敲除小鼠常見問地的題目與回答

1、實用標準文案敲除小鼠常見問題與回答一、什么是ES細胞顯微注射？答：胚胎干細胞顯微注射是制作基因敲除小鼠的一個最常用的方法。主要過程是將攜帶目的基因的胚胎干細胞注射到小鼠的囊胚腔中獲得嵌合體小鼠。所得嵌合體小鼠的組織，將同時含有來源于囊胚的細胞和胚胎干細胞。嵌合體小鼠必須和野生型小鼠配種以決定遺傳改變的生殖系能否傳遞，這樣可能獲得轉基因或打靶基因（來源于胚胎干細胞）穩(wěn)定的生殖系傳遞的小鼠。一般情況下，大約能獲得 50%繼承了目的基因的后代。二、嵌合體遺傳學上用以指不同遺傳性狀嵌合或混雜表現的個體。免疫學上的涵義則指一個機體身上有兩種或兩種以上染色體組成不同的細胞系同時存在，彼此能包耐受，不產生排

2、斥反應，相互間處在嵌合狀態(tài)。在基因敲除鼠中指通過向囊胚注射被外源基因轉化了的胚胎干細胞，使得發(fā)育成為的個體中含有不同基因型的細胞，產生的個體也叫嵌合體，即該生物體中嵌合了兩種不同遺傳結構的細 胞（一種是基因型被改變了的細胞，另一種是原來的基因型的細胞）。三、條件性敲除的原理？答：Cre-LoxP系統(tǒng)是源于 P1噬菌體的一個 DNA重組體系，由Cre酶和相應的LoxP位點組成 它能導致重組發(fā)生在特定的DNA序列處（LoxP位點），該系統(tǒng)可以將外源基因定點整合到染色體上或將特定DNA片段刪除?；?Cre-LoxP的基因打靶要分兩步來進行。首先要在胚胎干細胞 的基因組中引入 LoxP序列，這一步可

3、以通過打靶載體的設計和對同源重組子的篩選來實現。下 一步通過Cre介導的重組來實現靶基因的遺傳修飾或改變。Cre-LoxP系統(tǒng)既可以在細胞水平上用Cre重組酶表達質粒轉染中靶細胞，通過識別LoxP位點將抗性標記基因切除，又可以在個體水平上將重組雜合子小鼠與Cre轉基因小鼠雜交，篩選子代小鼠就可得到刪除外源標記基因的條件性敲除小鼠。四、如何鑒定和挑選嵌合體？答：動物只有部分組織細胞整合有外源基因，則稱為嵌合體動物。 它的鑒定主要根據毛色去鑒定。注射的ES和囊胚來源不同的小鼠品系。 它們的毛色不同。 因此可以根據毛色的嵌合率來鑒定和 挑選嵌合體。五、ROSA26與定點插入？答：利用同源重組技術，把

4、外面的cDNA片段或者其他 DNA片段，定點插入到 ROSA26位置ROSA26是一個安全區(qū)域，外源性的基因定點插入這個位點不會影響其他基因的表達。常見問題1、你們是否接受打靶載體或者重組的胚胎干細胞之后的服務工作？目前公司主要提供基因敲除定制化的全程服務，同時也可以承擔打靶載體構建、細胞 轉染和顯微注射等服務項目。2、您公司的C57BL/6野生型胚胎干細胞株是否可以出售？C57BL/6野生型胚胎干細胞株我們是不對外出售的。這個細胞株是我們自主研發(fā)并具 有自主知識產權的細胞系。鑒于基因敲除工作的重要環(huán)節(jié)以及是否可以得到一個比較好的 Germline transmission的關鍵就是是否有一個

5、高質量的ES cell line ,因此這個 ES cellline已經成為我們公司的最核心的資產。所以，非常抱歉！我們不能對外出售，請您諒解！3、公司最后提供給客戶多少只 F1代小鼠？有相關的檢測方法或檢測報告嗎？我們最后提供給客戶的是不少于兩只的F1雜合子小鼠。一般情況下，我們可以提供更多的F1代雜合子小鼠。我們會有相關的檢測方法和最終的檢測報告提供給您，您也可以自 己進行核實檢測！也可以在我們的幫助之下完成。4、客戶委托公司制備基因敲除小鼠需要提供哪些材料？客戶只需要告訴我們要操作的基因名字和您的特殊要求。對于沒有經驗的客戶，我們會免費為您提供咨詢，了解您的需求，以及想得到的結果，為您提

6、供最佳的設計方案。我 們會對該基因進行序列分析后，給您一個初步的設計，雙方溝通沒有問題后，我們會簽署 一份技術服務合同，然后我們進行BAC的訂購，開始模型的制備。直到您得到 F1代小鼠。5、公司是否能提供大鼠的基因敲除服務？我們公司現在主要是提供各種基因敲除小鼠模型的制備服務。有關基因敲除的大鼠模 型，我們公司正在對技術進行研發(fā)和優(yōu)化。所以現在還不能為您提供基因敲除的大鼠，非 常抱歉！請關注我們公司的網站。我們一旦開始提供大鼠基因敲除服務，我們將在公司網 站上公布（估計在 2013年）。6、公司提供基因敲進服務時，對敲進的基因有哪些要求？所能接受的最大分子量是多少？公司提供基因敲進服務時，對于

7、特殊的基因，需要客戶提供cDNA信息，插入基因片段的大小一般在5K以下，效果比較好。對于 5-10kb的，效率可能會低一些。對于大片段的 敲進，由于重組效率將大大地降低，我們可能會收取較多的費用。7、公司會安排多少個陽性克隆進行囊胚注射？我們通常在注射的時候會安排四個克隆，但是我們做陽性重組胚胎干細胞篩選的時候 通常要求得到不少于6-8個克隆，以備篩選更好的注射克隆之用。而且，我們的最終目標是要得到優(yōu)良的 Germ-line transmission 。8、公司如何對轉染的ESC進行篩選，如何確保目的基因的正確插入？我們在構建打靶載體時會引入NEO亢性基因篩選標記，同時在打靶載體特定位置引入酶

8、切位點。打靶載體電轉細胞后，首先進行G418的抗性初篩。之后，我們會通過兩次 Southern雜交實驗，對插入位點的兩端進行驗證，以此確保目的基因完整的插入到正確位置，以及 其它位置沒有隨機插入。9、公司制備完成的小鼠如何運輸？公司在根據客戶的要求得到F1雜合子小鼠后，我們會根據客戶的具體要求選擇運輸方式與運輸日期。如果您沒有特殊要求，我們會通過專業(yè)的實驗動物運輸公司，以空運的方 式安排運輸。10、何謂Flox小鼠？所謂Flox小鼠是指在某個基因的某個外顯子兩側各放一個LoxP序列。這段序列就是Flanked by LoxP ,也就叫做Flox小鼠。這種 Flox小鼠一般要通過設計構建打靶載體

9、、胚 胎干細胞重組、囊胚顯微注射、和嵌合體小鼠傳代來獲得。11、條件性敲除設計中，為什么在抗性基因的兩側設計的是Frt-Flip 重組系統(tǒng)，而敲除目的基因用的是 Cre-Loxp重組系統(tǒng)？在設計中，其中的一個系統(tǒng)是為了把抗性基因去掉。另一個系統(tǒng)是為了把目的基因去 掉。Frt-Flip 系統(tǒng)或Cre-Loxp系統(tǒng)都可以用來放在抗性基因或是目的基因外顯子的兩側。 理論上是沒有區(qū)別的。只所以“在抗性基因的兩側設計的是Frt-Flip重組系統(tǒng)，而敲除目的基因用的是Cre-Loxp重組系統(tǒng)”，主要有以下幾個原因：1)工具鼠：Cre-LoxP系統(tǒng)已經用了將近 20年了，科學家研發(fā)了很多的Cre工具鼠。其實

10、目前絕大部分工具鼠都是Cre工具鼠?，F在大家做一個Flox(Flanked By LoxP)小鼠花費很多的時間和金錢，都會希望自己的小鼠與更多的工具鼠交配，得到更多的結果。2) Flip 酶的活性比較低。Flip酶是從酵母中分離出來的。其最適溫度是30度，而小鼠的體溫是37度。盡管現在有些實驗室對Flip的37度適應性做了優(yōu)化，但應該還是沒有Cre的活性好。把 Frt放在抗性基因的兩側，得到小鼠之后，跟 Flip Deleter小鼠交配，篩選出去掉了抗性基因的小鼠，就是Flox小鼠了。即使Flip的活性不高，也可以得到Flox小鼠。這些Flox小鼠可以跟各種 Cre工具鼠交配，得到條件性敲除小

11、鼠。反過來，如果用Cre來去掉抗性基因，得到的是Frt小鼠。這種情況下，一是可用的工具鼠很少，二是即使有，效率也可能不高。如果看5、6年前的文章，大家其實是把Loxp不僅放在要敲除基因的兩側，也用來敲除抗性基因（NeoR）。那個時候篩選起來特別麻煩。因為要做大量的篩選，篩出只敲掉抗性基因， 而沒有敲掉目的基因的Flox小鼠。需要很多的時間和精力。12、怎樣用最簡單的描述區(qū)分基因敲除、基因敲進、基因敲降、和轉基因1）基因敲除（Knockout）:把一個基因從基因組里面全部或部分拿掉；2）條件性基因敲除（Conditional KO）:把一個基因從特定細胞的基因組里面全部或部分拿掉；3）基因敲進（

12、Knockin）:在基因組里放一個外源基因（如 GFP, LacZ, TdTomato 等）；4）基因敲降（Knock-down）: 通過降解mRNA勺方法降低蛋白的表達水平（一般是用 microRNA或 siRNA）。5）轉基因：在體內過表達一個特定基因，就象在細胞系里用高水平表達載體表達一個蛋白。13、嵌合鼠的嵌合率很高，但是得不到雜合子是什么原因？高嵌合率不代表種系傳遞就好。許多實驗室，包括我們公司，都發(fā)現特別高嵌合率的嵌合體小鼠不能交配產仔。原因不是很清楚，這應該跟打靶的基因是不是性染色體沒有關系?？梢詸z查一下嵌合體小鼠是不是有隱睪的現象。另外，毛色看到的嵌合率與生殖細胞 的嵌合率不一

13、定完全一致。也有人認為雄性ES細胞注射到雌性囊胚使得胚胎發(fā)育過程中性別轉化不完全，造成的所謂不男不女現象?，F在好像還沒有一個定論知道到底是什么原因。14、ROSA261點插入外源基因的設計原理是什么？Rosa26位點基因敲入，在原來的設計中，目的基因cDNA上游帶有一段轉錄終止序列“Stop” （3個拷貝的SV40多聚A序列，tPA）,轉錄終止序列的兩端各有一個Loxp位點，將此結構定點嵌入 Rosa26基因位置，整個2構的轉錄受Rosa26啟動子控制。在沒有 Cre的情況下，由于 Rosa26啟動子與目的基因之間“ STOP的存在，目的基因不能被表達。如 果有Cre表達，Cre重組酶將去除“

14、 STOP , Rosa26啟動子就可以啟動目的基因表達。但是，由于Rosa26啟動子是一個弱啟動子，其啟動能力有限，目的基因經常達不到研究人員 需要的表達水平。為了解決這一問題，可以對原Rosa26基因敲入系統(tǒng)做改進，引入了一個強效的啟動子，如 CAG啟動子，該啟動子由雞 actin啟動子和CMV曾強子融合而成，用這 一雜合啟動子代替 Rosa26啟動子，從而高效地啟動目的基因表達。15、在做條件性基因敲除小鼠模型的設計時，為什么不能從exon1敲除？條件性基因敲除小鼠模型的設計，不能從exonl開始敲除，原因是loxp site 最好不要插入到啟動子區(qū)域，因為很難預測啟動子和所有調控元件的

15、位置，loxp的插入很有可能會因為破壞了啟動子或調節(jié)原件而影響野生型蛋白的表達，所以條件性敲除設計中，一般 都不會從exonl開始敲除。16、目前基因沉默小鼠模型存在的缺陷有哪些？1）目前用于基因沉默的技術方法主要是siRNA。對于一個待敲除的候選基因，需要設計多個siRNA,并對每一個siRNA進行驗證（一般利用細胞系），這就造成篩選具有干擾作用 siRNA的選擇難度相當大。2） 一般情況下，RNAi對于基因的抑制不會很完全。在體外細胞實驗中，我們一般只是觀察1-5天，以驗證 siRNA的抑制功能。而在小鼠體內，siRNA盡管可以降低 mRNAs勺水平,從而影響蛋白的表達，但并不一定影響基因

16、的功能。一是蛋白表達水平雖然達不到正常水平，但可能同樣發(fā)揮完整的功能；二是蛋白表達水平降低會導致蛋白降解速度降低，從而使蛋白的整體水平得到補償。所以，除非非常運氣，siRNA轉基因一般很難得到比較肯定的結果。如果不能完全阻斷基因的表達，利用siRNA進行基因敲降時沉默掉的基因仍保留一定的表達信號，可能會得到無法解釋的實驗數據。除非是為了研究siRNA,或miRNA在體內的功能（而不是研究 siRNA/miRNA所對應的候選基因），一般我們不建議利用siRNA法進行基因敲除的設計。在這種情況下，我們通常會建議客戶做基因敲除來達到目標基因缺失 其原始蛋白功能的目的。17、為什么來源于129背景的小

17、鼠胚胎干細胞的模式小鼠一定要在C57BL/6背景的小鼠上進行回交？1）發(fā)明小鼠基因敲除技術以來，傳統(tǒng)上一直用129遺傳背景的小鼠胚胎干細胞進行基因打靶制備模式小鼠，然后在C57BL/6等近交系小鼠上回交（back-cross）超過10代，才能進行諸如免疫學、癌癥、神經學等絕大部分生物醫(yī)學研究?；亟恢辽傩枰?年多的時間，給科研工作者在時間上、金錢上造成很大損失。比如生物實驗經常進行諸如細胞器官移植等實驗，我們從動物供應商得到的小鼠多數是C57BL/6或Balb/C等純系小鼠，而很少供應大量129小鼠以進行實驗。如果由 129品系ES細胞制備的模式小鼠在C56BL/6品系上回交的代次不夠，就會帶有很多129小鼠抗原。將其細胞等移植到C57BL/6或其他近交系小鼠后，受體鼠會由于自身免疫排斥的原因，將轉移的細胞殺死或產生耐受現象。2）由于129品系小鼠遺傳背景復雜，得到的模式小鼠需在 C57BL/6等近交系小鼠上做回交，并且回交次數不同也會造成實驗結果重復性差。這對開發(fā)制作標準模式動物是一個很大的 難題，對生物科研、醫(yī)藥企業(yè)、安評中心、藥檢部門等，也是一個很大的缺憾。所以如果能夠直接用 C57BL/6 ES細胞進行基因打靶，就將直接獲得C57BL/6品系的模式小鼠，保證了模式小鼠的穩(wěn)定性，極大的提高了制作速度縮短了科研周期。18、既然129背景的模式小鼠不能直