擬Smac作用下膀胱癌T24 細胞增殖及凋亡的研究

1、擬Smac作用下膀胱癌T24 細胞增殖及凋亡的研究引言Smac/DIABLO 蛋白線粒體促凋亡蛋白自被發(fā)現(xiàn)以來，經(jīng)過幾年的研究已經(jīng)成為細胞凋亡研究中的一個熱點。近年來，國內(nèi)外很多學者將其應(yīng)用于泌尿系統(tǒng)腫瘤研究和治療，并認為Smac/DIABLO及由它衍生而來的小分子多肽及其類似物將為將來泌尿系統(tǒng)腫瘤的治療開拓一個新領(lǐng)域1。納米技術(shù)作為近年來出現(xiàn)的高技術(shù)新興科學，由于其表現(xiàn)出現(xiàn)的各種特性，有利于醫(yī)學及其各個分支的研究，特別是對腫瘤的早期診斷和治療有著顯著的意義。 其他常用生化試劑購自美國Sigma 公司。2.2 細胞培養(yǎng)與實驗分組實驗2.3 MTT 檢測細胞增殖參照 MTT 試劑盒使用說明。2.

2、4 Hoechst33258 檢測細胞凋亡將各實驗組2.5 實時熒光定量PCRRealtime RT-PCR檢測2.6 蛋白免疫印跡Western-Blot檢測2.7 統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)均以x plusmn; s表示，采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件處理，不同處理組間差異采用ANOVA或 Dunnett T-test，P0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。3. 結(jié)果3.1 SmacN7-O-CMC-MNPS 結(jié)合磁場能顯著抑制膀胱癌T24 細胞增殖及誘導(dǎo)凋亡和對照組相比，SmacN7-O-CMC-MNPS轉(zhuǎn)染膀胱癌T24 細胞后和SmacN7-O-CMC-MNPS加磁場組均不同程度地出現(xiàn)腫瘤細胞生長抑制

3、和凋亡；而SmacN7-O-CMC-MNPS 磁性納米顆粒外加磁場對T24 細胞的生長抑制作用和誘導(dǎo)凋亡作用更明顯。3.2 SmacN7-O-CMC-MNPS結(jié)合磁場對膀胱癌T24 細胞凋亡相關(guān)基因的mRNA及蛋白表達的影響在外磁場條件下，SmacN7-O-CMC-MNPS 轉(zhuǎn)染膀胱癌T24 細胞24h、48h、72h 后采用Realtime RT-PCR 及Western blot 檢測，結(jié)果可見Bcl-2 的mRNA 和蛋白的表達隨著作用時間的延長而逐漸降低。相反，Bax 的表達量那么逐漸升高，且此效應(yīng)比不加磁場的SmacN7-O-CMC-MNPS 轉(zhuǎn)染膀胱癌T24 細胞的作用更明顯，這說

4、明外磁場條件下SmacN7-O-CMC-MNPS 磁性納米顆粒能透過膀胱癌T24 細胞細胞膜，通過干擾凋亡信號傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)細胞的凋亡。4. 討論Smac/DIABLO 在胞漿中合成最初的前體蛋白含239 個氨基酸，分子量為27KD，SmacmRNA 全長1.5Kb。全長的Smac/DIABLO 蛋白沒有任何活性，必須在線粒體內(nèi)進展信號肽的切除后才能獲得促凋亡生物活性。Smac/DIABLO 參與細胞凋亡的死亡受體通路和線粒體通路的下游反響，通過競爭性地結(jié)合凋亡抑制蛋白IAPs 解除對caspase 的阻遏而促進凋亡的發(fā)生。Smac/DIABLO 蛋白衍生的含AVPI 四肽構(gòu)造的小分子多肽也具有

5、重要的抗腫瘤效果。研究說明，Smac/DIABLO 小肽與載體蛋白結(jié)合并轉(zhuǎn)染細胞后可以使體內(nèi)和體外化療藥物誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡效果明顯增加。Smac/DIABLO 蛋白通過干擾凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進腫瘤細胞凋亡，抑制其過度增殖。多肽合成技術(shù)的打破性進步，使多肽類藥物顯示出優(yōu)于傳統(tǒng)藥物的治療效果，但由于其具有難以透過生物膜屏障且不穩(wěn)定、易降解變性等特點限制了它的臨床應(yīng)用。假設(shè)將靶向藥物進展適當修飾就可能起到保護藥物，進步藥物的穩(wěn)定性，促進藥物的吸收利用，進而產(chǎn)生良好的生物學效果。磁性納米顆粒可以作為多肽、激素、單克隆抗體、基因等物質(zhì)的載體，也可以攜帶藥物；同時它具有超順磁特性，即在磁場中有較強的磁

6、性，沒有磁場時磁性很快會消失，從而不會被永久磁化；而且納米級Fe3O4 可以排出體外，在外加磁場的作用下可以使得其作為載體復(fù)合物所攜帶的藥物作定向挪動，從而實現(xiàn)靶向治療。Smac 是一種新型的線粒體促凋亡蛋白，其N 端的AVPI 四肽發(fā)揮著重要的促凋亡作用。本實驗通過合成擬Smac 多肽羧甲基殼聚糖磁性納米復(fù)合物，在外加磁場下作用于膀胱癌T24 細胞，實驗數(shù)據(jù)顯示，外加磁場的誘導(dǎo)下SmacN7-O-CMC-MNPS 磁性納米顆粒能發(fā)揮擬Smac 合成肽的抑制腫瘤細胞增殖及促凋亡作用，且外加磁場作用更為明顯。而且，SmacN7-O-CMC-MNPS 磁性納米顆粒是通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因Bcl-2，Bax 來影響腫瘤細胞的活性。綜上，本實驗首次將人工合成促凋亡多肽制成磁性納米顆粒SmacN7-O-CMC-MNPS 在外加磁場下作用于膀胱癌細胞，顯著抑