(SOP)時間分辨熒光免疫分析實驗操作指南

1、時間分辨熒光免疫分析實驗操作指南以及注意事項第一節(jié)時間分辨反應(yīng)過程圖TRFIA的操作要點優(yōu)質(zhì)的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證TRFIA檢測結(jié)果準確可靠的必要條件。下面列出TRFIA各個操作步驟的注意要點，嚴格遵照規(guī)定操作.1、樣本的采取和保存TRFIA測定的樣本一般為血清。不能使用含抗凝劑EDTAF口檸檬酸的樣本，因為二者可以螯合筠，使測定值降低。血清樣本可按常規(guī)方法采集，溶血和脂血樣本可能會影響測值。樣品在2C-8c可以保存3-5天,如果需要長期保存，請20c保存，避免反復(fù)凍融。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，宜輕緩充分混勻，避免氣泡，可上下顛倒混和。不要把樣本保存在室溫，室溫

2、放置48小時可能會導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定。2、試劑的準備整個實驗過程應(yīng)盡量在干凈無塵的環(huán)境下進行實驗前應(yīng)檢查試劑盒的出廠日期以確定試劑盒是否過期，一般自產(chǎn)品檢驗合格出廠日期起有效期為一年。按試劑盒說明書的要求準備實驗中需用的試劑。TRFIA中用的去離子水，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的去離子水。從冰箱中取出的試驗用試劑應(yīng)待其溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應(yīng)及時放回冰箱保存。試劑盒中的標(biāo)準品或銪標(biāo)試劑若是凍干的狀態(tài)，第一次開盒做實驗在加去離子水溶解標(biāo)準品或銪標(biāo)后，請不要立刻開始使用，靜置10分鐘左右待其溶解完全后再開始。板條若未能一次用完，剩余板條用塑料袋（內(nèi)有干燥劑）封口后密

3、封保存。TRFIA受反應(yīng)溫度的不恒定、操作誤差以及鉆標(biāo)記物的穩(wěn)定性等因素的影響，不同日期的熒光值會有所波動，因此在定量測定中，每批測試均須用一系列不同濃度的參考標(biāo)準品在相同的條件下制作標(biāo)準曲線。3、加樣在TRFIA中一般有3次加樣步驟，即加樣本，加銪標(biāo)記物，加增強液。加樣時應(yīng)將所加物加在微孔板的底部，避免加在孔壁上部，不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。加樣本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。加不同的樣本應(yīng)更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染。加銪標(biāo)記和增強液時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成。連續(xù)加樣器使用時要連續(xù)流暢，并不是加樣越慢越好！加樣時檢測吸嘴是否堵塞，加量是否足夠，注意吸頭之間是有差異的。

4、加樣品時把樣品按12個一排排好，做時每加樣一個，就把它前移一排，這樣不容易出錯。注意按操作步驟計算試劑的量是否充足，特別是使用全自動儀器時！使用干凈的一次性容器配制銪標(biāo)記物。銪標(biāo)記物的污染是造成實驗本底增高的首要原因。注意銪標(biāo)記物的瓶蓋不要與標(biāo)準品瓶蓋混用；所有接觸過銪標(biāo)記物的用品使用完畢應(yīng)該丟棄，不能重復(fù)使用。注意銪標(biāo)記物原液和工作不要污染實驗臺面、加樣槍及試劑盒中的其他組份。4、孵育在TRFIA中一般有一次或兩次抗原抗體反應(yīng)，即加樣本和銪標(biāo)記物后。抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為孵育，或者溫育。目前TRFIA常用模式在微孔板中進行，屬固相免疫測定，抗原、抗體的結(jié)合

5、只在周相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的樣本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗體結(jié)合的機會，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需經(jīng)擴散才能達到反應(yīng)的終點。在其后加入的鉆標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么TRFIA反應(yīng)總是需要一定時間的孵育。孵育在室溫進行即可。室溫一般指20-25Co室內(nèi)溫度白高低會影響TRFIA的熒光值，升高，抗原抗體反應(yīng)加速，熒光值提高。反之，則降低。全自動儀器，孵育過程在一個恒溫（25）的孵育器內(nèi)完成，熒光值比較恒定。如果使用半自動儀器，孵育過程需要加蓋封片，防止污染和液體的揮發(fā)。TRFIA房孵育過

6、程一般在振蕩器上完成，注意調(diào)節(jié)振蕩的幅度和頻率。振蕩的幅度太大、頻率太高，微孔板內(nèi)液體可能溢出，影響實驗結(jié)果；振蕩的幅度太小、頻率太低，抗原抗體反應(yīng)不完全，也可能影響實驗的結(jié)果。振蕩器上的微孔反應(yīng)板不宜疊加堆放。疊加可能造成反應(yīng)板的灑落，同時可能造成反應(yīng)的不均勻。孵育的溫度和時間應(yīng)嚴格遵照說明書規(guī)定。不同的檢測項目，待測物質(zhì)的性質(zhì)不同，反應(yīng)的時間是有差別的。5、洗滌洗滌在TRFIA不是一個反應(yīng)步驟，卻也決定著實驗的成敗。TRFIA就是靠洗滌來達到分離游離的和結(jié)合的銪標(biāo)記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。在TR

7、FIA操作中，洗滌是最比較的關(guān)鍵技術(shù)，操作者應(yīng)嚴格按要求進行。TRFIA的洗滌方式一般使用自動洗板機，不需手工操作。洗板機在每天使用時應(yīng)進行校正注液量和殘留量，注意管道是否通暢。洗滌時，確認每孔中的洗滌液都注滿微孔，洗滌后，需將板倒扣在無塵吸水紙上拍干，拍干完畢，將反應(yīng)板對光檢查，孔底內(nèi)外側(cè)均必須無殘留液體。注意微孔反應(yīng)板的底部不要弄臟或劃傷，不要用手摸微孔反應(yīng)板的底部。6、加增強液TRFIA技術(shù)特點之一就是抗原抗體反應(yīng)完畢，加增強液，使得熒光信號增強100萬倍，檢測靈敏度大大提高。加增強液時，最好能每次吸取增強液都更換槍頭，如果不更換槍頭，加增強液時應(yīng)懸空加入，千萬不要讓吸頭碰到小孔邊緣或其

8、中試劑而造成增強液污染。增強液的體積數(shù)應(yīng)嚴格按說明書的要求；加完后增強液不能灑出；一旦灑出，此次實驗無效，需要重做。第二節(jié)時間分辨試劑盒的組成包括：包被反應(yīng)板：一塊，96孔。銪標(biāo)記抗抗體：一瓶，凍干品，用時每瓶以1ml去離子水溶解緩沖液參考標(biāo)準品：共六瓶。增強液：一瓶，50ml。濃縮洗液25:一瓶，50ml,使用前用去離子水作1:25稀釋。分析緩沖液：一瓶，50ml。說明書：一份。第三節(jié)時間分辨操作基本步驟Eu3+（1）雙抗體夾心法（檢測抗原）：一抗包被、封閉一加入檢測樣品一加入標(biāo)記的二抗一加入增強液一檢測JrisiAFP lii sample k + : Solid pbasc： anii-

9、AFP例如：TRFIA法檢測甲胎蛋白（AFP）實驗方法1.試劑的準備1ml1)甲胎蛋白參考標(biāo)準品：使用前一小時將每瓶甲胎蛋白參考標(biāo)準品用去離子水溶解。2)洗滌液：將50ml濃縮洗液和1200ml去離子水混合，作為工作洗滌液。3) 銪標(biāo)抗體工作液：使用前一小時將每瓶銪標(biāo)記抗甲胎蛋白抗體用1ml去離子水溶解，用分析緩沖液以1:75倍稀釋作為銪標(biāo)抗體工作液。2 .將所需數(shù)量的包被反應(yīng)條置室溫平衡。3 .每孔加25l甲胎蛋白參考標(biāo)準品或樣品。a、 選一支最接近25l的加樣器，因為參考標(biāo)準品是實驗最關(guān)鍵的第一步，所以加樣量要求非常準確。b、 在吸參考標(biāo)準品時槍要在液體內(nèi)吹打4次，使槍頭內(nèi)的表面張力平衡，

10、從而達到吸樣時進一步減少誤差。c、將樣品加入到反應(yīng)孔中要注意槍要垂直輕輕靠在孔壁上打入樣品，要保持一個樣品一只槍頭，這樣可以避免加樣污染和孔內(nèi)包被物不受加樣影響。4 .加200l分析緩沖液，振動孵育1小時。a、 剪一張與加樣條大小相似的封口膜平穩(wěn)封上加板條，寫上標(biāo)記。b、 將樣品板放入震蕩器時注意，減速、平穩(wěn)、輕巧、放入震蕩器中。5 .用洗滌液沖洗4次。a、洗板時要注意板一定要與洗板機的樣品架吻合6 .每孔加鉆標(biāo)抗體工作液2001,振動孵育1小時。a、筠標(biāo)是是實驗最關(guān)鍵的第二個步驟，所以配箱標(biāo)時一定要保證，比例準確、充分混勻、加樣量準確。7 .用洗滌液沖洗6次。a、洗板時要注意板一定要與洗板機

11、的樣品架吻合8 .每孔加增強液2001,振蕩孵育5分鐘a、增強液是實驗最關(guān)鍵的第三個步驟，雖然增強液是一個不要做任何處理就可以直接使用，但它是一個最形容污染的液體，所以加增強液時一定要注意，加增強液槍頭不能碰樣品孔、吸增強液手法要輕柔避免液體反壓力過大回流到加樣器內(nèi)。9 .測定。夾心法，濃度與熒光值成正比。雙抗體夾心法標(biāo)準曲線圖1（LOGLOGB擬合方式）（2）競爭法（檢測抗體）：例如：TRFIA法檢測總?cè)饧谞钕僭彼幔═T3）實驗方法抗原包被、封閉-加入一抗/檢測樣品-加入Eu3而記的二抗f加入增強液檢測1. 試劑的準備1） 總?cè)饧谞钕僭彼釁⒖紭?biāo)準品：使用前一小時將每瓶總?cè)饧谞钕僭?/p>

12、酸參考標(biāo)準品用1ml去離子水溶解。2）洗滌液：將50ml濃縮洗液和1200ml去離子水混合，作為工作洗滌液。3） 銪標(biāo)抗體工作液：使用前一小時將每瓶銪標(biāo)記抗總?cè)饧谞钕僭彼峥贵w用1ml去離子水溶解，用分析緩沖液以1:50倍稀釋作為銪標(biāo)抗體工作液。2. 將所需數(shù)量的包被反應(yīng)條置室溫平衡。3 .吸取50屋參考標(biāo)準品或待測樣品，按順序加入微孔反應(yīng)條小孔中，然后各加100屋箱標(biāo)記三碘甲狀腺原氨酸工作液和100屋抗三碘甲狀腺原氨酸抗體工作液。a、選一支最接近501和1001的加樣器，因為參考標(biāo)準品是實驗最關(guān)鍵的第一步，所以加樣量要求非常準確。b、在吸參考標(biāo)準品時槍要在液體內(nèi)吹打4次，使槍頭內(nèi)的表面張力平衡，從而達到吸樣時進一步減少誤差。c、將樣品加入到反應(yīng)孔中要注意槍要垂直輕輕靠在孔壁上打入樣品，要保持一個樣品一只槍頭，這樣可以避免加樣污染和孔內(nèi)包被物不受加樣影響。4 .室溫振動孵育1.5小時a、剪一張與加樣條大小相似的封口膜平穩(wěn)封上加板條，寫上標(biāo)記。b、將樣品板放入震蕩器時注意，減速、平穩(wěn)、輕巧、放入震蕩器中5用洗滌液沖洗6次，拍干。a、洗板時要注意板一定要與洗板機的樣品架吻合。6 .每孔加增強液200仙1,振蕩孵育5分鐘。a、增強液是實驗最關(guān)鍵的第二步，雖然增強液是一個不要做任何處理就可以直接使用，但它是一個最形容污染的液體，所以加增強液時一定要