xì)胞遺傳物質(zhì)DNA 起著十分重要的作用。但是，DNA 的超長度和雙螺旋性質(zhì)使其在復(fù)制和重組期間經(jīng)常纏繞，阻礙DNA 的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和重組等。DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶（DNAtopoisomerase） 是生物體內(nèi)廣泛存在的一類重要的核酶，是核基質(zhì)成分之一，在核內(nèi)發(fā)揮作用。它可催化單鏈或雙鏈

13、DNA 斷開和結(jié)合的偶聯(lián)反應(yīng)，從而改變DNA 的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶的生物學(xué)作用可以兩種方式體現(xiàn)：一是調(diào)節(jié)控制DNA 的超螺旋狀態(tài)及打結(jié)或解結(jié)DNA 的環(huán)連體狀態(tài)，從而間接地影響細(xì)胞內(nèi)核酸代謝過程。二是直接參與那些需打斷并重新連接DNA 分子鏈的細(xì)胞過程，DNA 的重組、修復(fù)、轉(zhuǎn)錄及復(fù)制過程。此外拓?fù)涿高€參與轉(zhuǎn)導(dǎo)、姊妹染色體互換、分離等生物過程3、 4。DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶不僅對細(xì)胞的正常生命活動至關(guān)重要，而且在腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及療效等方面均扮演重要角色。腫瘤細(xì)胞內(nèi)Topo II a的過表達(dá)與化學(xué)藥物的選擇也密切相關(guān)，因此為了提高化學(xué)治療效果，人們對它的研究十分重視 TOP2A 與 He

14、r-2/neu 基因的相關(guān)性TOP2A 和 Her-2/neu 原癌基因在染色體上的位置非常鄰近，均定位于17q11.2-22 區(qū)域。研究證實(shí)，在乳腺癌中 TOP2A 和 Her-2/neu 這兩種基因的擴(kuò)增或缺失有一定的相關(guān)性。Her-2/neu 是人類腫瘤中發(fā)生改變。根據(jù) DNA 鏈斷裂反應(yīng)過程中產(chǎn)生斷口性質(zhì)的不同，DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶可分為兩類：I 類 DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶（TopoI）引起DNA糖磷酸骨架上的單鏈 DNA的斷裂；而II類 DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶（Topo II）,主要引起雙鏈DNA的 斷裂。其中Topo II包含 a、0 2個亞單位4。在基因和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)方面，Topo II a

15、、0兩種同功酶基本相似。 Topo U a基因（TOP2A ）由36kb堿基對構(gòu)成，有35個外顯子；Topo U 0由49kb堿基對,含36個外顯子。Topo U a在染色體上的定位及其物 理圖譜詳見下圖：TOP2A 基預(yù)示患者對于蒽環(huán)類藥物的敏感性。Cardoso F 等，對 350 例原發(fā)性及轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者進(jìn)行因進(jìn)行檢測后，得出TOP2A 基因擴(kuò)增可以預(yù)測患者對含蒽環(huán)類藥物的敏感性7。盡管大部分her-2 擴(kuò)增的患者都存在TOP2A 基因 &一、背景介紹： 1.流行病學(xué)介紹：乳腺癌（mammary carcinoma）是人類最常見的一種惡性腫瘤，也是女性主要惡性腫瘤之一。各國因地

16、理環(huán)境、生活習(xí)慣的不同，乳腺癌的發(fā)病率有很大差異。北美和北歐大多數(shù)國家是女性乳腺癌的高發(fā)區(qū)，南美 和南歐一些國家為中等，而亞洲、拉丁美洲和非洲的大部分地區(qū)為低發(fā)區(qū)。在北美、兩歐等發(fā)達(dá)國家，女性乳腺癌的發(fā)病率居女性惡性腫瘤發(fā)病率的首位。據(jù)美國癌癥協(xié)會估計，美國每年有12萬乳腺癌新發(fā)病例,發(fā)病率為72. 2/10萬，。乳腺癌在我國各地區(qū)的發(fā)病率也不相同，在世界上我國雖屬女性乳腺癌的低發(fā) 國。但近年來乳腺癌的發(fā)病率明顯增高。尤其滬、京、津及沿海地區(qū)是我國乳腺癌的高發(fā)地區(qū)。美國癌癥協(xié)會估計，20XX年美國新診斷乳腺癌患者病例約 217440例，有近40580患者將死于該病。在美國乳腺癌是最常見的婦女惡

17、性腫瘤，在癌癥死因中僅次于肺癌，居第二位。過去幾十年里，美國乳腺癌的發(fā)生率穩(wěn)步增長，但其死亡率卻逐步下降。這得益于對乳癌的早期發(fā)現(xiàn)和更有效的治療。乳腺癌是婦女中常見的惡性腫瘤之一，在西方國家其發(fā)病率和病死率居腫瘤之首。近年來，在我國發(fā)病率 也呈直線上升的趨勢。目前浸潤性乳腺癌已被視為全身性疾病。其預(yù)后的判斷及與預(yù)后相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物備受關(guān)注。由于許多患者存在著亞臨床轉(zhuǎn)移灶，以及化療耐藥的出現(xiàn)，導(dǎo)致患者無瘤生存期縮短，所以檢測有關(guān)乳腺癌耐藥相關(guān)基因，對指導(dǎo)規(guī)范化治療尤為重要1。2.乳腺癌的臨床分級：根據(jù)治療方法，乳腺癌可分為：1）單純非浸潤性癌：包括導(dǎo)管原位癌（ DCIS）和小葉原位癌（LCIS） （0期）；2）可手術(shù)治療的局部浸潤性癌（臨床I、II期和部分IIIA期腫瘤）；3）不能手術(shù)治療的局部浸潤性癌（臨床 IIIB、IIIC期和部分IIIA期腫瘤）；頻率最高的癌基因之一。其與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，約在20 %30 %的乳腺癌組織中可以檢測到該基因的擴(kuò)增和過表達(dá)。在乳腺癌中，Her-2/neu 基因擴(kuò)增又與其鄰近位點(diǎn)上的TOP2A 基因改變呈正相關(guān)。當(dāng)Her-2/neu 基因在乳腺癌中過度表達(dá)時，通過多種途徑參與跨膜信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)及促進(jìn)細(xì)胞的增殖，這可能是TOP2A 基因擴(kuò)增的原因。研究表明，對于 her-2 擴(kuò)增陽性的乳腺癌患者，使用赫賽汀