抗糖尿病并發(fā)癥醛糖還原酶抑制劑的虛擬篩選（基于SPECS分子庫(kù)）

1、抗糖尿病并發(fā)癥醛糖復(fù)原酶抑制劑的虛擬篩選基于 SPECS 分子庫(kù)#張建羽，李哲，羅海彬*51015中山大學(xué)藥學(xué)院，廣州 510006摘要：醛糖復(fù)原酶抑制劑ARI通過(guò)抑制醛糖復(fù)原酶的活性，使得葡萄糖代謝途徑恢復(fù)良性進(jìn)而控制或治療并發(fā)癥，而成為當(dāng)今治療糖尿病并發(fā)癥的新藥研發(fā)熱點(diǎn)，并相繼有多種藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)以及上市。醛糖復(fù)原酶ALR2屬于醛-酮復(fù)原酶超家族中的一員，由于與體內(nèi)的醛復(fù)原酶ALR1有著高度的同源性，活性口袋相似，因而目前的 ARI，一方面普遍療效較低，缺乏良好的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，另一方面也會(huì)抑制體內(nèi) ALR1 的正?；钚远a(chǎn)生毒副作用。因而尋找高效、對(duì) ALR2 有高選擇性的抑制劑成為 AR

2、I 研發(fā)的關(guān)鍵。相對(duì)于傳統(tǒng)篩選模型，利用計(jì)算機(jī)藥物輔助設(shè)計(jì)技術(shù)虛擬篩選尋找活性化合物，再進(jìn)一步進(jìn)行生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，可大大縮短藥物發(fā)現(xiàn)的時(shí)程。本文采用 Accelrys Discovery Studio 中的 LigandFit 和CODCKER 對(duì)接方法對(duì)小分子 SPECS 數(shù)據(jù)庫(kù)中的 400,000 多個(gè)分子，基于 ALR2 的 3 個(gè)靶標(biāo)分子1US0、2FZD 和 2PDK的活性結(jié)合口袋進(jìn)行虛擬篩選，并采用 3H4G 代表 ALR1作為活性篩選的對(duì)照蛋白，得到了 13 個(gè)具備較好預(yù)測(cè)活性與選擇性的目標(biāo)小分子。本研究為基于靶標(biāo)結(jié)構(gòu)的藥物分子設(shè)計(jì)提供了指導(dǎo)思想。關(guān)鍵詞：計(jì)算機(jī)藥物輔助設(shè)計(jì)；糖尿病及

3、其并發(fā)癥；醛糖復(fù)原酶；虛擬篩選中圖分類號(hào)：R914.220Virtual Screening of Aldose Reductase Inhibitors forDiabetic Complications on SPECSZHANG Jianyu, LI Zhe, LUO Haibin(School of Pharmaceutical Sciences, Sun Yat-sen University, GuangZhou 510006)25303540Abstract: Aldose reductase inhibitors (ARI) can decrease the activity o

4、f aldose reductase (ALR2)and thus can be used for the treatment of diabetic complications. A variety of ARIs have beenapproved in clinical trials or in the market. ALR2 belongs to the aldo-keto reductase (AKR)superfamily of enzymes, while aldehyde reductase (ALR1), the homologous enzyme, shares ahig

5、h degree of sequence identity and similar binding-site pocket as ALR2. As a result, the existingARIs generally have side effects due to their low selectivity towards ALR1. Therefore, thescreening of new leads for ALR2 with high selectivity is the key for the development of ARI. Inthe present work, w

6、e describe a virtual screening experiment on SPECS (a database of 400, 000molecules) by using the molecular docking methods, LigandFit and CDOCKER in AccelrysDiscovery Studio 2.5.5 based on three crystal structures (1US0, 2FZD, and 2PDK), and finallyachieve a result of 13 hit molecules which exhibit

7、 strong binding affinities with ALR2theoretically and high selectivity towards ALR1.Keywords: Aldose reductase; virtual screening; CADD; Complications of diabetes0 引言近年來(lái)糖尿病的患病率呈逐漸上升的趨勢(shì)。據(jù) 2021 年的一份統(tǒng)計(jì)報(bào)告指出，我國(guó)糖尿病患者已突破了 9 000 萬(wàn)，同時(shí)其治療費(fèi)用每年達(dá) 1 734 億元人民幣約 250 億美元，糖尿病所致的直接醫(yī)療開(kāi)支已經(jīng)占到中國(guó)醫(yī)療總開(kāi)支的 13%1。糖尿病本身可以通過(guò)胰島素和降血

8、糖藥得以治療，但由于高血糖能夠引發(fā)諸如心腦血管并發(fā)癥、神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，腎病，基金工程：高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金20210171120057、廣東省自然科學(xué)基金S2021030003190作者簡(jiǎn)介：張建羽，1991-，男，學(xué)生，主要研究方向：計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)。通信聯(lián)系人：羅海彬，1977-，男，教授，主要研究方向：藥物分子設(shè)計(jì)。E-mail: -1-眼病等，大大增加了因糖尿病并發(fā)癥而導(dǎo)致死亡的概率。有研究說(shuō)明，醛糖復(fù)原酶ALR24550在糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制中起到一個(gè)關(guān)鍵的作用，其受高血糖刺激而異?；顫姴?dǎo)致多種并發(fā)癥。因此，醛糖復(fù)原酶抑制劑A

9、RI成為當(dāng)前治療糖尿病并發(fā)癥的一個(gè)重要方向；但目前市場(chǎng)上該類藥物較少，選擇性低，且都存在較大副作用，不具備良好的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，因此需要研發(fā)新的 ARI。因此，本研究旨在通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助藥物分子設(shè)計(jì)技術(shù)2，針對(duì) SEPCS小分子數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選出對(duì) ALR2 具有較高選擇性的和較高活性的 ARI，用于治療、控制或減緩糖尿病并發(fā)癥，進(jìn)而降低由糖尿病及其并發(fā)癥引起的死亡率。1 相關(guān)概念1.1藥物的虛擬篩選藥物的虛擬篩選 (Virtual screening for drug discovery)，是指基于藥物設(shè)計(jì)理論，借助計(jì)算機(jī)技術(shù)和應(yīng)用軟件，采用分子對(duì)接或藥效基團(tuán)模型方法，從大量化合物中篩選出具有較高55

10、理論結(jié)合能力的化合物，從而快速進(jìn)入藥理藥效實(shí)驗(yàn)，這樣可以明顯地縮短苗頭化合物的發(fā)現(xiàn)時(shí)間，提高藥物研發(fā)的效率；其陽(yáng)性率一般在 5%20%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的高通量篩選2。1.2糖尿病并發(fā)癥及醛糖復(fù)原酶ALR2葡萄糖代謝機(jī)制在目前的研究中，被認(rèn)為是誘發(fā)糖尿病并發(fā)癥的主要途徑3-4。在人體中葡萄糖存在一個(gè)多元醇代謝途徑如圖 1 所示：606570圖 1. 葡萄糖多元醇代謝途徑Figure 1. The polyol pathway of glucose metabolism在圖 1 所展示的多元醇代謝途徑中, 可以看到, ALR2 是一個(gè)非常關(guān)鍵的催化酶-限速酶3原酶超家族，由 316 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成

11、，是一個(gè)分子質(zhì)量為 35858 D 的多肽，其中含有 38%的螺旋結(jié)構(gòu)和 14%的桶狀結(jié)構(gòu)。通過(guò)蛋白晶體研究及與配體相互作用研究，發(fā)現(xiàn)其活性口袋位于鏈的 C-末端，是一個(gè)由芳香族氨基酸、非極性氨基酸和極性氨基酸組成的疏水口袋。其中的 48 位酪氨酸 Tyr 和 110 位組氨酸 His 參與酸堿催化作用5，并且在與底物的結(jié)合過(guò)程中起到非常重要的作用，也是競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑重要的作用位點(diǎn)。其蛋白晶體如下列圖 2所示。圖 2. 醛糖復(fù)原酶 ALR2 的晶體結(jié)構(gòu)1US0: 0.66Figure 2. The crystal structure of ALR21US0: 0.66 -2-。研究說(shuō)明：醛糖復(fù)原

12、酶 ALR2 是一種復(fù)原型輔酶NADPH-依賴型復(fù)原酶，屬于醛-酮還752 研究對(duì)象及方法2.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象有研究說(shuō)明，配體對(duì) ALR2 的活性口袋具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)效應(yīng)，存在著較多的活性口袋構(gòu)象。其中的三種蛋白晶體1US0：0.66 ；2FZD：1.08 ；2PDK：1.55 在諸多實(shí)驗(yàn)中，被證實(shí)可以用來(lái)代表 ALR2 因誘導(dǎo)效應(yīng)而產(chǎn)生變化的活性口袋構(gòu)象6，因而在實(shí)驗(yàn)中也采用80了這三種蛋白晶體作為靶標(biāo)分子的結(jié)構(gòu)。另一方面，實(shí)驗(yàn)中采用了醛復(fù)原酶ALR1蛋白晶體 3H4G1.85 作為對(duì)照蛋白。用以篩選出對(duì)醛糖復(fù)原酶ALR2具備較高選擇性的化合物7。2.2實(shí)驗(yàn)方法本實(shí)驗(yàn)中采用對(duì)照蛋白陽(yáng)性篩選法，通過(guò)設(shè)

13、立相關(guān)閾值，逐步縮小篩選范圍，最終確定85對(duì) ALR2 具備較高理論結(jié)合能力，對(duì) ALR1 有較低理論結(jié)合能力的小分子。2.2.1虛擬篩選方法確實(shí)定目前我們已有的對(duì)接篩選程序有 Accelrys Discover Studio 2.5.5 的 LigandFit 和CDOCKER, Tripos Sybyl 7.3 的 Surflex-dock, 和 MOE2021.10 的 Dock。不同的篩選方法對(duì)不同的靶蛋白有不同的系統(tǒng)適應(yīng)性，需采用 RMSDroot-mean-square deviation值來(lái)選擇合90適的篩選程序。篩選程序結(jié)果如表 1 所示。表 1 所列的數(shù)據(jù)，紅色標(biāo)記的數(shù)據(jù)多為

14、 1.0 附近，說(shuō)明此種篩選方法對(duì)相應(yīng)的蛋白晶體具備較好的篩選系統(tǒng)適應(yīng)性，可以較為準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)晶體結(jié)構(gòu)中的原有小分子配體。分析表 1 的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn) Accelrys Discover Studio 中的兩種對(duì)接方法對(duì)于本實(shí)驗(yàn)的蛋白晶體具備較好的系統(tǒng)適應(yīng)性。因而，本實(shí)驗(yàn)采用 LigandFit 和CDOCKER 進(jìn)行虛擬篩選。95表 1. 四種對(duì)接方法 surflex-dock、MOE、Ligandfit、CDOCKER 的 RMSD 值Table 1. RMSDs of the four docking methods (surflex-dock、MOE、Ligandfit、CDOCKERMet

15、hodologysurflex-dock MOE LigandFit CDOCKERAverage RSD Average RSD Average RSD Average RSD1US0 1.34 0.55 5.10 2.45 3.65 1.36 1.10 0.212FZD 2.99 1.84 3.01 1.77 1.04 0.38 0.454 0.102PDK 4.94 2.16 4.87 1.68 1.34 1.50 3.90 1.263H4G 4.84 0.3 5.26 2.00 4.64 0.05 3.80 1.612.2.2篩選閾值確實(shí)立100本實(shí)驗(yàn)采用來(lái)自 DUD 數(shù)據(jù)庫(kù)中 26

16、個(gè) ALR2 配體小分子、BindingDB 中 165 個(gè) ALR2配體小分子，7 個(gè) ALR1 晶體蛋白原配體小分子進(jìn)行相關(guān)閾值確實(shí)立。結(jié)果如表 2 所示。105110115-3-表 2. LigandFit 和 CDOCKER 的篩選閾值Table 2. The selected scores for LigandFit and CDOCKER in our virtual screening篩選閾值1US0數(shù)值2FZD 2PDK3H4G所采用的數(shù)據(jù)庫(kù)應(yīng)用的對(duì)象LigandFit結(jié)果篩選閾值Ligscore-PLP1-PLP2Dockscore2.45106.69105.22101.09

17、1.7790.5388.4186.582.6095.0093.3890.82DUD用于 ALR1&ALR2LifgandFit 對(duì)接結(jié)果的篩選CDOCKER 結(jié)果篩選閾值37.05 32.61 34.79 BindingDB用于 ALR1&ALR2CDOCKER 對(duì)接結(jié)果的篩選LigandFitLigscore2.19DUD用于判斷分子是否對(duì)陽(yáng)性篩選閾值-PLP1 86.45-PLP2 82.82Dock 82.60scoreALR1 顯示陽(yáng)性；CDOCKER 陽(yáng)性篩選閾值 35.60PDB 上的 ALR1 所包含的配體小分子用于判斷分子是否對(duì)ALR1 顯示陽(yáng)性2.2.3對(duì)照蛋白的陽(yáng)性篩選及抑

18、制劑的選擇性120人體內(nèi) ALR1 與 ALR2 同屬醛-酮復(fù)原酶超家族AKR, 兩者具有約 65%的氨基酸序列同源性7了 ALR2 的同時(shí)，也抑制了 ALR1 的正常活性，由于選擇性低而產(chǎn)生毒副作用。為了使得篩選出來(lái)的活性化合物對(duì) ALR2 具備較高選擇性，本次實(shí)驗(yàn)采用 ALR1 的蛋白晶體 3H4G 作為對(duì)照，利用小分子對(duì) 3H4G 產(chǎn)生具有預(yù)測(cè)活性的打分結(jié)果作為陽(yáng)性值，在命125中小分子中去除顯陽(yáng)性的結(jié)果，從而保證實(shí)驗(yàn)所得的小分子對(duì) ALR2 具有較高的預(yù)測(cè)選擇性。2.2.4熱點(diǎn)殘基分析根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道8，ALR2 活性口袋的重要?dú)埢饕獮?Trp20、Tyr48、His110、Trp111

19、、Phe122、CYS298 和 Leu300 等。為了進(jìn)一步確定本次實(shí)驗(yàn)中需要重點(diǎn)研究及分析的結(jié)合位130135點(diǎn)，本文從 PDB 蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中下載 116 個(gè) ALR2 晶體蛋白進(jìn)行熱點(diǎn)殘基分析。在 MOE 的 PILF 中導(dǎo)入 116 個(gè)晶體蛋白，以 1US0 氨基酸序列為基準(zhǔn)，去除序列與 1US0不同的蛋白晶體，進(jìn)一步去除無(wú)內(nèi)源性小分子的蛋白晶體；每個(gè)蛋白晶體保存 1 個(gè)內(nèi)源性小分子配體，經(jīng)此篩選共有 59 個(gè)蛋白晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行熱點(diǎn)殘基分析。經(jīng)分析得知，ALR2 的主要結(jié)合位點(diǎn)在于 Tyr48、His110 和 Trp111，同時(shí) Leu300 及 B 鏈 C 端的氨基酸殘基如 CYS2

20、98也具有重要的奉獻(xiàn)；經(jīng)文獻(xiàn)7得知，Leu300 及鏈 C 端的氨基酸殘基對(duì) ARI 的選擇性有重要奉獻(xiàn)，可以認(rèn)為是 ARI 作用于 ALR2 的特異性位點(diǎn)。3 研究過(guò)程3.1蛋白晶體預(yù)處理對(duì)從 PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載得到的蛋白晶體進(jìn)行水分子去除、多像異構(gòu)體去除和酸分子去140除8子進(jìn)行質(zhì)子化處理，使得在 -N 形成 1 氫鍵供體；除此之外，對(duì)輔酶 NADP 中所存在的煙酰胺的芳香環(huán)添加+1 電荷，以保證對(duì)接軟件最大限度模擬真實(shí)環(huán)境。-4-，且兩者的活性口袋具有非常高的相似度。對(duì)于一般的 ARI 而言，往往在抑制等三項(xiàng)預(yù)處理；進(jìn)一步對(duì)蛋白晶體活性口袋重要氨基酸殘基 His110 咪唑環(huán)上的 -氮

21、原LigandFit 及 CDOKCER 的篩選LigandFit 的虛擬對(duì)接篩選145將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的晶體蛋白導(dǎo)入 LigandFit 程序，設(shè)置打分函數(shù)為 LigScore1、PLP1、PLP2，設(shè)定每個(gè)小分子保存對(duì)接結(jié)果打分最高的構(gòu)象。運(yùn)行結(jié)果如表 3 所示。表 3. LigandFit 篩選結(jié)果Table 3. Result from the LigandFit method分子庫(kù)名字SPECS 數(shù)據(jù)庫(kù)經(jīng)閾值篩選的結(jié)果經(jīng)陽(yáng)性對(duì)照蛋白篩選的結(jié)果所含小分子數(shù)400 0004 0683 1201503.2.2經(jīng) ADMET 類藥性分析的結(jié)果CDOCKER 的虛擬對(duì)接篩選1 95

22、5將 以 上LigandFit的 對(duì) 接 結(jié) 果 導(dǎo) 入 到CDOCKER程 序 ， 采 用-CDOCKER_INTERACTION_ENERGY 進(jìn)行對(duì)接打分，每個(gè)小分子保存對(duì)接結(jié)果打分最高的構(gòu)象9，運(yùn)行 CDOCKER。運(yùn)行結(jié)果如表 4 所示。155表 4. CDOCKER 篩選對(duì)接結(jié)果Table 4. Result from the CDOCKER methods篩選項(xiàng) 經(jīng)閾值篩選的結(jié)果 經(jīng)陽(yáng)性對(duì)照蛋白閾值篩選結(jié)果 篩選結(jié)果 427 67 4 討論分析本文經(jīng)過(guò)以上虛擬篩選，得到了 67 個(gè)小分子化合物，而后進(jìn)行結(jié)合模式分析、與已上市藥物或臨床研究中藥物比照分析。1604.1結(jié)合模式分析根

23、據(jù)已有文獻(xiàn)的報(bào)道以及本文的熱點(diǎn)殘基分析，具備較好預(yù)測(cè)活性的命中小分子與ALR2 蛋白晶體需滿足一下條件：與 Tyr48、His110、Trp111 三個(gè)氨基酸殘基至少形成一個(gè)氫鍵作用力；與 Trp111 存在-共軛作用?；谝陨蠗l件，對(duì) 67 個(gè) CDOCKER 篩選結(jié)果進(jìn)行結(jié)合模式的分析，得到 13 個(gè)符合此條件的命中小分子，其與 3 種 ALR2 蛋白晶體的結(jié)合165情況如表 5 所示。表 5. 13 個(gè)命中小分子與 3 種 ALR2 蛋白晶體的結(jié)合模式Table 5. Binding modes between thirteen hits and three A LR2 structur

24、es分子 ID 號(hào)相互作用情況1US02FZD2PDKH-Bonds-H-Bonds-H-Bonds-InteractionInteractionInteractionTyr48His110Trp111Trp111Trp20Tyr48His110Trp111Trp111Trp20Tyr48His110Trp111Trp111Trp20AG-690/12373383AG-690/12373386AG-690/12472597AG-690/40752021AH-487/42197325AK-918/12272134AK-968/15360839AK-968/41845152AK-968/41925

25、125AM-807/14147550AN-329/13481005AG-690/15431187AG-690/15436375-5-13 個(gè)小分子的 CDOCKER 打分結(jié)果如表 6 所示。170SPECS ID表 6. 13 個(gè)命中小分子的 CDOCKER 打分結(jié)果Table 6. The CDOCKER scores (kcal/mol) from of 13 compoundsCDOCKER_INTERACTION_ENETGY Molecular WeightAG-690/12373383 41.27 353.36AG-690/12373386 39.67 373.78AG-690/1

26、2472597 39.43 303.24AG-690/40752021 41.59 333.41AH-487/42197325 39.58 365.33AK-918/12272134 45.17 335.35AK-968/15360839 43.31 301.77AK-968/41845152 39.00 346.16AK-968/41925125 41.38 320.73AM-807/14147550 38.91 364.29AN-329/13481005 39.47 258.27AG-690/15431187 43.87 369.78AG-690/15436375 38.25 265.26

27、4.2與已上市藥物或臨床研究藥物的比照分析目前已上市的藥物包括 sorbini、minalrestat、ranirestat(AS-3201)和 fidarestat。將這些上175市的藥物的分子結(jié)構(gòu)包含在一個(gè)新建的分子庫(kù)中，使用 CDOCKER 對(duì)三種靶標(biāo)蛋白進(jìn)行對(duì)接打分，并將結(jié)果與 13 個(gè)命中化合物作比照，評(píng)價(jià)這四化合物的預(yù)測(cè)活性表 7。表 7. Sorbini, Minalrestat, Ranirestat (AS-3201) 和 Fidarestat 的 CDOCKER 打分Table 7. The CDOCKER scores of Sorbini, Minalrestat, R

28、anirestat (AS-3201) and Fidarestat-CDOCKER_INTERATION_ENERGY (kcal/mol)上市藥物1US0 2FZD 2PDK平均打分sorbini 30.75 26.18 31.36minalrestat 46.50 38.37 42.31ranirestat 44.91 40.01 39.69fidarestat 42.90 29.84 37.5529.4342.3941.5436.76打分均值37.53180本文中，所命中的 13 小分子的對(duì)接打分均值為 37.88，大于以上四種藥物的 CDOCKER打分均值，因而所命中的局部小分子的預(yù)

29、測(cè)活性高于或偏高于已有上市藥物。5 結(jié)論從 SPECS 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得到 13 個(gè)小分子表 6，它們對(duì) ALR2 具有較好的預(yù)測(cè)活性，185190195且與 ALR2 的結(jié)合模式符合現(xiàn)有研究的預(yù)測(cè)模型和 ALR2 晶體結(jié)構(gòu)中的 Tyr48，His110 和Trp111 均顯示出相互作用，其-CDOCKER INTERACTION ENERGY 均處于較為理想的打分區(qū)間 34.49 42.93 kcal/mol。本實(shí)驗(yàn)采用了對(duì)照蛋白陽(yáng)性篩選的實(shí)驗(yàn)方法，利用 ALR1 的3H4G 晶體蛋白作為對(duì)照，從對(duì) ALR2 的篩選結(jié)果中剔除對(duì) 3H4G 顯示陽(yáng)性的小分子，以確保所命中的小分子對(duì) ALR2 具備

30、較高的選擇性。所命中的小分子對(duì) 3H4G 的對(duì)接打分已低于所設(shè)閾值，僅有局部小分子與 3H4G 的 His113 存在氫鍵作用，因而所命中的小分子理論上對(duì) ALR2 有較高的選擇性。參考文獻(xiàn) (References)1 中 華 醫(yī) 學(xué) 會(huì) 糖 尿 病 學(xué) 分 會(huì) CDS 和 IDF. 糖 尿 病 知 識(shí) - 中 國(guó) 糖 尿 病 患 者 數(shù) 居 全 球 之 首OL.2021-07-18. :/ tnbzy /html/540-56/56626.html2 李貞雙,李超林.計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)在新藥研究中的應(yīng)用J. Computer Knowledge and Technology 電腦-6-知識(shí)與

31、技術(shù)，2021， 531：8812-8813.3 黃偉, 唐燦.黃酮類醛糖復(fù)原酶抑制劑的研究進(jìn)展J. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2021， 206：1470-1471.4 朱長(zhǎng)進(jìn).抗糖尿病并發(fā)癥藥物-醛糖復(fù)原酶抑制劑J. Chin. J. New Drugs,2021,18,(4),303-306.2002052102155 谷娟 ,嚴(yán)謹(jǐn) ,吳衛(wèi)華 , 黃琪 , 歐陽(yáng)冬生 . 醛糖復(fù)原酶的研究進(jìn)展 J. 中南大學(xué)學(xué)報(bào) (醫(yī)學(xué)版 ) 2021,35( 4 ),395-400.6 Sandro Cosconati, Luciana Marinelli, Concettina LaMotta, Stefania Sartini, Federico Da Settimo, Arthur J.Olson, and Ettore Novellino. Pursuing