生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)復(fù)習(xí)重點(diǎn)匯編詳細(xì)

1、前言1,本課程主要講述了哪些實(shí)驗(yàn)技術(shù),其中被稱為生化實(shí)驗(yàn)室中三大實(shí)驗(yàn)技術(shù)的是？答：層析技術(shù)、電泳技術(shù)、離心技術(shù)、分光光度技術(shù)、免疫化學(xué)技術(shù).其中層析技術(shù)、電泳技術(shù)、離心技術(shù)是生物學(xué)的三大實(shí)驗(yàn)技術(shù).第一章生物化學(xué)根本操作與要求1 .洗滌液的種類配置與應(yīng)用答：1銘酸洗液稱取5g重銘酸鉀粉末置于250mL燒杯中,加水5mL,盡量使其溶解,慢慢參加濃硫酸100mL,邊加邊攪拌.冷卻后貯存?zhèn)溆?假設(shè)顏色變綠,表示洗液已失效.用于洗滌玻璃器皿.2濃鹽酸,洗去水垢或某些無(wú)機(jī)鹽沉淀.330%硝酸,洗滌CO2測(cè)定儀器及微量滴管445%尿素,洗滌蛋白制劑、血樣5有機(jī)溶劑,洗滌油脂、脂溶性染料6去污粉,一般污染物2

2、 .化學(xué)試劑的分級(jí)答：級(jí)別一紜二級(jí)三級(jí)四級(jí)我國(guó)林推優(yōu)縱純分析純化學(xué)純實(shí)驗(yàn)試劑生物試劑符號(hào)GRARJP,P.LR,3 .什么是準(zhǔn)確度、精密度？答：準(zhǔn)確度表示實(shí)驗(yàn)分析測(cè)量值與真實(shí)值相接近的程度.誤差.精密度是指在相同條件下屢次測(cè)量結(jié)果互相吻合的程度,表現(xiàn)了測(cè)定結(jié)果的再現(xiàn)性.偏差.4 .如何提升實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度、精密度？答：準(zhǔn)確度：減少系統(tǒng)誤差1.儀器校正2.空白試驗(yàn)3.對(duì)照實(shí)驗(yàn)；精密度：減少偶然誤差1 .平均取樣2.屢次取樣.第二章層析技術(shù)1 .層析技術(shù)及其原理答：層析技術(shù)是一種基于被別離物質(zhì)的物理、化學(xué)、生物學(xué)特性的不同,使它們?cè)谀撤N機(jī)制中移動(dòng)速度不同而進(jìn)行別離和分析的方法.2 .名迅：固定相、流動(dòng)

3、相、分配系數(shù)答：固定相：固定相是層析的一個(gè)基質(zhì).它可以是固體物質(zhì)如吸附劑、凝膠、離子交換劑等也可以是液體物質(zhì)如固定在硅膠或纖維素上的溶液,這些基質(zhì)能與待別離的化合物進(jìn)行可逆的吸附、溶解、交換等作用.流動(dòng)相：在層析過(guò)程中,推動(dòng)固定相上待別離的物質(zhì)朝著一個(gè)方向移動(dòng)的液體、氣體等.分配系數(shù)：是指在一定的條件下,某種組分在固定相和流動(dòng)相中含量的比值,Kd=固定相中的總量/流動(dòng)相中的總量.3 .層析法的分類答：按流動(dòng)相的形式分：氣相色譜法1.氣固色譜法2.氣液色譜法,液相色譜法1.液固色譜法2.液液色譜法；按固定相的形式分：1.柱層析法2.紙層析法3.薄層層析法.4 .幾種主要凝膠的中英文名稱、型號(hào)、及

4、型號(hào)數(shù)字代表的含義答：葡萄糖凝膠dextran型號(hào)SephadexG-10200數(shù)字代表凝膠的吸水率聚丙烯酰胺凝膠polyacrylamide主要型號(hào)有Bio-GelP-2300,數(shù)字代表它們的排阻極限的10-3瓊脂糖凝膠agaroseSepharose,Bio-GelA5 .凝膠層析及其根本原理、操作過(guò)程和主要應(yīng)用答：是利用凝膠把物質(zhì)按分子大小不同進(jìn)行別離的一種方法.原理：由于被別離物質(zhì)的分子大小不同,洗脫時(shí),大分子物質(zhì)由于直徑大于凝膠網(wǎng)孔不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部,只能沿著凝膠顆粒間的孔隙,隨溶劑向下移動(dòng),因此流程短,首先流出層析柱,而小分子物質(zhì),由于直徑小于凝膠網(wǎng)孔,能自由進(jìn)出膠粒網(wǎng)孔,使之洗脫流

5、程增長(zhǎng),移動(dòng)速度慢而后流出層析柱.應(yīng)用：1脫鹽及去除小分子雜質(zhì)2蛋白質(zhì)的別離、生物大分子的純化3分子量測(cè)定4去熱源物質(zhì)5溶液的濃縮6 .離子交換層析的原理、離子交換劑的類型答：原理：依據(jù)各種帶電離子或生物大分子與帶相反電荷離子交換劑的結(jié)合力不同而進(jìn)行別離純化的.陰離子交換劑：吸附陰離子,如DEAE;陽(yáng)離子交換劑：吸附陽(yáng)離子,如CM.7 .離子交換色譜的操作和應(yīng)用答：1.離子交換齊J的選擇2.離子交換劑的處理和保存3.層析柱白選擇4.平衡緩沖液的選擇5.洗脫、洗脫速度限制6.樣品的濃縮、脫鹽7.再生和保存.應(yīng)用：1.水處理2.別離純化小分子物質(zhì)3.別離純化生物大分子物質(zhì).8 .何謂親和層析答：是

6、利用生物分子間專一的親和力而進(jìn)行別離的一種層析技術(shù).9 .各種層析原理和載體的綜合比擬見(jiàn)ppt表答：第三章電泳技術(shù)1 .電泳技術(shù)的概念答：帶電物質(zhì)在電場(chǎng)中向相反電極移動(dòng)的現(xiàn)象.2 .電泳的分類答：按別離的原理：1.區(qū)帶電泳2.自由界面電泳3.等速電泳4.等電聚焦電泳；按支持介質(zhì)的不同：1.紙電泳2.醋酸纖維薄膜電泳1、2為區(qū)帶電泳3.瓊脂凝膠電泳4.聚丙烯酰胺凝膠凝膠電泳PAGE5.SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE;按支持介質(zhì)形狀不同：1.薄層電泳2.板電泳3.柱電泳；按用途不同：1.分析電泳2.制備電泳3.定量免疫電泳4.連續(xù)制備電泳；按所用電壓不同：1.低壓電泳2.高壓電泳.3

7、.什么是遷移率？影響遷移率、電泳別離的主要因素答：是指帶電顆粒在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下泳動(dòng)的速度,m=v/E.遷移率與帶電分子所帶凈電荷成正比,與分子的大小和緩沖液的粘度成反比,與粒子的形狀有關(guān)；電泳別離的影響因素：1.帶電顆粒的性質(zhì)所帶凈電荷的數(shù)量大小及形狀2.溶液的pH值離等電點(diǎn)遠(yuǎn),快3.溶液的離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度小泳動(dòng)快4.電場(chǎng)強(qiáng)度5.電滲作用方向一致,快6.支持介質(zhì)的篩孔.4 .如何制備聚丙烯酰胺凝膠？答：1.化學(xué)聚合：加速劑TEMED使催化劑過(guò)硫酸錢形成自由基,這些自由基的產(chǎn)生可引發(fā)丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的聚合、交聯(lián)反響形成；2.光聚合：催化劑核黃素經(jīng)光照形成無(wú)色基,再被痕量氧氧化成自由基,引

8、發(fā)聚合反響.TEMED存在可加速聚合.5 .聚丙烯酰胺凝膠電泳和不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳的區(qū)別、別離效應(yīng)答：區(qū)別：A:整個(gè)電泳體系中所用緩沖液,pH值和凝膠網(wǎng)孔都是相同的；B:在電泳系統(tǒng)中采用了兩種或兩種以上的緩沖液,pH值和孔徑.別離效應(yīng)A:分子篩效應(yīng)某分子通過(guò)這種網(wǎng)孔的水平將取決于凝膠孔隙和別離物質(zhì)顆粒的大小和形狀B:1.樣品的濃縮效應(yīng)2.電荷效應(yīng)3.凝膠的分子篩效應(yīng).6 .簡(jiǎn)述等電聚焦及其優(yōu)缺點(diǎn)答：是根據(jù)兩性物質(zhì)等電點(diǎn)pl的不同而進(jìn)行別離的.優(yōu)點(diǎn)：1.分辨率高,可達(dá)0.01pH單位2.能抵消擴(kuò)散作用,使區(qū)帶越走越窄3.可直接測(cè)出蛋白質(zhì)的等電點(diǎn),精確度可達(dá)0.01pH單位.缺點(diǎn)：1.該法要

9、求用無(wú)鹽溶液,而在無(wú)鹽溶液中蛋白質(zhì)可能發(fā)生沉淀2.不適用在等電點(diǎn)不溶或發(fā)生變性的蛋白質(zhì).7 .什么是雙向電泳？答：由第一向等電聚焦IEF電泳和第二向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE結(jié)合組成.第四章離心技術(shù)1 .離心技術(shù)的概念答：是利用轉(zhuǎn)頭旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力,根據(jù)物質(zhì)顆粒沉降系數(shù)、質(zhì)量、密度的差異將其分離的方法.2 .名詞：相對(duì)離心力、沉降速度、沉降系數(shù)、沉降常數(shù)答：相對(duì)離心力：F=mo2r,F常用重力加速度表示,稱為相對(duì)離心力.沉降速度：在離心力作用下,單位時(shí)間內(nèi)物質(zhì)顆粒運(yùn)動(dòng)的距離.沉降系數(shù)：?jiǎn)挝浑x心力下的沉降速度.沉降常數(shù)：顆粒在20c水中的沉降系數(shù).3 .離心機(jī)和離心轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)子的種類答

10、：離心機(jī)的種類：低速、高速、超速離心機(jī),冷凍離心機(jī),臺(tái)式、地式離心機(jī),制備性、分析性離心機(jī)；離心轉(zhuǎn)頭的種類：1.角度轉(zhuǎn)頭FA2.甩平式轉(zhuǎn)頭SW3垂直車專頭V4.區(qū)帶轉(zhuǎn)頭Z5.連續(xù)流動(dòng)轉(zhuǎn)頭CF.4 .簡(jiǎn)述離心別離的方法3種p99101答：1.差速沉降離心：不斷改變離心速度,使沉降速度不同的顆粒在不同的速度和時(shí)間下分批別離的方法,一般用于沉降系數(shù)相差較大的顆粒,用角度轉(zhuǎn)頭.2 .差速區(qū)帶離心：在一定離心力的作用下存在沉降系數(shù)差的不同顆粒各自以一定速度沉降,后在密度梯度不同的介質(zhì)上形成區(qū)帶,用于別離有一定沉降系數(shù)差的顆粒或密度相似大小不同的樣品和核酸、蛋白質(zhì)等成分.3 .等密度離心：離心管中預(yù)先放好

11、梯度介質(zhì)離心時(shí),樣品的不同顆粒一直移動(dòng)到與他們密度相等的特定梯度位置上,形成不同的區(qū)帶,用于別離大小相近而密度不同的樣品.5 .如何進(jìn)行離心區(qū)帶的收集？答：1.用注射器和滴管由離心管上部吸出6 .用針刺穿離心管底部滴出7 .用針刺穿離心管區(qū)帶局部的管壁,把樣品區(qū)帶抽出8 .用一根細(xì)管插入離心管底,泵入超過(guò)梯度介質(zhì)最大密度的取代液,將樣品和梯度介質(zhì)壓出,用自動(dòng)局部收集器收集.第五章分光光度技術(shù)1.名詞：朗伯-比爾定律、吸收光譜、吸收光譜曲線答：朗伯-比爾定律：當(dāng)一束平行單色光通過(guò)含有吸光物質(zhì)的稀溶液時(shí),吸光度與溶液的濃度、液層厚度的乘積成正比A=KCL.吸收光譜：通常分子處于基態(tài),當(dāng)他吸收一定能

12、量躍遷到激發(fā)態(tài),那么產(chǎn)生吸收光譜.吸收光譜曲線：假設(shè)逐漸改變照射某物質(zhì)的入射光的波長(zhǎng),并測(cè)定物質(zhì)對(duì)各種波長(zhǎng)光的吸收程度或透射程度,以波長(zhǎng)入作橫坐標(biāo),“A吸光度或“T透光度為縱坐標(biāo),畫出連續(xù)的“A-X'或"T-/曲線.5 .圖示說(shuō)明分光光度計(jì)的根本結(jié)構(gòu)答：6 .分光光度計(jì)的光源及適用范圍答：光源要求：1.能提供連續(xù)的輻射；2.光強(qiáng)度足夠大；3.在整個(gè)光譜區(qū)內(nèi)光譜強(qiáng)度不隨波長(zhǎng)有明顯變化；4.光譜范圍寬；5.使用壽命長(zhǎng)、價(jià)格低.熱輻射光源用于可見(jiàn)光和近紅外光區(qū)的光源如鴇燈和鹵鴇燈,使用波長(zhǎng)范圍是3201100nm,氣體放電光源用于紫外光區(qū)的如氫燈和笊燈,使用波長(zhǎng)范圍是195400n

13、m.7 .分光光度計(jì)分析條件的選擇見(jiàn)講義答1.儀器測(cè)量條件的選擇；2.顯色反響條件的選擇3.參比溶液的選擇.8 .為什么要進(jìn)行顯色反響？顯色反響需要滿足哪些要求？影響顯色反響的因素有哪些？答：響顯色反響的因素有：顯色劑用量,溶液酸度,顯色時(shí)間,溫度,溶劑9 .分光光度法在核酸與蛋白質(zhì)的純度分析中的應(yīng)用原理答：可用A260/A280的比值鑒定其純度純DNA比值為1.8,純RNA比值為1.0.第六章免疫化學(xué)技術(shù)1 .雙向免疫擴(kuò)散法答：是以瓊脂為介質(zhì)的Ag-Ab沉淀反響.2 .闡述2種免疫電泳的原理對(duì)流免疫電泳、火箭免疫電泳答：沉淀帶火箭免疫電泳,是將單向免疫擴(kuò)散和電泳相結(jié)合的一下定量檢測(cè)技術(shù).支持

14、物,瓊脂糖,參加抗體融化緩沖液pH8.6,抗原帶強(qiáng)負(fù)電,而抗體在此pH不帶電,不能遷移.電泳時(shí),含于瓊脂糖凝膠中的抗體與抗原結(jié)合,形成一個(gè)形狀如火箭的不溶性免疫復(fù)合物沉淀峰,峰的高度與檢樣中的抗原濃度呈正相關(guān).根據(jù)樣品的沉淀峰長(zhǎng)度即可計(jì)算出特測(cè)抗原的含量.3 .對(duì)流免疫電泳與雙向免疫擴(kuò)散法的異同答：對(duì)流免疫電泳：是在凝膠介質(zhì)中將電泳法和擴(kuò)散法相結(jié)合的一種免疫化學(xué)方法.雙向免疫擴(kuò)散法：是以瓊脂為介質(zhì)的Ag-Ab沉淀反響.異：對(duì)流免疫電泳是抗原、抗體分子在電場(chǎng)作用下定向運(yùn)動(dòng),雙向免疫擴(kuò)散法是自由擴(kuò)散.同：都基于瓊脂凝膠為介質(zhì)的一種沉淀反響的特性,根據(jù)沉淀出現(xiàn)與否及沉淀量的多寡,可定性定量地檢測(cè)出樣

15、品中抗原或抗體的存在及含量.4 .ELISA及其根本原理答：酶聯(lián)免疫吸附法是指將可溶性的抗原或抗體吸附到聚苯乙烯等固相載體上,進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量方法.根本原理：pl211使抗原或抗體結(jié)合到周相載體外表2抗原或抗體與某種悔連接成的標(biāo)抗原或抗體3把受檢標(biāo)本fAg戌Ab和酹標(biāo)抗原或抗體與固相載體表而的拄康或抗體起反響,結(jié)合在周相載體上的酶量與受椅標(biāo)本Ag或Ab量成正比,4參加傅的底物后,底物被海催化反響生成有色物質(zhì),顏色的深淺與受檢物質(zhì)的量成正比.第七章固定化技術(shù)1 .固定化酶、固定化細(xì)胞的概念答：固定化酶：將水溶性酶用物理化學(xué)方法處理,固定于不溶性載體上,稱為不溶于水,但仍有酶活性的一種酶制

16、劑形式.固定化細(xì)胞：就是被限制自由移動(dòng)的細(xì)胞,即細(xì)胞受到物理化學(xué)等因素約束或限制在一定的空間界限內(nèi),但細(xì)胞仍保存催化活性并能反復(fù)或連續(xù)使用.2 .固定化酶的優(yōu)點(diǎn),答：優(yōu)點(diǎn)：1.純化簡(jiǎn)單2.酶的穩(wěn)定性有所改良；3 .酶的使用效率提升,可以反復(fù)利用；4.反響條件容易限制.3 .固定化酶的制備方法答：1吸附法：利用離子鍵、物理吸附等方法,將酶固定在纖維素、瓊脂糖、多孔玻璃等載體上；2包埋法：用物理方法把酶包埋在凝膠細(xì)小的格子中,或包圍在半透膜或聚合物中,酶本身不參與反響；3共價(jià)結(jié)合法：酶與不溶于水的載體以共價(jià)鍵形式結(jié)合制備固定話酶的方法；4交聯(lián)法：雙功能試劑或多功能試劑與酶分子中的氨基酸殘基作用,使

17、酶與酶之間交聯(lián)成網(wǎng).4 .固定化細(xì)胞比固定化酶有何優(yōu)點(diǎn)？答：第八章生物大分子制備技術(shù)1 .生物大分子的制備的一般步驟是哪些?答：2 .生物大分子制備物均一性要滿足什么鑒定要求?答：3 .細(xì)胞破碎的方法答：反復(fù)凍融法；自溶法；溶脹法；有機(jī)溶劑處理法；外表活性劑處理法.5.蛋白質(zhì)的別離純化方法及簡(jiǎn)述分四大類,p142答：1.以分子大小和形態(tài)的差異為依據(jù)的方法：差速離心、區(qū)帶離心、超濾、透析和凝膠過(guò)濾等；2 .以溶解度的差異為依據(jù)的方法：鹽析、萃取、分配層析、選擇性沉淀和結(jié)晶等；3 .以電荷差異為依據(jù)的方法：電泳、電滲析、等電點(diǎn)沉淀、吸附層析和離子交換層析等；4 .以生物學(xué)功能專一性為依據(jù)的方法：親

18、和層析等.2 .如何檢測(cè)、判斷、提升提取DNA的質(zhì)量通過(guò)測(cè)定它的濃度和OD值.DNA溶液稀釋20-30倍后,測(cè)定OD260/OD280比值,明確DNA含量和質(zhì)量.通過(guò)分光光度計(jì)判斷.5 .什么是膜別離、透析、超濾、鹽析法膜別離：用具有選擇透過(guò)膜性能的薄膜別離膜,在外力推動(dòng)下對(duì)多組分溶質(zhì)和溶劑進(jìn)行別離、提純、濃縮的方法.透析：是通過(guò)小分子經(jīng)過(guò)半透膜擴(kuò)散到水或緩沖液的原理,將小分子與生物大分子分開(kāi)的一種別離純化技術(shù).超濾：是一種加壓膜別離技術(shù),即在一定的壓力下,使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過(guò)一定孔徑的特制的薄膜,而使大分子溶質(zhì)不能透過(guò),留在膜的一邊,從而使大分子物質(zhì)得到了局部的純化.鹽析：溶液中參加無(wú)機(jī)鹽

19、類而使某種物質(zhì)溶解度降低而析出的過(guò)程6 .DNA、RNA的定量答：7 .生物大分子濃縮、枯燥的方法答：濃縮的方法：1.減壓加溫蒸發(fā)濃縮2.空氣流動(dòng)蒸發(fā)濃縮3.冰凍法4.吸收法5.超濾法.枯燥的方法：1.真空枯燥2.真空冷凍枯燥第九章放射性同位素技術(shù)1 .什么是同位素示蹤法,有什么特點(diǎn)？答：是利用放射性核素作為示蹤劑對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行標(biāo)記的微量分析方法.特點(diǎn)：1.靈敏度高2.測(cè)量方法簡(jiǎn)便易行3.能準(zhǔn)確地定量定位4.符合研究對(duì)象的生理?xiàng)l件.2 .放射性防護(hù)的三原那么答：放射實(shí)踐的正當(dāng)化、放射防護(hù)的最優(yōu)化、個(gè)人劑量限制第十章PCR1 .什么是PCR,PCR的主要步驟是什么？答：聚合酶鏈反響技術(shù)是在模板D

20、NA、引物和4種脫氧核糖核甘三磷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶進(jìn)行的酶促合成反響.主要步驟：1.雙鏈DNA模板加熱變性成單鏈變性;2 .在低溫下引物與單鏈DNA互補(bǔ)配對(duì)退火；在適宜溫度下TaqDNA聚合酶催化引物沿著模板DNA延伸延伸.3 .什么是PCRSSCP,簡(jiǎn)述它的根本原理、主要應(yīng)用.答：實(shí)驗(yàn)局部1.蛋白質(zhì)酶別離純化的一般步驟、鑒定方法、考前須知蛋白質(zhì)和酶制品純度鑒定通常采用的方法有,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法、等電聚焦電泳法、超速高心沉降分析法、層析等.小純的蛋白質(zhì)在一定條件下進(jìn)行電泳,將以單一的速度移動(dòng),一維電冰一條帶,二電泳一個(gè)點(diǎn),層析,HPLC.毛細(xì)管電泳都是一個(gè)峰,同樣純的

21、蛋白質(zhì)在離心場(chǎng)中,應(yīng)以單一的沉降速度移動(dòng).考前須知：:.1. DNA的提取"：不同的材料,提取方法略有不同：最后制品中的R、&可用Rns醍水解除去.2. RNA的提取預(yù)防RNA降解,異硫索酸胭法提取總R、A.RNA、HCA、mRNA分開(kāi)方法:差速離心,分開(kāi)細(xì)胞器I根據(jù)n】R、A的p心A尾巴*用H旭.dl層折柱純化.1 .分光光度計(jì)使用時(shí),在波長(zhǎng)360nm1000nm內(nèi),用熱輻射光源作光源.在波長(zhǎng)200ne350nm范圍內(nèi),用氣體放電光源作光源;其測(cè)定值A(chǔ)在0.20.8范圍內(nèi)誤差較小.2 .Bio-gelP中文名是聚丙烯酰胺凝膠,其型別P300表示排阻極限為4*105.3 .離

22、心轉(zhuǎn)頭是離心機(jī)的主要部件之一,主要可分為角度轉(zhuǎn)頭、垂直轉(zhuǎn)頭、甩平式轉(zhuǎn)頭、區(qū)帶轉(zhuǎn)頭、連續(xù)流動(dòng)轉(zhuǎn)頭等.4 .DNA常用紫外分光光度法進(jìn)行定量,通常1OD60相當(dāng)干50ug/ml雙加NA.1 .帶電顆粒在電場(chǎng)中的電泳別離取決于以下哪項(xiàng)因素：ABCDEA.電場(chǎng)強(qiáng)度B.顆粒所帶凈電荷數(shù)及其大小形狀C.支持物的電滲作用D.溶液的pH值E.溶液的離子強(qiáng)度2 .偶然誤差是由于某些難以預(yù)料的偶然因素或是測(cè)定過(guò)程中某些不易限制的因素引起的誤差.請(qǐng)問(wèn)以下哪些方法可以減少偶然誤差？CEA.儀器校正B.對(duì)照實(shí)驗(yàn)C.平均取樣D.空白實(shí)驗(yàn)E.屢次取樣3,以下哪些方法可用于細(xì)菌細(xì)胞的破碎？ABCDEA.超聲波處理B,高壓擠壓勻漿C,纖維素酶處理D,溶菌酶處理E,搗