銀杏中黃酮的提取分離純化

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上銀杏中黃酮的提取分離純化一、綜述銀杏樹具有觀賞、經(jīng)濟(jì)、食用、藥用等價(jià)值，銀杏葉含多種活性成分，包括黃酮、萜類、內(nèi)酯、聚戍烯醇、生物堿、術(shù)酯體等，在藥用方面，銀杏葉提取物的有效成分主要是黃酮苷類和萜類物質(zhì)，有通過降低血液黏彈性改善微循環(huán)系統(tǒng)的功能，銀杏葉中黃酮類化合物的含量較高，主要有黃酮及其苷、雙黃酮、兒茶素這三類物質(zhì)。其中黃酮及其苷類化合物大多數(shù)是由槲皮素、山萘醇及其苷組成。黃酮類化合物主要是指母核為2-苯基色原酮的一類化合物，現(xiàn)在則泛指具有C6-C3-C6基本結(jié)構(gòu)骨架的一大類天然化合物。天然黃酮類化合物母核上常含一些助色團(tuán)，使該類化合物多顯黃色，又因?yàn)榉肿又?吡酮

2、環(huán)上的氧原子能與強(qiáng)酸成鹽而表現(xiàn)為弱堿性，因此稱為黃堿素類化合物。黃酮類化合物不僅來源廣泛而且表現(xiàn)出多種多樣的藥理活性,具有對(duì)免疫系統(tǒng)作用、防癌抗癌作用、抗腫瘤作用、抗心血管疾病作用、對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)的作用、消除自由基和抗氧化活性。二、實(shí)驗(yàn)依據(jù)1、黃酮類化合物的分析方法分光光度法該法是測(cè)定黃酮類化合物含量最為普遍的一種分析方法。；黃酮類化合物可與氯化鋁、硝酸鋁、氫氧化鉀等形成穩(wěn)定的絡(luò)合物,并產(chǎn)生特征吸收光譜，通常采用硝酸鋁比色法,黃酮類化合物與Al(NO3)3進(jìn)行絡(luò)合顯色，測(cè)定其含量33。高效液相色譜法高效液相色譜的固定相有硅膠柱和氨基柱，C18在黃酮類化合物的分析過程中應(yīng)用廣泛，在檢測(cè)器的選擇中，

3、紫外檢測(cè)仍是最普遍的檢測(cè)方法，此外還有電化學(xué)檢測(cè)器、光電二極管陣列檢測(cè)器、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器等2、黃酮類化合物提取方法有機(jī)溶劑提取法最常用的黃酮類化合物提取溶劑為乙醇和甲醇，高濃度的醇(如90%95%)有利于于提取苷元，濃度為60%的乙醇或甲醇水溶液適則有利于于提取苷類物質(zhì)；乙酸乙酯和丙酮也常用來提取黃酮類化合物。水浸提法隨著黃酮類提取物在市場(chǎng)上銷售價(jià)格的降低，對(duì)于提取劑的選擇，首先要考慮其成本問題，顯然水浸提法對(duì)于降低成本，提高產(chǎn)品的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力有很大的幫助，而且就環(huán)保的角度出發(fā)，水浸提法更加環(huán)保、安全。由于大多數(shù)黃酮類化合物含有酚羥基顯弱酸性，故而一般選擇堿水進(jìn)行提取，戴余軍等研究了NaOH溶

4、液提取銀杏葉總黃酮，不同的NaOH溶液濃度對(duì)黃酮提取有顯著影響，用50倍(V/W)0.25%的NaOH溶液70提取2次銀杏葉總黃酮提取率可達(dá)1.264%；劉金香等用堿溶酸沉法提取銀杏葉總黃酮，堿法提取95用40倍量pH=l0.0的NaOH溶液提取60min，然后用pH=3.5的HCl酸沉，得到黃酮提取率較單一用堿水提取有所上升。超臨界流體萃取法付桂明等對(duì)用杜仲葉提取總黃酮的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，采用超臨界CO2流體提取實(shí)驗(yàn)最佳提取工藝條件為：提取時(shí)間2.5h，提取溫度35，夾帶劑用量4.5ml/g，提取壓力28MPa。微波提取法李娜等用微波提取工藝提取苦丁茶冬青葉總黃酮，得到最佳提取條件為微波功率6

5、40W，微波時(shí)間70s，料液比125，乙醇濃度60%，總黃酮提取率為33.67mg/g；此外，黃酮類化合物的提取方法還有酶輔助提取法，利用酶技術(shù)處理細(xì)胞壁，破壞其纖維組織來提高黃酮的提取率，吳梅林等用酶活力為15000U/g的纖維素酶與銀杏3、黃酮類化合物分離純化方法黃酮類化合物的分離純化方法主要有樹脂柱層析法、大孔樹脂吸附法、重結(jié)晶法、鉛鹽沉淀法等多種方法。柱層析法柱層析技術(shù)又稱柱色譜技術(shù)，目前較為常用的柱層析法主要有聚酰胺柱層析法，王怡紅等將-萘酚橙水溶液加入聚酰胺填料中，制備改性聚酰胺柱并用其分離純化銀杏葉提取物，使得銀杏黃酮提取量大為提高。；硅膠柱層析法，對(duì)于黃酮類物質(zhì)，硅膠對(duì)黃酮有很

6、強(qiáng)的吸附能力，吸附后難以洗脫，因此，適用于極性較小的黃酮類物質(zhì)的分離。；此外，硅膠柱層析法多與大孔樹脂吸附法、薄層色譜法等聯(lián)合使用與黃酮的分離純化中所得產(chǎn)物純度較高，此外還有葡萄糖凝膠柱層析法等多種柱層析法。大孔樹脂吸附法大孔吸附樹脂其有良好的打孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和比表面積，對(duì)有機(jī)物的選擇性較好,不受無機(jī)鹽類及強(qiáng)離子低分子化合物存在的影響，如貝偉劍等用AB-8大孔吸附樹脂樹對(duì)柿葉黃酮富集和分離提純，提取物中富集制備柿葉黃酮含量達(dá)70%以上；分子印記技術(shù)分子印記技術(shù)一般用于黃酮類物質(zhì)的進(jìn)一步純化使用，如向文藝76等用膜分離技術(shù)對(duì)黃酮粗產(chǎn)品進(jìn)行初步的純化后再用分子印記聚合物進(jìn)一步精制提純，料液中黃酮質(zhì)量分

7、數(shù)為72%，三、技術(shù)路線采用蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，紫外分光光度法、溴量法測(cè)定黃酮的含量，選用工業(yè)酒精回流提取銀杏黃酮，選擇大孔吸附樹脂HPD-100。1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制在酸性條件下，最大吸收波長(zhǎng)在=352nm處，線性回歸方程為：A=0.0195c-0.0065，線性相關(guān)系數(shù)R=0.9991；該方法簡(jiǎn)單方便，可快速測(cè)定出銀杏葉中黃酮的含量，且根據(jù)測(cè)定精密度和準(zhǔn)確度均符合要求。溴量法主要用于測(cè)定芳香胺類和酚類有機(jī)化合物含量，根據(jù)苯環(huán)上有羥基和氨基，鄰位和對(duì)位氫易溴代反應(yīng)，而黃酮的結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)酚羥基和活潑的雙鍵，可以與溴發(fā)生取代反應(yīng)和加成反應(yīng)，如能根據(jù)以上性質(zhì)，確定出黃酮與溴的反應(yīng)系數(shù)，即可以將此方法運(yùn)

8、用于黃酮測(cè)定的定量分析中。紫外分光光度法和溴量法測(cè)得的值有一些偏差，但偏差不大，這主要是由于紫外分光度法適宜于微量的測(cè)定，需要稀釋后測(cè)，溴量法適宜于較大劑量的測(cè)定，不需要稀釋，；該方法操作簡(jiǎn)單，在一般實(shí)驗(yàn)條件下即可操作，不需要依靠大型儀器，適宜于大濃度黃酮的測(cè)定。因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，需考慮測(cè)定黃酮含量進(jìn)而選擇合適的分析方法。2、實(shí)驗(yàn)流程新鮮銀杏葉洗凈、陰干至恒重、粉碎過篩，準(zhǔn)確稱取10g處理好的銀杏葉于250mL圓底燒瓶中，加入50mL工業(yè)酒精，在恒溫水浴鍋中，60下，回流90min，傾倒出濾液，；再加入50mL工業(yè)酒精，重復(fù)上述步驟三次，合并四次的提取液，在回流提取裝置上濃縮至200mL備用。

9、取上述濃縮后的提取液于分液漏斗中，加入等量的石油醚，震蕩5min后，靜置一段時(shí)間后棄去上層石油醚相，重復(fù)上述步奏三次后，醚相無色，則提取液中的大部分脂溶性雜質(zhì)（如葉黃素、葉綠素）得以去除。HPD-100大孔吸附樹脂的預(yù)處理。稱取處理后的樹脂以濕法裝柱，柱高15cm，將經(jīng)過石油醚處理后的銀杏葉提取液以3mL/min的流速通過樹脂柱，使樹脂柱對(duì)提取液中的黃酮進(jìn)行吸附，樹脂靜態(tài)吸附時(shí)間應(yīng)該不低于150min。后以蒸餾水洗柱使附著在樹脂柱內(nèi)的水溶性雜質(zhì)得以去除；然后用60%的工業(yè)酒精溶液對(duì)樹脂柱進(jìn)行洗脫，解吸液為體積分率為50%的工業(yè)酒精50mL，接收洗脫液。將經(jīng)過樹脂純化后的含銀杏黃酮的溶液進(jìn)行蒸餾

10、、濃縮，提取液中黃酮含量為503.8g/mL，總收率為75.57%。濃縮液冷卻至室溫后放置在通風(fēng)櫥中讓濃縮液中剩余的溶液揮發(fā)后得到銀杏黃酮的提取物，進(jìn)行研磨，得到粉末狀銀杏黃酮。四、分析驗(yàn)證1、 產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的表征紅外光譜法在3415cm-1處有一寬而強(qiáng)的吸收峰，這是化學(xué)鍵OH伸縮振動(dòng)峰，在3003cm-1處有一弱的震動(dòng)峰，是由化學(xué)鍵CH反對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起的，在1600600cm-1處，吸收峰比較密集，且具有各自專屬性指紋特征；對(duì)比分離純化得到的黃酮產(chǎn)物，與標(biāo)準(zhǔn)品圖譜基本一致，但吸收峰數(shù)目增多且有些峰頂端分裂為2個(gè)小峰，說明純化產(chǎn)物中還存在一些雜質(zhì)，同時(shí)分離純化過程中分離方法對(duì)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)有一定的影響。紫外吸收光譜法在350nm左右處出現(xiàn)特征吸收峰，與黃酮標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸收?qǐng)D譜對(duì)比，最大吸收峰峰型相似且位置相同，說明分離純化后得到銀杏黃酮產(chǎn)物2、產(chǎn)物純度的表征采用高效液相色譜法檢測(cè)樹脂純化后樣品中黃酮的含量，其中色譜條件為：固定相：C18(250X4.6mrn，5pl)，流動(dòng)相：甲醇-0.4%磷酸溶液（55：45），流速：lml/min，柱溫：室溫(25)