微生物工程及設(shè)備復(fù)習(xí)資料

1、微生物工程復(fù)習(xí)提綱一、微生物工程概論微生物產(chǎn)品的四大類型：微生物菌體細胞、微生物細胞的代謝產(chǎn)物（初生和次生代謝）、通過微生物細胞轉(zhuǎn)化的類型（藥物、激素）、微生物分泌的蛋白和酶類。微生物工程的發(fā)展簡史1）傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵技術(shù)天然發(fā)酵2）第一代微生物發(fā)酵技術(shù)純培養(yǎng)技術(shù)的建立：1.1680年列文虎克發(fā)明顯微鏡，第一個通過顯微鏡觀察到用肉眼看不見的微生物，包括細菌、酵母等。2.1857年法國人巴斯德發(fā)現(xiàn)并證明了酒精發(fā)酵是由活酵母引起的，各種不同的發(fā)酵產(chǎn)物是由不同的微生物產(chǎn)生的。3.1897年德國的畢希納進一步證明酶對發(fā)酵的作用，為微生物工程奠定了牢固的基礎(chǔ)。4.十九世紀初德國人科赫首先發(fā)明固體培養(yǎng)基，

2、得到了細菌的純培養(yǎng)物，由此建立了細菌的純培養(yǎng)技術(shù)。3）近代微生物發(fā)酵技術(shù)深層培養(yǎng)技術(shù) 4）第三代微生物發(fā)酵技術(shù)微生物工程二、微生物的代謝調(diào)節(jié)和代謝工程1. 代謝工程基本思路：根據(jù)已有的遺傳和生化知識，找出限速步驟，進行遺傳操作 2.代謝工程的設(shè)計：改變代謝途徑，擴展代謝途徑，轉(zhuǎn)移或構(gòu)建新的代謝途徑。三、菌種的來源與選育1.微生物工程的工業(yè)生產(chǎn)水平的決定要素：生產(chǎn)菌種的性能，發(fā)酵及提純工藝條件（發(fā)酵工藝的優(yōu)化和提取工藝的優(yōu)化），生產(chǎn)設(shè)備。其中第一步優(yōu)良的菌種是最重要的。2.分離純化、篩選菌種的一般步驟：調(diào)查研究（資料查閱） 試驗方案設(shè)計 標本采集 標本的預(yù)處理 富集培養(yǎng) 菌種初篩 菌種復(fù)篩 性能

3、鑒定 菌種保藏3.標本預(yù)處理常用的方法：物理方法：加熱、膜過濾、離心等?；瘜W(xué)方法：加碳酸鈣提高pH值等。誘餌法：將固體基質(zhì)加到待檢的土壤或水中，待其菌落長成后再鋪平板。預(yù)處理的目的：可大大提高菌種分離的效率。富集培養(yǎng)：指給混合菌群提供一些有利于所需菌株生長或不利于其他菌型生長的條件，從而增加混合菌群中所需菌株的數(shù)量，而得以快速分離純化的目的。四、優(yōu)良菌種的選育1.優(yōu)良菌種選育的方法：自然選育、誘變選育、抗噬菌體菌種的選育、雜交育種、原生質(zhì)體融合技術(shù)、基因工程技術(shù)。2名詞解釋：自然選育：不經(jīng)人工處理，利用微生物的自然突變進行菌種選育的過程。誘變育種：利用各種被稱為誘變劑的物理因素和化學(xué)試劑處理微

4、生物細胞，提高基因突變變頻率，再通過適當?shù)暮Y選方法獲得所需要的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌種的育種方法。雜交育種：將不同菌株的遺傳物質(zhì)進行交換、重組，使不同菌株的優(yōu)良性狀集中在重組體中，得到具有新性狀的菌株。原生質(zhì)體融合技術(shù)：將遺傳性狀不同的兩種菌(包括種間、種內(nèi)及屬間)融合為一個新細胞的技術(shù)。即實現(xiàn)遺傳重組。準性生殖：3常用誘變劑：物理誘變劑、化學(xué)誘變劑（堿基類似物，與堿基反應(yīng)的物質(zhì)、在DNA分子中插入或缺失一個或幾個堿基）、生物誘變劑（噬菌體，轉(zhuǎn)座子）。4.誘變育種的基本過程：選擇合適的出發(fā)菌株 制備待處理的菌懸液 誘變處理 篩選 保藏和擴大培養(yǎng)P53.(選擇)5.（大題）誘變育種的基本方法：1）出發(fā)菌株選

5、擇一是考慮出發(fā)菌株是否具有特定生產(chǎn)性狀的能力或潛力，即菌株是否具有產(chǎn)生特定代謝產(chǎn)物的催化酶系的基因。菌株來源是從自然界中分離得到的野生型菌株；通過生產(chǎn)選育，即由自發(fā)突變經(jīng)篩選得到的高產(chǎn)菌株；已經(jīng)誘變過的菌株。 其次是出發(fā)菌株最好已具備一些有利的性狀，如生長速度快、營養(yǎng)要求低和產(chǎn)孢子早而多的菌株。2）制備菌懸液：待處理的菌懸液應(yīng)考慮微生物的生理狀態(tài)、懸液的均一性和環(huán)境條件。一般要求菌體處于對數(shù)生長期，并采取一定的措施促使細胞處于同步生長。懸液的均一性可保證誘變劑與每個細胞機會均等并充分地接觸，避免出現(xiàn)不純的菌落，給后續(xù)的篩選工作造成困難。 菌懸液的細胞濃度一般控制為：真菌孢子或酵母細胞10610

6、7個/ml，放線菌或細菌108個/ml。菌懸液一般用生理鹽水（0.85%NaCl）稀釋。3）誘變處理：誘變劑劑量選擇 ：在誘變處理前，一般應(yīng)預(yù)先做誘變劑用量對菌體死亡數(shù)量的致死曲線，選擇合適的處理劑量。不同微生物，使用的劑量不同；誘變率隨誘變劑劑量的增加而提高。但達到一定劑量后，再加大劑量反而會使突變率下降。誘變劑使用：單一誘變劑處理；復(fù)合誘變劑處理 6（大題）原生體的融合技術(shù)一般步驟：選擇親株、原生質(zhì)體的制備、原生質(zhì)體的融合、原生質(zhì)體再生和融合子選擇等步驟。（常用的試劑）方法：1）選擇親株：選擇遺傳性狀穩(wěn)定且具有優(yōu)勢互補的兩個親株。為了能明確檢測到融合子，參與融合的親株一般都需要帶有可以識別

7、的遺傳標記，如營養(yǎng)缺陷型或抗藥性等 2）原生質(zhì)體制備：去除細胞壁是制備原生質(zhì)體的關(guān)鍵。培養(yǎng)基中添加甘氨酸，可以使菌體較容易被酶解。在菌體生長階段添加蔗糖也能提高細胞壁對溶菌酶的敏感性。在菌體生長對數(shù)期加入適量青霉素，就能使細胞對溶菌酶更敏感。菌齡：對數(shù)生長中期細胞的細胞壁中肽聚糖含量很低，對溶菌酶敏感。一般是將原生質(zhì)體放在高滲的環(huán)境中以維持它的穩(wěn)定性。3）原生質(zhì)體融合：聚乙二醇（PEG）能有效地促進原生質(zhì)體融合。一般PEG的使用濃度范圍在25-40%。采用電融合儀：在高頻電場下，用直流電穿孔來進行融合。4）原生質(zhì)體再生：使原生質(zhì)體重新長出細胞壁，恢復(fù)完整的細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。不同微生物的原生質(zhì)體的最

8、適再生條件不同，最重要的一個共同點是都需要高滲透壓。5）融合重組子的篩選：通過兩親株遺傳標記的互補而得以識別 。如兩親株的遺傳標記分別為營養(yǎng)缺陷型A+B-和A-B+，融合重組子應(yīng)是A+B+或A-B-。7.基因工程技術(shù)的主要步驟基因工程技術(shù)：將一個含有目的基因DNA片段經(jīng)體外操作與載體連接，并轉(zhuǎn)入一受體細胞（通常多為細菌），使之擴增、表達的操作過程。一般過程方法：含目的基因的DNA片段的準備；載體；含目的基因的DNA片段與載體相連接；將重組分子送入受體細胞，并于其中復(fù)制、擴增；篩選出帶有重組DNA的轉(zhuǎn)化細胞；鑒定外源基因的表達產(chǎn)物五、菌種的保藏的方法（原理：P78 選擇題）1斜面低溫保藏法：將菌

9、株接種于合適斜面培養(yǎng)基上，而后置于4冰箱保藏，每隔一定時間進行移接培養(yǎng)后再將新斜面繼續(xù)保藏。這種保藏方法簡單，存活率高，易于推廣，經(jīng)常使用的菌種可采用這種方法。其缺點是菌種仍有一定強度的代謝活動條件，保存時間不長，而且傳代多，因此菌種客易產(chǎn)生變異。 2、液體石蠟保藏法：將生長好的新鮮斜面在無菌條件下倒入已滅菌的液體石蠟，油層要高出斜面上端1cm，使之與空氣隔絕，然后垂直放于室溫或冰箱內(nèi)保藏即可。這種方法也比較簡便，且保藏時間一般可長達l年以上。適于保存部分霉菌、酵母菌、放線菌，但對細菌效果較差，對某些能同化烴類的微生物則不適用。3、砂土管保藏法：將孢子懸浮液轉(zhuǎn)移至滅過菌的砂土管中，于真空干燥器

10、內(nèi)用真空泵抽干，再轉(zhuǎn)至有干燥劑的容器中，密封低溫保藏。該法是用人工方法模擬自然環(huán)境使菌種得以棲息。適用于細菌的芽孢、霉菌和放線菌孢子的保藏，不適于對干燥敏感的無芽孢的細菌和酵母菌。主要包括砂土管制備和真空抽干兩步。4、真空冷凍干燥保藏法：在低溫下迅速將細胞凍結(jié)以保持細胞結(jié)構(gòu)的完整，然后在真空下使水分升華。這樣菌種的生長和代謝活動處于極低水平，不易發(fā)生變異和死亡，可長期保存，一般為510年。微生物在此條件下易死亡，所以需加入一些物質(zhì)作保護劑，一般常用的是脫脂牛奶、血清等。該法存活率高，變異率低，并能廣泛適用于細菌（有芽孢和無芽孢的）、酵母、霉菌孢子、放線菌孢子和病毒等，因此是目前廣泛采用的好方法

11、。其缺點是手續(xù)麻煩，操作復(fù)雜，要求嚴格，并需有一定設(shè)備條件。 5、液氮超低溫保藏法：適用范圍最廣的超低溫保藏法。其原理是液氮的溫度可達-196 ，遠遠低于其新陳代謝作用停止的溫度（-130 ），此時，菌種的代謝活動停止，化學(xué)作用亦隨之消失。注意點：安瓿管是否完好、冷凍的速度、液氮的添加6、懸液保藏法：即寡營養(yǎng)保藏，將微生物懸浮在不含養(yǎng)分的溶液中，如蒸餾水等。保藏的關(guān)鍵：試管密封好，以防水分蒸發(fā)。7、低溫保藏法：多數(shù)微生物可在-20 以下的低溫中保藏。注意：融化后的菌種不能再用低溫保存，要重新移種后再冷藏。保藏方法斜面冰箱保藏法 4； 3-6個月沙土管保藏法 產(chǎn)孢子或芽孢微生物，1年菌絲速凍法

12、甘油或二甲基亞砜作為保護劑，-20 石蠟油封存法 1年左右真空冷凍干燥保藏法 任何微生物；一般5年以上液氮超低溫保藏法 -196；保護劑；保存期長六、培養(yǎng)基1.培養(yǎng)基的類型：根據(jù)來源不同，分為：天然培養(yǎng)基：采用化學(xué)成分不清楚或化學(xué)成分不恒定的各種動植物或微生物的浸出物、水解液等物質(zhì)制成的。合成培養(yǎng)基：用化學(xué)成分和數(shù)量完全了解的物質(zhì)配制而成，成分精確，重復(fù)性強，可減少不能控制因素。半合成培養(yǎng)基：既含有天然成分又含有純化學(xué)試劑的培養(yǎng)基。根據(jù)物理性狀不同，分為：液體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基，半固體培養(yǎng)基根據(jù)主要成分和使用目的，分為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基：培養(yǎng)基中加有能與某一菌的無色代謝物發(fā)生顯色

13、反應(yīng)的指示劑。選擇培養(yǎng)基：根據(jù)某生物的特殊營養(yǎng)要求或其對某化學(xué)、物理因素的抗性而設(shè)計的培養(yǎng)基。根據(jù)生產(chǎn)工藝的要求，分為：孢子培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基：滿足菌種生長用的。營養(yǎng)豐富，氮源、維生素比例較高。發(fā)酵培養(yǎng)基：滿足大生產(chǎn)中大量菌體生長和繁殖以及代謝產(chǎn)物積累的營養(yǎng)物質(zhì)。2微生物培養(yǎng)基的成分（常用的種類，作用，類型）：碳源，氮源，無機鹽，微量元素，生長因子，促進劑和抑制劑，前體和水。3常用碳源：糖類、脂類、有機酸、低碳醇。糖類：葡萄糖（純葡萄糖、水解淀粉），乳糖（純?nèi)樘恰⑷榍宸郏?，淀粉（大麥、花生粉、燕麥粉、黑麥粉、大豆粉等），糖蜜（甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、粗紅糖、精白糖等）脂類如

14、各種植物油和動物油也能被許多微生物用作碳源和能源。有機酸：如乳酸，醋酸，檸檬酸，延胡索酸等3.氮源：分為無機氮源和有機氮源1）無機氮源：種類：銨鹽、硝酸鹽和氨水。特點：微生物對它們的吸收快，所以也稱之謂迅速利用的氮源。但無機氮源的迅速利用常會引起pH的變化。選擇合適的無機氮源的意義：滿足菌體生長，穩(wěn)定和調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中的pH 2）有機氮源：工業(yè)上常用的有機氮源都是一些廉價的原料，花生餅粉、黃豆餅粉、棉子餅粉、玉米漿、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、魚粉、蠶蛹粉、尿素、廢菌絲體和酒糟。除提供氮源外，有些有機氮源還提供大量的無機鹽及生長因子。如：玉米漿含有可溶性蛋白、生長因子（生物素）、苯乙酸；較多的乳

15、酸硫、磷、微量元素等有機氮源成分復(fù)雜，可以從多個方面對發(fā)酵過程進行影響，而另一方面有機氮源的來源具有不穩(wěn)定性。所以在有機氮源選取時和使用過程中，必須考慮原料的波動對發(fā)酵的影響。使用注意：有機氮源和無機氮源應(yīng)當混合使用；早期：容易利用易同化的氮源無機氮源；中期：菌體的代謝酶系已形成、則利用蛋白質(zhì)。有些產(chǎn)物會受氮源的誘導(dǎo)和阻遏。4.無機鹽：磷酸鹽、硫酸鎂、鉀鹽、微量元素（錳、鐵）等。來源：C、N源，以鹽的形式補充；使用注意點：對于其它渠道有可能帶入的過多的某種無機離子和微量元素在發(fā)酵過程中必須加以考慮；使用時注意鹽的形式（pH的變化）。5,。名詞解釋：前體：某些化合物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接被微

16、生物在生物合成過程結(jié)合到產(chǎn)物分子中去，而其自身的結(jié)構(gòu)并沒有多大變化，但是產(chǎn)物的產(chǎn)量卻因加入而有較大的提高。產(chǎn)物促進劑：那些非細胞生長所必須的營養(yǎng)物，又非前體，但加入后卻能提高產(chǎn)量的添加劑。抑制劑：可以抑制某些代謝途徑的進行，同時刺激另一代謝途徑，以致可以改變微生物的代謝途徑。6.培養(yǎng)基的優(yōu)化培養(yǎng)基設(shè)計與優(yōu)化的大致步驟：1）根據(jù)前人的經(jīng)驗和培養(yǎng)基配制的基本理論，初步確定可能的成分；2）通過單因子實驗確定最為適宜的培養(yǎng)基成分；3）通過多因子實驗確定各成分的最適濃度正交實驗設(shè)計步驟：1）根據(jù)問題的要求和客觀的條件確定因子和水平，列出因子水平表；2）根據(jù)因子和水平數(shù)選用合適的正交表，設(shè)計正交表頭，并安

17、排實驗；3）根據(jù)正交表給出的實驗方案，進行實驗；4）對實驗結(jié)果進行分析，選出較優(yōu)的“試驗”條件以及對結(jié)果有顯著影響的因子。七、發(fā)酵工藝的控制1溫度對發(fā)酵的影響及其控制1）溫度對微生物生長的影響生物體的生命活動可以看作是相互連續(xù)進行酶反應(yīng)的表現(xiàn)，任何化學(xué)反應(yīng)又都和溫度有關(guān)。所以溫度直接影響酶反應(yīng)，從而影響著生物體的生命活動。每種微生物各有其生長發(fā)育所需的溫度。在最適溫度范圍內(nèi)，生長速度隨溫度升高而增加，發(fā)酵溫度升高，生長周期就縮短。不同生長階段的微生物對溫度的反應(yīng)則不同。2）溫度對產(chǎn)物形成的影響許多產(chǎn)物的形成速率對溫度都很敏感。3）溫度影響發(fā)酵液的物理性質(zhì)如溫度可影響氧在發(fā)酵液中的溶解度，影響基

18、質(zhì)的分解速率等。從而間接影響了微生物的生物合成。4）溫度影響生物合成的方向如金色鏈絲菌在低于30 時，合成金霉素的能力強，在高于35 時，合成四環(huán)素的能力非常強，金霉素的合成幾乎停止。2.生物熱（名詞解釋）：生產(chǎn)菌在生長繁殖時產(chǎn)生的大量熱量。培養(yǎng)基中碳水化合物，脂肪，蛋白質(zhì)等物質(zhì)被分解為CO2和NH3時釋放出的大量能量。用途：合成高能化合物，供微生物生命代謝活動，熱能散發(fā)。影響生物熱的因素：生物熱隨菌株，培養(yǎng)基，發(fā)酵時期的不同而不同。還與菌體的呼吸強度有對應(yīng)關(guān)系。3.攪拌熱（名詞解釋）：攪拌器的機械攪拌的動能以摩擦放熱的方式使熱量散發(fā)在發(fā)酵液中。4.蒸發(fā)熱（名詞解釋）：通入發(fā)酵罐的空氣，其溫度

19、和濕度隨季節(jié)及控制條件的不同而有所變化。空氣進入發(fā)酵罐后，就和發(fā)酵液廣泛接觸進行熱交換。同時必然會引起水分的蒸發(fā)；蒸發(fā)所需的熱量即為蒸發(fā)熱。5.發(fā)酵熱（名詞解釋）：名詞解釋：生理酸性物質(zhì)：無機氮源被菌體作為氮源利用后，培養(yǎng)液中就留下了酸性或堿性物質(zhì)，這種經(jīng)微生物生理作用（代謝）后能形成酸性物質(zhì)的無機氮源叫生理酸性物質(zhì)，如硫酸胺；生理堿性物質(zhì)：菌體代謝后能產(chǎn)生堿性物質(zhì)的則此種無機氮源稱為生理堿性物質(zhì)，如硝酸鈉。6.pH對發(fā)酵的影響：（發(fā)酵過程中培養(yǎng)液的pH值是微生物在一定環(huán)境條件下代謝活動的綜合指標，是一項重要的發(fā)酵參數(shù)。 它對菌體的生長和產(chǎn)品的積累有很大的影響。因此，必須掌握發(fā)酵過程中pH的變

20、化規(guī)律，及時監(jiān)測并加以控制，使它處于最佳的狀態(tài)。盡管多數(shù)微生物能在34個pH單位的pH范圍內(nèi)生長，但是在發(fā)酵工藝中，為了達到高生長速率和最佳產(chǎn)物形成，必須使pH在很窄的范圍內(nèi)保持恒定。）pH影響酶的活性。當pH值抑制菌體某些酶的活性時使菌的新陳代謝受阻。pH值影響微生物細胞膜所帶電荷的改變，從而改變細胞膜的透性，影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝物的排泄，因此影響新陳代謝的進行。pH值影響培養(yǎng)基某些成分和中間代謝物的解離，從而影響微生物對這些物質(zhì)的利用。pH不同，往往引起菌體代謝過程不同，使代謝產(chǎn)物的質(zhì)量和比例發(fā)生改變。 7.影響發(fā)酵pH的因素1）發(fā)酵過程中pH的變化：生長階段：此時，微生物調(diào)節(jié)

21、培養(yǎng)基pH的能力驚人，所以培養(yǎng)開始時發(fā)酵液pH的影響是不大的。 生成階段：某些產(chǎn)物本身呈酸性或堿性，使發(fā)酵液pH變化。如有機酸類產(chǎn)生使pH下降，紅霉素、潔霉素、螺旋霉素等抗生素呈堿性，使pH上升。 自溶階段： pH上升，發(fā)酵后期，pH上升。 2）引起pH下降的因素：碳源過量：特別是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。 消泡劑添加過量。生理酸性物質(zhì)的存在3）引起pH上升的因素：氮源過多：無機/有機氮源的代謝起到提高pH的作用。生理堿性物質(zhì)的存在。中間補料，堿性物質(zhì)添加過多。當碳源不足時氮源當碳源利用pH上升，是補料的標志之一。8.臨界溶氧濃度（名詞解釋）：CCr指在好氧發(fā)酵中，滿足微生

22、物呼吸的最低氧濃度。9氣液相間的氧傳遞和傳質(zhì)方程式 穩(wěn)定狀態(tài)下，氧分子從氣體擴散到液體主體的傳遞速率為：10.攝氧率(r)（名詞解釋）：單位時間內(nèi)單位體積的發(fā)酵液所需要的氧量。mmol O2·L-1·h-1 。11. r= QO2 .X（X：細胞濃度）呼吸強度（QO2）：用來描述微生物的耗氧速度，指單位時間內(nèi)單位體積重量的細胞所消耗的氧氣，mmol O2·g菌-1·h-1 12.溶氧濃度控制（溶氧對發(fā)酵的影響，對溶氧調(diào)節(jié)的方法）：1）從供氧方面考慮：從氧傳遞動力學(xué)方程式，可以看出：在供氧方面，主要是設(shè)法提高氧傳遞的推動力（c* - cL)和體積氧傳遞系數(shù)

23、KLa。（1）提高kLa ：kLa 反映了設(shè)備的供氧能力，不但與反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)參數(shù)有關(guān)，還與發(fā)酵液的性質(zhì)有關(guān)（粘度、濃度等）攪拌轉(zhuǎn)速：kLa (Pg/V) ×Vs Pg N2.46。可見，提高N可以有效的提高kLa，從而增加發(fā)酵液中的溶氧濃度。但是，高轉(zhuǎn)速也有不利的方面（能耗 、菌體對剪切力的要求）。Vs-空氣流速：由公式kLa (Pg/V) ×Vs可知，提高Vs即提高通風(fēng)量Q也可以有效的提高kLa。但不能夠無限的增加通風(fēng)量,研究表明，當通風(fēng)量增加到一定的量后，(Pg/V)會隨著Q的增加而下降。也就是說單位體積發(fā)酵液所擁有的攪拌功率會下降，不但不能提高kLa，甚至?xí)斐蒶La

24、值的下降。可見，提高KLa最有效的方法是提高N與Vs，并協(xié)調(diào)兩者之間的關(guān)系，其他方法效果不大，且受限制較多。（2）提高（c* - cL)，即氧傳遞動力：c*，改變c*是沒有太大的余地的。因為，發(fā)酵溫度、濃度等嚴格的受到菌體生長和發(fā)酵工藝的限制。提高罐壓：Pi增加則與之平衡的Ci也會增加，對提高（c* - c)是有一定作用的。利用純氧，可以提高（c* - cL)。缺點：價格較高，易引起爆炸消沫劑：加入消沫劑，分布在氣液界面，增大了傳遞阻力，使KL下降。使用的消沫劑是表面活性物質(zhì)，盡管會引起溶解氧濃度的暫時下降，但最終會改善發(fā)酵液的通氣效率。離子強度：電解質(zhì)溶液中的氣泡比在水中的要小，所以有較大的

25、比表面積。因此同樣條件下，電解質(zhì)溶液的KL值也比水中的大。影響推動力的因素：如溫度、電解質(zhì)溶液等。2）從耗氧方面考慮：攝氧速率：r= QO2 .XX：菌體濃度QO2 ：遺傳因子、菌齡、營養(yǎng)成分與濃度、有害物質(zhì)的積累、培養(yǎng)條件。13.發(fā)酵過程泡沫產(chǎn)生的原因（1）通氣攪拌的強烈程度：通氣大、攪拌強烈可使泡沫增多，因此在發(fā)酵前期由于培養(yǎng)基營養(yǎng)成分消耗少，培養(yǎng)基成分豐富，易起泡。應(yīng)先開小通氣量，再逐步加大。攪拌轉(zhuǎn)速也如此。也可在基礎(chǔ)料中加入消泡劑。（2）培養(yǎng)基配比與原料組成：培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，黏度大，產(chǎn)生泡沫多而持久，前期難開攪拌。（3）菌種、種子質(zhì)量和接種量：菌種質(zhì)量好，生長速度快，可溶性氮源較快被利

26、用，泡沫產(chǎn)生幾率也就少。菌種生長慢的可以加大接種量（4）滅菌質(zhì)量：培養(yǎng)基滅菌質(zhì)量不好，糖氮被破壞，抑制微生物生長，使種子菌絲自溶，產(chǎn)生大量泡沫，加消泡劑也無效。14.泡沫對發(fā)酵的危害1）降低發(fā)酵設(shè)備的利用率 2）增加了菌群的非均一性 3）增加了染菌的機會 4）導(dǎo)致產(chǎn)物的損失 5）消泡劑會給后面的提取工序帶來困難6）泡沫中的代謝氣體不易被帶走，改變了生活環(huán)境，使菌體代謝異常，導(dǎo)致菌體提前自溶15.影響泡沫穩(wěn)定性的因素泡徑大小2）溶液所含助泡物的類型和濃度3）起泡液的粘度4）其它 溫度，pH，表面電荷。16.泡沫的控制方法：1）物理消沫法 2）化學(xué)消沫法3）減少培養(yǎng)基中易起泡的成分4）減少培養(yǎng)基中

27、粘度大的成分5）適當減少通氣量及攪拌轉(zhuǎn)速物理消泡法：原理：靠機械力引起強烈振動或者壓力變化，促使泡沫破裂，或借機械力將排出氣體中的液體加以分離回收。方法：罐內(nèi)消沫法，最簡單的就是在攪拌軸上部安裝消沫漿。罐外消沫法，將泡沫引出罐外，消泡后，液體再返回罐內(nèi)。優(yōu)點：不需要引進外界物質(zhì)、節(jié)省原材料、減少污染機會。 缺點：不能從根本眾消除引起穩(wěn)定泡沫的因素?；瘜W(xué)消泡法：機理：當泡沫的表層存在著由極性的表面活性物質(zhì)形成雙電層時，可以加入另一種具有相反電荷的表面活性劑，以降低泡沫的機械強曲或加入某些具有強極性的物質(zhì)與發(fā)泡劑爭奪液膜上的空間，降低液膜強度，使泡沫破裂。當泡沫的液膜具有較大的表面粘度時，可以加入

28、某些分子內(nèi)聚力較小的物質(zhì)，以降低液膜的表面粘度，使液膜的液體流失，導(dǎo)致泡沫破裂。15.常用消泡劑：天然油脂、聚醚類、高級醇、硅酮類、脂肪酸、亞硫酸、磺酸鹽。其中最多的是天然油脂和聚醚類。天然油脂：常用的有玉米油、米糠油、豆油、棉子油、魚油及豬油等。 聚醚類：在生產(chǎn)上應(yīng)用較多的是聚氧丙烯甘油（GP）和聚氧乙烯氧丙烯甘油(GPE)。 它們以一定比例配置的消泡劑又稱為泡敵。高級醇類：十八醇是較常用的一種，可以單獨或與載體一起使用。據(jù)報導(dǎo)，它與冷榨豬油一起控制青霉素發(fā)酵的泡沫，效果較好。聚二醇具有消沫效果持久的特點，尤其適用于霉菌發(fā)酵。 硅酮類：主要是聚二甲基硅氧烷及其衍生物。適用于微堿的細菌發(fā)酵液。

29、8、 發(fā)酵過程參數(shù)檢測和自動控制*補料的內(nèi)容和策略*發(fā)酵過程中雜菌污染與控制1.發(fā)酵參數(shù)分類1）按參數(shù)性質(zhì)分物理參數(shù)：溫度、攪拌轉(zhuǎn)速、壓力、空氣流量、表觀粘度等化學(xué)參數(shù)：基質(zhì)濃度（包括糖、氮、磷）、pH、產(chǎn)物濃度、核酸量、溶解氧、溶解二氧化碳、排氣O2和CO2濃度等生物參數(shù)：菌絲形態(tài)、菌濃度、菌體比生長速率、呼吸強度、基質(zhì)消耗速率、關(guān)鍵酶活力等2）按檢測手段分直接參數(shù)：能反映過程中菌體的生理代謝狀況的參數(shù)，可通過傳感器等測量儀器直接測量。在線檢測參數(shù)：指不經(jīng)取樣直接從發(fā)酵罐上安裝的儀表上得到的參數(shù)，如溫度、pH、攪拌轉(zhuǎn)速；離線檢測參數(shù)：指取出樣后測定得到的參數(shù)，如殘?zhí)?、菌體濃度。間接參數(shù)：不能

30、直接測量的，需根據(jù)基本參數(shù)通過計算求得的參數(shù)，如攝氧量、體積溶氧系數(shù)等2.溫度（物理參數(shù)）：指發(fā)酵整個過程或不同階段所維持的溫度。 溫度的高低與下列參數(shù)有密切關(guān)系：發(fā)酵中的酶反應(yīng)速度，菌體生長速度，產(chǎn)物合成速度，氧在培養(yǎng)液中的溶解度，傳遞速度溫度傳感器：常用的有熱電阻（鉑電阻和銅電阻）、熱電耦、雙金屬片3.pH（化學(xué)參數(shù)）：發(fā)酵過程中各種產(chǎn)酸，產(chǎn)堿生化反應(yīng)的綜合結(jié)果，與菌體生長和產(chǎn)物合成有重要的關(guān)系。pH的高低與菌體生長和產(chǎn)物合成有著重要的關(guān)系。pH電極實際上是由參比電極與指示電極組成的一個自發(fā)電池。該電池的參比電極的輸出電位恒定，指示電極的輸出電位隨被測體系中氫離子活度而變化。因此整個自發(fā)電

31、池的電動勢就是被測體系中氫離子活度的函數(shù)。復(fù)合電極：將兩支電極都裝在一根玻璃管中，這種電極叫復(fù)合電極，工業(yè)上在線檢測大都使用這種電極。它結(jié)構(gòu)緊湊，便于安裝。4.菌體濃度：菌體濃度的大小和變化速度對生化反應(yīng)有影響，特別是對抗生素等次級代謝產(chǎn)物的發(fā)酵，菌體濃度與培養(yǎng)液的粘度，DO都有關(guān)。細胞濃度的測量：化學(xué)法：如DNA、RNA分析等。物理法：如重量分析、分光光度分析、濁度分析等。新技術(shù)：以電容法為測量原理的在線活細胞濃度測量傳感器。常用流通式濁度計，其原理是使發(fā)酵罐中的發(fā)酵液進入一流通式薄層比色杯，用波長500600nm的光束測量發(fā)酵液的光密度，然后發(fā)酵液再返回發(fā)酵罐中，所測度的OD值與細胞濃度成

32、線性關(guān)系。5名詞解釋：呼吸商RQ：發(fā)酵過程中二 氧化碳生成比速與氧的消耗比速的商。攝氧率OUR：菌體細胞氧的吸收率，就是單位體積培養(yǎng)液在單位時間內(nèi)所消耗的氧量CO2釋放率（CER）：單位體積發(fā)酵液在單位時間內(nèi)產(chǎn)生的CO2量9、 微生物反應(yīng)動力學(xué)1.類型（生長相關(guān)型）：菌體生長、碳源利用和產(chǎn)物形成幾乎都在相同的時間出現(xiàn)高峰菌體生長類型：終產(chǎn)物就是菌體本身，菌體增加與碳源利用平行。如酵母、蘑菇菌絲等。代謝產(chǎn)物類型：產(chǎn)物是碳源的直接氧化產(chǎn)物。產(chǎn)物積累與菌體增長相平行。如酒精、乳酸等。2.類型 （生長部分相關(guān)型）：微生物生長與產(chǎn)物合成是分開的：第一時期：菌體迅速增長，產(chǎn)物形成很少或無第二時期：產(chǎn)物高速

33、形成，生長可能有第二峰；碳源利用出現(xiàn)兩高峰。（部分相關(guān)）其產(chǎn)物不是碳源的直接氧化產(chǎn)物，而是菌體代謝的主流產(chǎn)物，產(chǎn)量較高。分兩類：產(chǎn)物的形成是經(jīng)過連鎖反應(yīng)的過程；如：丙酮丁醇。產(chǎn)物的形成不經(jīng)過中間產(chǎn)物的積累。如：谷氨酸。3. 類型（與生長不相關(guān)型）：一般產(chǎn)物形成是在菌體生長接近或達到最高生長時期（穩(wěn)定期）。產(chǎn)物形成與碳源利用無準量關(guān)系，如：抗生素、維生素等次級代謝產(chǎn)物。產(chǎn)量一般不超過碳源耗量的10。4.產(chǎn)物形成與基質(zhì)消耗關(guān)系分類：產(chǎn)物形成直接與基質(zhì)（碳源)利用有關(guān)，產(chǎn)物形成間接與基質(zhì)（碳源）利用有關(guān)，產(chǎn)物形成與基質(zhì)（碳源）利用無關(guān)。發(fā)酵按照操作方法分：分批發(fā)酵，補料分批發(fā)酵，連續(xù)發(fā)酵。5.分批發(fā)

34、酵（batch fermentation)即分批培養(yǎng)：指一次投料、一次接種、一次收獲的間歇培養(yǎng)方式。即是在一封閉系統(tǒng)內(nèi)含有初始限量基質(zhì)的發(fā)酵方式。在這一過程中，除了氧氣、消泡劑及控制pH的酸或堿外，不再加入任何其它物質(zhì)。 發(fā)酵過程中培養(yǎng)基成分減少，微生物得到繁殖。階段：分延遲期、對數(shù)生長期、減速期、穩(wěn)定期和衰亡期。6補料分批發(fā)酵：半連續(xù)發(fā)酵或半連續(xù)培養(yǎng)，指在分批培養(yǎng)過程中，間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法。7.連續(xù)發(fā)酵（continuous fermentation)即連續(xù)培養(yǎng)：在培養(yǎng)過程中（一般是微生物培養(yǎng)到對數(shù)生長期），一方面連續(xù)地向發(fā)酵罐中加入培養(yǎng)基，另一方面同時以相同的流速從發(fā)酵罐

35、中排出含有產(chǎn)品的發(fā)酵液。使發(fā)酵罐內(nèi)料液 量維持恒定，微生物在近似恒定狀態(tài)（恒定 的基質(zhì)濃度、恒定的產(chǎn)物濃度、恒定的pH、 恒定菌體濃度、恒定的比生長速率）下生長的發(fā)酵方式。8. 當培養(yǎng)基中不存在抑制細胞生長的物質(zhì)時，細胞的比生長速率和限制性基質(zhì)的濃度間的關(guān)系用Monod方程式表示為： （S:限制性基質(zhì)濃度mol/m3；KS:飽和常數(shù)mol/m3）KS：物理意義為當比生長速率為最大比生長速率一半時的限制性營養(yǎng)物質(zhì)濃度，它的大小表示了微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收親和力大小。KS越大，表示微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收親和力越小，反之越大。µm：隨微生物種類和培養(yǎng)的條件不同而不同。一般細菌的µ

36、m大于真菌的µm；。培養(yǎng)溫度升高，µm增大；營養(yǎng)物質(zhì)改變，µm改變；易被微生物利用的營養(yǎng)物質(zhì)，其µm 較大。9.a:營養(yǎng)物質(zhì)濃度很低，即S << KS時，為線性關(guān)系。dX/dt= µX提高 S，可明顯提高µ，一級反應(yīng)。b:適合Monod方程段c: S >> KS 營養(yǎng)物質(zhì)濃度很高。µ=µm。µ與S無關(guān)，零級反應(yīng)。當S時，µ=µm。µm是理論上最大的生產(chǎn)潛力假定整個生長階段無抑制物作用存在，則微生物生長動力學(xué)可用階段函數(shù)表示如下： 0 x0 （0<

37、t<t1) µm x0e µm t (t1<t<t2) µ = x= x0e µm(t2-t1) e µt (t2<t<t3) 0 xm (t3<t<t4) -a xme -a t (t4<t<t5)SC：臨界基質(zhì)濃度，比生長速率µ達到最大比生長速率µm時的最低基質(zhì)濃度。 對于任一營養(yǎng)物質(zhì)：S > SC 為非限制性基質(zhì)， S < SC為限制性基質(zhì)。10. Monod方程與米氏方程的區(qū)別與聯(lián)系：Monod方程是對實驗現(xiàn)象的總結(jié)：是經(jīng)驗方程。米氏方程是根據(jù)酶反應(yīng)動

38、力推導(dǎo)得出：是機理方程Monod方程與米氏方程的相似性：雙倒數(shù)法求解參數(shù)。雙倒數(shù)法：將Monod方程取倒數(shù)可得：以1/S對1/µ作圖，為一直線，斜率為KS/µm，縱軸截距為1/µm。11.維持系數(shù)（名詞解釋）：是微生物菌株的一種特性值，對于特定的菌株、特定的基質(zhì)和特定的環(huán)境因素（如溫度、pH等）是一個常數(shù)，故又稱為維持常數(shù)。12.定義稀釋率D=F/V，單位時間內(nèi)加入的培養(yǎng)基體積占發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)基體積的分率恒定狀態(tài)時dX/dt=0，=D，即在恒定狀態(tài)下，比生長速率等于稀釋率一定范圍內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)的比生長速率可通過稀釋率來控制十、微生物工程下游加工工程按生產(chǎn)過程的順序分為四

39、大框架步驟：發(fā)酵液的預(yù)處理和過濾、提取、精制、成品加工。預(yù)處理的目的和要求目的分離菌體，將發(fā)酵液中的雜質(zhì)除去，改變?yōu)V液性質(zhì)以利于提取和精制后續(xù)各工序順利進行。要求菌體的分離；固體懸浮物的去除；蛋白質(zhì)的去除；重金屬離子的去除；色素、熱原質(zhì)、毒性物質(zhì)等有機雜質(zhì)的去除；改變發(fā)酵液性質(zhì)。預(yù)處理的方法高價無機離子的去除方法鈣離子，可用草酸。草酸溶解度較小，用量大時，可用其可溶性鹽，如草酸鈉。鎂離子，可用三聚磷酸鈉。它和鎂離子形成可溶性絡(luò)合物，用磷酸鹽處理，也能大大降低鈣離子和鎂離子的濃度。此法可用于環(huán)絲氨酸的提取。鐵離子，可加入黃血鹽，使形成普魯士藍沉淀。 可溶性雜蛋白質(zhì)的去除方法等電點沉淀法：等電點狀

40、態(tài)，蛋白質(zhì)溶解度最低加熱處理：蛋白質(zhì)變性，溶解度降低吸附作用:用凝膠吸附蛋白質(zhì)有機溶劑、金屬離子等沉淀蛋白質(zhì)發(fā)酵液的凝聚和絮凝 凝聚：是在中性鹽作用下，由于雙電層排斥電位的降低，而使膠體體系不穩(wěn)定的現(xiàn)象。 絮凝：是指在某些高分子絮凝劑存在下，基于架橋作用，使膠體聚集形成粗大的絮凝團的過程，是一種以物理的集合為主的過程。機理：電解質(zhì)將膠體粒子表面上的電荷中和，減少存在于膠體粒子間的靜電斥力，使范德華力占優(yōu)勢，這樣膠體就會凝聚成較大、較密實的粒子，或在某些高分子絮凝劑存在下，基于架橋作用，使膠粒形成粗大的絮凝團使之更容易過濾。 方法：在稀溶液中加入電解質(zhì)以促進凝聚和絮凝。試劑包括酸、堿、簡單電解質(zhì)

41、和合成的高分子電解質(zhì)。常用的絮凝劑：聚丙烯酰胺、聚乙烯亞胺、聚胺衍生物、氯化鈣、磷酸氫二鈉等。十八、培養(yǎng)基滅菌及滅菌設(shè)備1.濕熱滅菌：用飽和蒸汽進行滅菌的方法。原理是借助于蒸汽釋放的熱能使微生物細胞中的蛋白質(zhì)、酶和核酸分子內(nèi)部的化學(xué)鍵，特別是氫鍵受到破壞，引起不可逆的變性，使微生物死亡。優(yōu)點：蒸汽來源容易，操作費用低，本身無毒；蒸汽有強的穿透力，滅菌易于徹底；蒸汽有很大的潛熱；操作方便，易管理。2.過濾除菌：用過濾的方法阻留微生物，達到除菌的目的。適用于澄清液體和氣體的除菌。3.熱阻：表示微生物對熱的抵抗能力，指微生物在某一條件（主要是溫度和加熱方式）下的致死時間。相對熱阻：對數(shù)殘留定律：分批

42、滅菌：連續(xù)滅菌：4.連續(xù)滅菌流程圖：5. 噴射加熱-真空冷卻流程6. 薄板換熱器連續(xù)滅菌流程：十九、發(fā)酵設(shè)備1.發(fā)酵設(shè)備分類：厭氧發(fā)酵設(shè)備和好氧發(fā)酵設(shè)備好氧發(fā)酵設(shè)備按照能量輸入的不同，分為：內(nèi)部機械攪拌型：如機械攪拌發(fā)酵罐、伍式發(fā)酵罐、 機械攪拌自吸式發(fā)酵罐等。外部液體攪拌型：依靠外部循環(huán)泵來攪拌發(fā)酵液，或在液體進入發(fā)酵罐處裝有文丘里管，依靠液體的高速流動，吸入空氣，使氣液混合?？諝鈬娚涮嵘剑阂揽繅嚎s空氣作為能量輸入，促使發(fā)酵液上下翻動混合。2機械通風(fēng)發(fā)酵罐圖：機械通風(fēng)發(fā)酵罐主要部件包括：罐身、攪拌器、擋板、冷卻裝置、空氣分布器、軸封等。圖為大型發(fā)酵罐結(jié)構(gòu)3.各部件的主要功能和作用1）罐身：

43、是一個培養(yǎng)微生物的巨大容器，為要保持純培養(yǎng)，防止污染雜菌，因此要求是密封式的。罐體形狀為圓柱狀，兩端用橢圓形或碟形封頭焊接而成，小型發(fā)酵罐罐頂和罐身采用法蘭連接，材料一般為不銹鋼。為便于清洗，小型發(fā)酵罐頂設(shè)有清洗用的手孔。中大型發(fā)酵罐則裝設(shè)有供維修、清洗的入孔。罐頂還裝有視鏡及孔燈。在發(fā)酵罐的罐頂上的接管有：進料管、補料管、排氣管、接種管和壓力表接管。在罐身上的接管有冷卻水進出管、進空氣管、取樣管、溫度計管和測控儀表接口。 2）攪拌器：作用：將空氣打碎成小氣泡，增加氣液接觸界面，提高氧的傳遞速率，使發(fā)酵液充分混合，液體中的固形物保持懸浮狀態(tài)。種類：軸向式、徑向式（渦輪式）兩種。軸向式攪拌器：槳

44、葉式、螺旋槳式。徑向式（渦輪式）攪拌器：平直葉、彎葉、箭葉。3）擋板：作用：改變液流的方向，由徑向流改為軸向流，促使液體劇烈翻動，增加溶解氧。通常，擋板寬度取(0.10.2)D，裝設(shè)46塊即可滿足全擋板條件。全擋板條件（名詞解釋）：是指在一定轉(zhuǎn)數(shù)下再增加罐內(nèi)附件而軸功率仍保持不變。 4）消泡器：作用：將泡沫打破。形式：鋸齒式、梳狀式及孔板式?？装迨降目讖郊s1020毫米。長度：約為罐徑的0.65倍。 5）連軸器及軸承：大型發(fā)酵罐攪拌軸較長，常分為23段，用連軸器使上下攪拌軸成牢固的剛性聯(lián)接。常用的連軸器有鼓形及夾殼形兩種。小型的發(fā)酵罐可采用法蘭將攪拌軸連接，軸的連接應(yīng)垂直，中心線對正。為了減少震動，中型發(fā)酵罐般在罐內(nèi)裝有底軸