生物藥物分析與檢驗 氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)類藥品檢驗

1、編輯課件第第八八章章 氨基酸、多肽因子和氨基酸、多肽因子和蛋白質(zhì)類藥品檢驗蛋白質(zhì)類藥品檢驗編輯課件 基本要求：基本要求： 掌握氨基酸定性鑒別的方法，熟悉氨基酸特殊雜質(zhì)及掌握氨基酸定性鑒別的方法，熟悉氨基酸特殊雜質(zhì)及安全性檢查，掌握氨基酸含量測定方法，掌握多肽因安全性檢查，掌握氨基酸含量測定方法，掌握多肽因子類藥物的定性鑒別方法，熟悉多肽因子類藥物的檢子類藥物的定性鑒別方法，熟悉多肽因子類藥物的檢查方法，掌握多肽因子類藥物生物效價的測定方法，查方法，掌握多肽因子類藥物生物效價的測定方法，掌握蛋白質(zhì)類藥物的鑒別和檢查方法，掌握蛋白質(zhì)含掌握蛋白質(zhì)類藥物的鑒別和檢查方法，掌握蛋白質(zhì)含量測定和效價測定方

2、法，了解幾種氨基酸、多肽因子量測定和效價測定方法，了解幾種氨基酸、多肽因子和蛋白質(zhì)藥物的質(zhì)量分析過程。和蛋白質(zhì)藥物的質(zhì)量分析過程。編輯課件基本內(nèi)容基本內(nèi)容第一節(jié)第一節(jié) 氨基酸類藥品檢驗氨基酸類藥品檢驗第二節(jié)第二節(jié) 多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗第三節(jié)第三節(jié) 幾種氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)藥物的質(zhì)量分析幾種氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)藥物的質(zhì)量分析編輯課件第一節(jié)第一節(jié) 氨基酸類藥品檢驗氨基酸類藥品檢驗 氨基酸是氨基酸是治療蛋白質(zhì)代謝紊亂治療蛋白質(zhì)代謝紊亂、蛋白質(zhì)缺損蛋白質(zhì)缺損所引起的所引起的一系列疾病的重要生化藥物，也是具有高度營養(yǎng)價值一系列疾病的重要生化藥物，也是具有高度營養(yǎng)價值的

3、蛋白質(zhì)補充劑，有著廣泛的生化作用和臨床療效的蛋白質(zhì)補充劑，有著廣泛的生化作用和臨床療效。 目前氨基酸及其衍生物臨床應用不斷發(fā)展和擴大，創(chuàng)目前氨基酸及其衍生物臨床應用不斷發(fā)展和擴大，創(chuàng)制了一些新的生化藥物制了一些新的生化藥物。 如如甲基酪氨酸甲基酪氨酸治療治療嗜鉻細胞瘤嗜鉻細胞瘤 氧苯丙氨酸氧苯丙氨酸用于用于類癌瘤綜合征類癌瘤綜合征 偶氮絲氨酸偶氮絲氨酸治療治療白血病白血病 乙酰羥脯氨酸乙酰羥脯氨酸用于用于治療類風濕關(guān)節(jié)炎治療類風濕關(guān)節(jié)炎編輯課件第一節(jié)第一節(jié) 氨基酸類藥品檢驗氨基酸類藥品檢驗 氨基酸為氨基酸為白色晶狀體白色晶狀體，熔點很高，多在熔融時分解，熔點很高，多在熔融時分解，都能溶解在強酸

4、強堿中都能溶解在強酸強堿中，形成的鹽多能溶于水。，形成的鹽多能溶于水。 氨基酸在氨基酸在等電點等電點（pIpI）時）時溶解度最小溶解度最小，最穩(wěn)定。，最穩(wěn)定。 中性中性pIpI值在值在5 56.36.3左右。左右。 酸性酸性pIpI值在值在2.82.83.23.2左右。左右。 堿性氨基酸的堿性氨基酸的pIpI值在值在7.67.610.810.8左右。左右。編輯課件第一節(jié)第一節(jié) 氨基酸類藥品檢驗氨基酸類藥品檢驗一、氨基酸的定性鑒別一、氨基酸的定性鑒別 旋光度、熔點、溶解度、紙層析、氨基酸自動化分析旋光度、熔點、溶解度、紙層析、氨基酸自動化分析、氣相色譜等均可作為氨基酸鑒別的依據(jù)。、氣相色譜等均可

5、作為氨基酸鑒別的依據(jù)。1 1、化學鑒別法、化學鑒別法 氨基酸的氨基酸的鑒別最常用的方法鑒別最常用的方法是根據(jù)所有氨基酸均能與是根據(jù)所有氨基酸均能與茚三酮茚三酮顯藍紫色顯藍紫色。 采用茚三酮顯色法，中國藥典（采用茚三酮顯色法，中國藥典（20102010年）二部對所收年）二部對所收載的氨基酸類藥物大多采用此方法進行鑒別。載的氨基酸類藥物大多采用此方法進行鑒別。編輯課件第一節(jié)第一節(jié) 氨基酸類藥品檢驗氨基酸類藥品檢驗 茚三酮反應：茚三酮反應：茚三酮在酸性溶液中與茚三酮在酸性溶液中與- -氨基酸共熱氨基酸共熱，引起氨基酸氧化脫氫、脫羧反應，最后生成紫色物，引起氨基酸氧化脫氫、脫羧反應，最后生成紫色物質(zhì)。

6、質(zhì)。藍紫色溶液樣品靜置水加熱茚三酮水min15mL20min3.mL1mL55STmgOOOHOH+ H-C-NH2COOHROOOHH+ NH3CO2RCO+OOHOHO+OOOHH+ NH3H2OCOOOOH+N編輯課件第一節(jié)第一節(jié) 氨基酸類藥品檢驗氨基酸類藥品檢驗2 2、光譜鑒別法、光譜鑒別法（1 1）紫外吸收光譜法）紫外吸收光譜法 在在2020種天然氨基酸中，只有種天然氨基酸中，只有酪酪氨酸氨酸、色氨酸色氨酸和和苯丙氨酸苯丙氨酸在紫外區(qū)有最大吸收在紫外區(qū)有最大吸收。 酪氨酸酪氨酸的的 max275nm 苯丙氨酸的苯丙氨酸的 max257nm 色氨酸的色氨酸的 max280nm編輯課件1

7、 1：酪氨酸：酪氨酸2 2：色氨酸：色氨酸3 3：苯丙氨酸。：苯丙氨酸。第一節(jié)第一節(jié) 氨基酸類藥品檢驗氨基酸類藥品檢驗 這三種氨基酸可以通過這三種氨基酸可以通過紫外紫外吸收光譜吸收光譜加以鑒別。加以鑒別。 精密稱取酪氨酸、色氨酸、精密稱取酪氨酸、色氨酸、苯丙氫酸各適量苯丙氫酸各適量。 用水制成每用水制成每1mL1mL含含20g20g（色（色氨酸）、氨酸）、40g40g（酪氨酸）（酪氨酸）、200g200g（苯丙氨酸）（苯丙氨酸）。 在波長在波長230230300nm300nm測定各氨測定各氨基酸的吸收光譜基酸的吸收光譜，如右圖。，如右圖。編輯課件第一節(jié)第一節(jié) 氨基酸類藥品檢驗氨基酸類藥品檢驗（

8、2 2）紅外吸收光譜圖紅外吸收光譜圖 氨基酸在紅外區(qū)都有特性圖譜氨基酸在紅外區(qū)都有特性圖譜，可以通過與標準氨基酸圖譜比較作為氨基酸的鑒別，可以通過與標準氨基酸圖譜比較作為氨基酸的鑒別依據(jù)。依據(jù)。 所得的吸收圖譜各所得的吸收圖譜各主要吸收峰波長主要吸收峰波長和和各吸收峰間的相各吸收峰間的相互強度關(guān)系互強度關(guān)系均應與對照的圖譜一致。均應與對照的圖譜一致。編輯課件第一節(jié)第一節(jié) 氨基酸類藥品檢驗氨基酸類藥品檢驗3 3、薄層色譜鑒別法、薄層色譜鑒別法 在薄層板上點樣，通過與標準氨基酸對照而鑒別氨基在薄層板上點樣，通過與標準氨基酸對照而鑒別氨基酸。酸。（1 1）薄層板的制備薄層板的制備待用微晶纖維素樣品溶

9、劑揮發(fā)完畢后均勻涂板拌成糊狀水無水乙醇，hCg5 . 1 ,105mL5 . 2mL205編輯課件第一節(jié)第一節(jié) 氨基酸類藥品檢驗氨基酸類藥品檢驗（2 2）十一種氨基酸）十一種氨基酸混合液混合液（色、蛋、亮、異亮、甘、（色、蛋、亮、異亮、甘、賴、蘇、纈、苯丙、組、精）與賴、蘇、纈、苯丙、組、精）與對照液對照液的的制備制備?；旌洗郎y液加水定容至mL1025mg各種對照液分別加水定容至mL15 . 2 mg編輯課件第一節(jié)第一節(jié) 氨基酸類藥品檢驗氨基酸類藥品檢驗（3 3）點樣、展開和顯色點樣、展開和顯色 吸取混合液和對照液各吸取混合液和對照液各3L3L，分別點于同一薄層板上，分別點于同一薄層板上。 以

10、以正丁醇正丁醇- -水水- -異丁酸異丁酸- -醋酸醋酸（505050505 57 7）之上層）之上層作展開劑，進行作展開劑，進行單向三次展開單向三次展開，展開約，展開約15cm15cm，每次必，每次必須須待溶劑揮發(fā)盡待溶劑揮發(fā)盡后，再進行下一次展開后，再進行下一次展開。 噴以噴以顯色劑顯色劑（吲哚醌吲哚醌1g1g，溶于，溶于100mL100mL無水乙醇和無水乙醇和10mL10mL冰醋酸中）置冰醋酸中）置100100干燥干燥5 510min10min至顯色完全為止至顯色完全為止。編輯課件第一節(jié)第一節(jié) 氨基酸類藥品檢驗氨基酸類藥品檢驗 本層析系統(tǒng)中，由于本層析系統(tǒng)中，由于分分離的程度離的程度與各

11、種與各種氨基酸氨基酸顯出不同的顏色顯出不同的顏色，可以，可以區(qū)別十一種氨基酸。區(qū)別十一種氨基酸。 用用茚三酮茚三酮- -硝酸鈉硝酸鈉試劑試劑亦能顯出不同顏色的色亦能顯出不同顏色的色斑，且靈敏度較高斑，且靈敏度較高。編輯課件第一節(jié)第一節(jié) 氨基酸類藥品檢驗氨基酸類藥品檢驗4 4、旋光性旋光性 除甘氨酸外，所有的天然氨基酸都有除甘氨酸外，所有的天然氨基酸都有旋光性旋光性，且每，且每種氨基酸的比旋度不同，因此，可以用比旋度作為氨種氨基酸的比旋度不同，因此，可以用比旋度作為氨基酸藥物的鑒別指標?；崴幬锏蔫b別指標。編輯課件第一節(jié)第一節(jié) 氨基酸類藥品檢驗氨基酸類藥品檢驗二、氨基酸特殊雜質(zhì)及安全性檢查二、氨

12、基酸特殊雜質(zhì)及安全性檢查1 1、特殊雜質(zhì)檢查、特殊雜質(zhì)檢查 氨基酸原料藥所含有的特殊雜質(zhì)一般為一些其他種類氨基酸原料藥所含有的特殊雜質(zhì)一般為一些其他種類的氨基酸的氨基酸。 用用薄層色譜法薄層色譜法進行限量檢查：將樣品配成一定濃度的進行限量檢查：將樣品配成一定濃度的供試品液，取一定量供試品液稀釋后作為對照液，在供試品液，取一定量供試品液稀釋后作為對照液，在同一硅膠同一硅膠G G薄板上，一般用薄板上，一般用正丁醇水冰醋酸正丁醇水冰醋酸（3 31 11 1）展開晾干后，噴）展開晾干后，噴茚三酮茚三酮的的丙酮溶液丙酮溶液顯色，規(guī)定顯色，規(guī)定供試品所顯雜質(zhì)斑點的顏色不得深于對照液主斑點供試品所顯雜質(zhì)斑點

13、的顏色不得深于對照液主斑點，以此限制其他氨基酸的含量。以此限制其他氨基酸的含量。編輯課件第一節(jié)第一節(jié) 氨基酸類藥品檢驗氨基酸類藥品檢驗2 2、安全性檢查、安全性檢查 影響氨基酸安全用藥的因素除其中的一般雜質(zhì)，主要影響氨基酸安全用藥的因素除其中的一般雜質(zhì)，主要為熱原的含量。為熱原的含量。 中國藥典所收載的氨基酸基本上都規(guī)定了熱原檢查。中國藥典所收載的氨基酸基本上都規(guī)定了熱原檢查。 采用采用家兔法家兔法，將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體，將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內(nèi)，在規(guī)定時間內(nèi)觀察內(nèi)，在規(guī)定時間內(nèi)觀察家兔體溫升高家兔體溫升高的情況，以判定的情況，以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定

14、。供試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定。編輯課件第一節(jié)第一節(jié) 氨基酸類藥品檢驗氨基酸類藥品檢驗三、氨基酸含量測定三、氨基酸含量測定1 1、茚三酮法、茚三酮法 茚三酮法是氨基酸定量測定應用最廣泛的方法之一。茚三酮法是氨基酸定量測定應用最廣泛的方法之一。 當當茚三酮茚三酮在在酸性條件酸性條件下和氨基酸反應時，氨基酸被氧下和氨基酸反應時，氨基酸被氧化分解生成醛，放出氨和二氧化碳，水合茚三酮則成化分解生成醛，放出氨和二氧化碳，水合茚三酮則成還原型水合茚三酮。然后還原型茚三酮與氨，另一分還原型水合茚三酮。然后還原型茚三酮與氨，另一分子茚三酮進一步縮合生成子茚三酮進一步縮合生成藍紫色物藍紫色物，最大吸收值的

15、波，最大吸收值的波長為長為570nm570nm。 茚三酮反應為一切茚三酮反應為一切-氨基酸氨基酸所共有，反應靈敏，根所共有，反應靈敏，根據(jù)反應所生成的藍紫色深淺，可以測定氨基酸含量。據(jù)反應所生成的藍紫色深淺，可以測定氨基酸含量。 本法可允許的測定范圍是本法可允許的測定范圍是0.50.550g50g氨基酸氨基酸。編輯課件第一節(jié)第一節(jié) 氨基酸類藥品檢驗氨基酸類藥品檢驗2 2、酸堿滴、酸堿滴定法定法 谷氨酸、天冬氨酸和賴氨酸谷氨酸、天冬氨酸和賴氨酸 賴氨酸（賴氨酸（lysinelysine）片中賴氨酸的測定）片中賴氨酸的測定 取本品取本品2020片，精密稱定，研細，精密稱取適量（約相片，精密稱定，研

16、細，精密稱取適量（約相當于賴氨酸當于賴氨酸0.15g0.15g）置燒杯中，加水）置燒杯中，加水25mL25mL，滴加氫氧，滴加氫氧化鈉滴定液（化鈉滴定液（0.1mol/L0.1mol/L），用酸度計調(diào)節(jié)至），用酸度計調(diào)節(jié)至pHpH值為值為7.07.0，加入預先調(diào)節(jié)至，加入預先調(diào)節(jié)至pHpH值值9.09.0的甲醛溶液的甲醛溶液15mL15mL，攪勻，攪勻，再用氫氧化鈉滴定液（，再用氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L0.1mol/L）滴定）滴定至至pHpH值為值為9.09.0，并持續(xù)，并持續(xù)30s30s。 按加入甲醛液后所耗用氫氧化鈉滴定液（按加入甲醛液后所耗用氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L0.1

17、mol/L）體積計算，每毫升氫氧化鈉滴定液（體積計算，每毫升氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L0.1mol/L）相當）相當于于9.132mg9.132mg的的C C6 6H H1414N N2 2O O2 2HClHCl。編輯課件第一節(jié)第一節(jié) 氨基酸類藥品檢驗氨基酸類藥品檢驗3 3、非水溶液滴定法、非水溶液滴定法 中國藥典、美國藥典和英國藥典對所收載氨基酸類藥中國藥典、美國藥典和英國藥典對所收載氨基酸類藥物，除物，除谷氨酸谷氨酸用用氫氧化鈉氫氧化鈉為標準溶液的酸堿滴定法，為標準溶液的酸堿滴定法，其余均根據(jù)其結(jié)構(gòu)特性，采用了其余均根據(jù)其結(jié)構(gòu)特性，采用了非水酸堿滴定法非水酸堿滴定法。 用用冰醋酸作溶

18、劑冰醋酸作溶劑，高氯酸高氯酸作作標準溶液滴定，電位法或標準溶液滴定，電位法或指示劑法確定終點。指示劑法確定終點。 適用于適用于常量氨基酸常量氨基酸的含量測定。的含量測定。編輯課件第一節(jié)第一節(jié) 氨基酸類藥品檢驗氨基酸類藥品檢驗4 4、定氮法定氮法 精氨酸和天冬酰胺精氨酸和天冬酰胺的原料及其制劑可以采用定氮法測的原料及其制劑可以采用定氮法測定含量定含量。 將被測藥物置于凱式燒瓶中，加濃硫酸、硫酸鹽及適將被測藥物置于凱式燒瓶中，加濃硫酸、硫酸鹽及適量的催化劑，加熱進行有機物的破壞，其中所含的氮量的催化劑，加熱進行有機物的破壞，其中所含的氮完全轉(zhuǎn)化為氨，再與硫酸結(jié)合成硫酸銨，硫酸銨與強完全轉(zhuǎn)化為氨，再

19、與硫酸結(jié)合成硫酸銨，硫酸銨與強堿反應，放出氨，將其蒸出，吸收于定量酸溶液，酸堿反應，放出氨，將其蒸出，吸收于定量酸溶液，酸堿滴定法滴定，從而計算出氮的含量并換算成被測藥堿滴定法滴定，從而計算出氮的含量并換算成被測藥物的含量。物的含量。編輯課件第一節(jié)第一節(jié) 氨基酸類藥品檢驗氨基酸類藥品檢驗 5 5、HPLCHPLC 對于各種復方氨基酸制劑中氨基酸的含量測定，目前對于各種復方氨基酸制劑中氨基酸的含量測定，目前較多地采用了高效液相色譜法（較多地采用了高效液相色譜法（HPLCHPLC）。）。 因大多數(shù)氨基酸因大多數(shù)氨基酸沒有紫外吸收沒有紫外吸收，不能用紫外檢測器測，不能用紫外檢測器測定。為改善被測物的

20、檢測特性，提高檢測靈敏度，需定。為改善被測物的檢測特性，提高檢測靈敏度，需進行進行化學衍生化化學衍生化。 衍生方式包括衍生方式包括柱后衍生法柱后衍生法和和柱前衍生法柱前衍生法。 柱后衍生法是將樣品經(jīng)離子交換柱分離后進行衍生柱后衍生法是將樣品經(jīng)離子交換柱分離后進行衍生；柱前衍生法是將樣品制成適當?shù)难苌镌龠M行柱前衍生法是將樣品制成適當?shù)难苌镌龠M行HPLCHPLC分分離離。編輯課件第二節(jié)第二節(jié) 多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗 蛋白質(zhì)和多肽因子是生物體內(nèi)廣泛存在的生化物質(zhì)，具蛋白質(zhì)和多肽因子是生物體內(nèi)廣泛存在的生化物質(zhì)，具多種生理功能，是一大類非常重要的生化藥物。多種生理

21、功能，是一大類非常重要的生化藥物。 多肽因子類藥物多肽因子類藥物指分子量不算太大的，在體內(nèi)含量極微指分子量不算太大的，在體內(nèi)含量極微，但卻發(fā)揮極大生理作用的一類生物活性物質(zhì)。，但卻發(fā)揮極大生理作用的一類生物活性物質(zhì)。 其中包括天然動物體內(nèi)提取的藥物如干擾素、白細胞介其中包括天然動物體內(nèi)提取的藥物如干擾素、白細胞介素、胸腺肽、轉(zhuǎn)移因子等和通過現(xiàn)代基因工程技術(shù)生產(chǎn)素、胸腺肽、轉(zhuǎn)移因子等和通過現(xiàn)代基因工程技術(shù)生產(chǎn)的藥品如重組人干擾素、重組白細胞介素、重組乙肝疫的藥品如重組人干擾素、重組白細胞介素、重組乙肝疫苗等。苗等。編輯課件第二節(jié)第二節(jié) 多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗品檢驗一、

22、多肽因子類藥物的定性鑒別一、多肽因子類藥物的定性鑒別 基因重組多肽因子類藥物的基因重組多肽因子類藥物的鑒別鑒別主要采用主要采用SDS-PAGESDS-PAGE法法和和免疫印跡法免疫印跡法。1 1、SDS-PAGESDS-PAGE法法 用用SDS-PAGESDS-PAGE鑒別生物樣品必須是該品有鑒別生物樣品必須是該品有極純的標準對極純的標準對照品照品，通過電泳結(jié)果的對比，確定所測樣品是否與標，通過電泳結(jié)果的對比，確定所測樣品是否與標準品有準品有相同的遷移率相同的遷移率，從而鑒別該品。，從而鑒別該品。 缺點缺點：必須有標準品；：必須有標準品；凝膠中多肽凝膠中多肽需需保留生物活性，保留生物活性，或能

23、或能夠復性夠復性，或電泳前可將檢測配基，或電泳前可將檢測配基與待與待測多肽共價測多肽共價交聯(lián)交聯(lián)。編輯課件第二節(jié)第二節(jié) 多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗品檢驗2 2、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)免疫印跡免疫印跡電泳電泳法（轉(zhuǎn)移電泳、法（轉(zhuǎn)移電泳、western blotwestern blot） 原理原理：借助借助聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠技術(shù)，將生物活性物質(zhì)高技術(shù)，將生物活性物質(zhì)高效分離，分離后的樣品可以效分離，分離后的樣品可以原位原位、定量驅(qū)動定量驅(qū)動或或吸印吸印在在另一種另一種固相載體固相載體（通常用醋酸纖維素薄膜，簡稱（通常用醋酸纖維素薄膜，簡稱NCNC膜膜）上）上，能能保持原有的

24、生物活性保持原有的生物活性，可以進行各種生物檢，可以進行各種生物檢測、免疫識別、掃描、積分和保存。測、免疫識別、掃描、積分和保存。編輯課件第二節(jié)第二節(jié) 多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗品檢驗（1 1）基本操作）基本操作 分分3 3個部分個部分：聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳；轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移電泳移電泳（即將凝膠中的多肽條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素紙即將凝膠中的多肽條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素紙上上）；檢測或鑒定檢測或鑒定薄膜上的薄膜上的多肽條帶多肽條帶。聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 先將先將待待分離樣品進行凝膠電泳分離樣品進行凝膠電泳分離。分離。 凝膠可用凝膠可用瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠，也

25、可用，也可用聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠，可以，可以是是均一均一的，也可用的，也可用梯度梯度凝膠，凝膠緩沖體系中可含有凝膠，凝膠緩沖體系中可含有各種各種變性劑變性劑，如，如SDSSDS、LDSLDS、尿素等，可進行、尿素等，可進行單向或雙單向或雙向電泳向電泳，也可用，也可用等電聚焦電泳等電聚焦電泳。編輯課件第二節(jié)第二節(jié) 多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗品檢驗轉(zhuǎn)移電泳轉(zhuǎn)移電泳 將將濕濕醋酸纖維素（醋酸纖維素（NCNC）薄膜薄膜緊貼緊貼凝膠凝膠，凝，凝膠與薄膜之間膠與薄膜之間不能有氣泡不能有氣泡，否則在氣泡所在部位的條，否則在氣泡所在部位的條帶將不能轉(zhuǎn)移，在帶將不能轉(zhuǎn)移，在NCN

26、C膜和凝膠的另一側(cè)放上膜和凝膠的另一側(cè)放上兩層濕濾兩層濕濾紙紙，也，也不能有氣泡不能有氣泡，再在兩邊，再在兩邊貼上海綿貼上海綿，最后用，最后用塑料塑料網(wǎng)框架網(wǎng)框架夾緊，插入夾緊，插入電泳槽電泳槽，根據(jù)凝膠中樣品，根據(jù)凝膠中樣品所帶電荷所帶電荷的性質(zhì)的性質(zhì)，決定有，決定有NCNC膜的一邊是靠近膜的一邊是靠近正極正極還是靠近還是靠近負極負極一側(cè)。一側(cè)。 電泳條件取決于凝膠類型、轉(zhuǎn)移裝置和蛋白質(zhì)本身性電泳條件取決于凝膠類型、轉(zhuǎn)移裝置和蛋白質(zhì)本身性質(zhì)等。一般采用質(zhì)等。一般采用低電壓低電壓和和低電流低電流（2mA/cm2mA/cm2 2以內(nèi)以內(nèi)）。）。 緩沖液中一般含有緩沖液中一般含有2020的甲醇或乙

27、醇的甲醇或乙醇，其作用主要是，其作用主要是保持凝膠的幾何形狀。保持凝膠的幾何形狀。編輯課件第二節(jié)第二節(jié) 多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗品檢驗檢測或鑒定檢測或鑒定 NC NC膜膜借助借助非共價鍵非共價鍵吸附蛋白質(zhì)吸附蛋白質(zhì)，經(jīng)轉(zhuǎn)移，經(jīng)轉(zhuǎn)移后蛋白質(zhì)條帶就固定在后蛋白質(zhì)條帶就固定在NCNC膜上，膜上，完全保留完全保留凝膠中的凝膠中的蛋蛋白譜白譜，可，可直接直接用考馬斯亮藍、氨基黑用考馬斯亮藍、氨基黑10B10B等等染色染色。 如果利用蛋白質(zhì)生物活性，或用蛋白質(zhì)生物探針來檢如果利用蛋白質(zhì)生物活性，或用蛋白質(zhì)生物探針來檢測，就要測，就要先用先用1 13 3的牛血清蛋白的牛血清蛋白或血

28、紅蛋白，或或血紅蛋白，或非離子去垢劑非離子去垢劑（0.30.3吐溫吐溫-20-20）等）等處理處理NCNC紙紙，以封閉以封閉NCNC紙上未吸附蛋白質(zhì)區(qū)域，使其不再能吸附蛋白質(zhì)。紙上未吸附蛋白質(zhì)區(qū)域，使其不再能吸附蛋白質(zhì)。 使用非離子去垢劑比較經(jīng)濟，但有可能把使用非離子去垢劑比較經(jīng)濟，但有可能把NCNC紙上的某紙上的某些蛋白質(zhì)洗掉，同時還要將些蛋白質(zhì)洗掉，同時還要將NCNC紙反復洗滌以去除變性紙反復洗滌以去除變性劑，劑，編輯課件第二節(jié)第二節(jié) 多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗品檢驗二、多肽因子類藥物的檢查二、多肽因子類藥物的檢查1 1、分子量檢查、分子量檢查 常用還原型常用還原型

29、SDS-PAGESDS-PAGE法檢查分子量，用量約法檢查分子量，用量約1g1g。 也可采用也可采用凝膠過濾法，例如凝膠過濾法，例如SephadecxSephadecx系列（系列（G-75G-75，- -100100）；waters 1waters 16060，125125，250250；Backman TSK Backman TSK 2000SW2000SW，3000SW3000SW，4000SW4000SW。 凝膠過濾凝膠過濾是測定是測定完整蛋白質(zhì)分子完整蛋白質(zhì)分子的分子量，而的分子量，而SDS-SDS-PAGEPAGE是測定是測定蛋白質(zhì)亞基蛋白質(zhì)亞基的分子量，的分子量，同時同時用這用這二

30、種方法二種方法測定同一蛋白質(zhì)的分子量，可以方便地判斷樣品蛋白測定同一蛋白質(zhì)的分子量，可以方便地判斷樣品蛋白質(zhì)是否是寡聚蛋白質(zhì)。質(zhì)是否是寡聚蛋白質(zhì)。編輯課件第二節(jié)第二節(jié) 多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗品檢驗2 2、等電點測定、等電點測定 等電點是蛋白質(zhì)的物理化學常數(shù)，它表示蛋白質(zhì)的帶等電點是蛋白質(zhì)的物理化學常數(shù)，它表示蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)。電性質(zhì)。 一般采用一般采用凝膠等電聚焦電泳凝膠等電聚焦電泳技術(shù)測定等電點。技術(shù)測定等電點。3 3、紫外吸收、紫外吸收 不同的蛋白質(zhì)分子都有其特定的紫外吸收，對于某種不同的蛋白質(zhì)分子都有其特定的紫外吸收，對于某種蛋白質(zhì)或多肽來說，它的蛋白質(zhì)或多肽

31、來說，它的最大吸收波長是固定最大吸收波長是固定的。的。 紫外吸收光譜紫外吸收光譜是檢查蛋白質(zhì)的一個重要指標。是檢查蛋白質(zhì)的一個重要指標。編輯課件第二節(jié)第二節(jié) 多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗品檢驗4 4、純度、純度 基因工程產(chǎn)品蛋白質(zhì)基因工程產(chǎn)品蛋白質(zhì)純度純度是一項重要指標，但它也是是一項重要指標，但它也是一項相對的指標，需一項相對的指標，需根據(jù)實際要求而定根據(jù)實際要求而定。 蛋白質(zhì)純度蛋白質(zhì)純度一般是指一般是指是否含有其他雜蛋白是否含有其他雜蛋白，而不包括，而不包括鹽、緩沖液離子、鹽、緩沖液離子、SDSSDS等小分子在內(nèi)。等小分子在內(nèi)。 目前較常用的是目前較常用的是HPLC

32、HPLC法法（包括凝膠過濾、各種反相（包括凝膠過濾、各種反相HPLCHPLC、離子色譜、疏水色譜等）、離子色譜、疏水色譜等）、非還原非還原SDS-PAGESDS-PAGE凝凝膠電泳法膠電泳法、毛細管電泳法毛細管電泳法（CECE）、）、等電聚焦電泳等電聚焦電泳， 此外也應用一些化學方法，觀察末端是否均一。此外也應用一些化學方法，觀察末端是否均一。編輯課件第二節(jié)第二節(jié) 多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗品檢驗 至少應用兩種以上的方法，而且是至少應用兩種以上的方法，而且是兩種不同分離機理兩種不同分離機理的方法來判定蛋白質(zhì)的純度才比較可靠。的方法來判定蛋白質(zhì)的純度才比較可靠。 常發(fā)現(xiàn)某

33、一樣品在凝膠過濾中是純的，而在離子色譜常發(fā)現(xiàn)某一樣品在凝膠過濾中是純的，而在離子色譜中卻分辨為二個組分，反之亦然。中卻分辨為二個組分，反之亦然。 又如一種樣品用又如一種樣品用凝膠過濾法凝膠過濾法和和SDS-PAGESDS-PAGE電泳電泳證明是純證明是純的，但這仍不充分，因為這的，但這仍不充分，因為這兩兩者者機理相同機理相同。編輯課件第二節(jié)第二節(jié) 多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗品檢驗三三、蛋白質(zhì)類藥物的鑒別和檢查、蛋白質(zhì)類藥物的鑒別和檢查1 1、蛋白質(zhì)類藥物的鑒別、蛋白質(zhì)類藥物的鑒別 蛋白質(zhì)類藥物可根據(jù)其各自的物理、化學性質(zhì)、生理蛋白質(zhì)類藥物可根據(jù)其各自的物理、化學性質(zhì)、生

34、理作用等采用不同的方法進行鑒別。作用等采用不同的方法進行鑒別。（1 1）茚三酮反應茚三酮反應 組成蛋白質(zhì)的氨基酸都能與茚三酮反組成蛋白質(zhì)的氨基酸都能與茚三酮反應生成紫色化合物，因此蛋白質(zhì)也有此反應，這是蛋應生成紫色化合物，因此蛋白質(zhì)也有此反應，這是蛋白質(zhì)鑒別的最常用方法。白質(zhì)鑒別的最常用方法。（2 2）福林酚反應或雙縮脲反應福林酚反應或雙縮脲反應 這兩種常用來測定蛋這兩種常用來測定蛋白質(zhì)的含量，但有時也用于蛋白質(zhì)的鑒別。白質(zhì)的含量，但有時也用于蛋白質(zhì)的鑒別。（3 3）紫外吸收紫外吸收 由于組成蛋白質(zhì)的氨基酸中，酪氨酸由于組成蛋白質(zhì)的氨基酸中，酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸在紫外區(qū)的光吸收特性，因此可

35、、色氨酸、苯丙氨酸在紫外區(qū)的光吸收特性，因此可利用此種特性鑒別蛋白質(zhì)。利用此種特性鑒別蛋白質(zhì)。編輯課件第二節(jié)第二節(jié) 多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗品檢驗五、蛋白質(zhì)含量測定和效價測定五、蛋白質(zhì)含量測定和效價測定1 1、蛋白質(zhì)含量測定、蛋白質(zhì)含量測定 蛋白質(zhì)的定量可用化學方法如蛋白質(zhì)的定量可用化學方法如凱氏定氮法凱氏定氮法、雙縮脲法雙縮脲法、福林酚法福林酚法、紫外光吸收法紫外光吸收法來測定；也可用來測定；也可用染色法染色法，如如氨基黑氨基黑、考馬斯亮藍考馬斯亮藍測定；此外還可用測定；此外還可用熒光激發(fā)熒光激發(fā)、氯胺氯胺T T、放射性核素計數(shù)放射性核素計數(shù)等靈敏度較高方法。等靈敏

36、度較高方法。 上述方法中凱氏定氮法、福林酚法、紫外光吸收法最上述方法中凱氏定氮法、福林酚法、紫外光吸收法最為常用，它們操作簡單、設(shè)備便宜。為常用，它們操作簡單、設(shè)備便宜。編輯課件第二節(jié)第二節(jié) 多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗品檢驗（1 1）凱氏定氮法）凱氏定氮法 凱氏定氮法常用來測定有機物的含氮凱氏定氮法常用來測定有機物的含氮量。量。原理：原理：A A、含氮有機物含氮有機物的消化的消化 當當含氮有機物與硫酸共含氮有機物與硫酸共熱熱時，分解出氮、二氧化碳、水。時，分解出氮、二氧化碳、水。 氮轉(zhuǎn)變出的氨與硫酸化合生成氮轉(zhuǎn)變出的氨與硫酸化合生成硫酸銨硫酸銨。 分解反應進行得很慢，可

37、加入分解反應進行得很慢，可加入硫酸銅硫酸銅及及硫酸鉀硫酸鉀或或硫酸硫酸鈉鈉促進反應，其中促進反應，其中硫酸銅為催化劑硫酸銅為催化劑，硫酸鉀或硫酸鈉，硫酸鉀或硫酸鈉可提高沸點?？商岣叻悬c。 過氧化氫過氧化氫也能加速反應。也能加速反應。編輯課件第二節(jié)第二節(jié) 多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗品檢驗B B、銨離子的生成銨離子的生成 消化完了以后，在凱氏定氮瓶中加入消化完了以后，在凱氏定氮瓶中加入強堿（氫氧化鈉溶液）消化液強堿（氫氧化鈉溶液）消化液，使硫酸銨分解，放出，使硫酸銨分解，放出氨。氨。 用用水蒸汽蒸餾法水蒸汽蒸餾法，將氨蒸入過量的，將氨蒸入過量的硼酸硼酸溶液中，氨與溶液中，氨

38、與溶液中的氫離子結(jié)合，生成溶液中的氫離子結(jié)合，生成銨離子銨離子，使溶液中氫離子，使溶液中氫離子濃度降低。濃度降低。C C、測定測定 用用強酸滴定強酸滴定，直至恢復溶液中原來的氫離子濃，直至恢復溶液中原來的氫離子濃度為止。度為止。 所用強酸的摩爾數(shù)即相當于被測樣品中氨的摩爾數(shù)所用強酸的摩爾數(shù)即相當于被測樣品中氨的摩爾數(shù)。編輯課件第二節(jié)第二節(jié) 多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗品檢驗（2 2）紫外吸收法）紫外吸收法 280nm280nm光吸收法光吸收法 由于蛋白質(zhì)中由于蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋含有共軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)在白質(zhì)在275

39、275280nm280nm波長處有一個紫外吸收高峰，在波長處有一個紫外吸收高峰，在一定范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液在一定范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液在280nm280nm波長處的光吸收度波長處的光吸收度值（值（A A280280）與其濃度成正比，因此可作定量測定）與其濃度成正比，因此可作定量測定。 該法測定范圍為該法測定范圍為0.010.010.1mg/mL0.1mg/mL。 該法簡單、靈敏、快速、不消耗樣品，該法簡單、靈敏、快速、不消耗樣品，低濃度的鹽低濃度的鹽類不干擾測定類不干擾測定，因此在蛋白質(zhì)和酶的生化制備中廣，因此在蛋白質(zhì)和酶的生化制備中廣泛應用。泛應用。編輯課件第二節(jié)第二節(jié) 多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥多肽

40、因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗品檢驗280nm280nm和和260nm260nm光吸收差法光吸收差法 若樣品中含有若樣品中含有嘌呤嘌呤、嘧嘧啶啶等核酸類吸收紫外光的物質(zhì)，在用來測定蛋白質(zhì)等核酸類吸收紫外光的物質(zhì)，在用來測定蛋白質(zhì)濃度時，會有較大的干擾。濃度時，會有較大的干擾。 由于核酸在由于核酸在260nm260nm波長處的光吸收比波長處的光吸收比280nm280nm波長處更波長處更強強，因此可利用，因此可利用280nm280nm和和260nm260nm的吸收差來計算蛋白的吸收差來計算蛋白質(zhì)濃度。質(zhì)濃度。 常用下列經(jīng)驗公式估算：常用下列經(jīng)驗公式估算： 蛋白質(zhì)濃度（蛋白質(zhì)濃度（mg/mLmg/mL）=

41、1.45=1.45A A2802800.740.74A A260260（假設(shè)（假設(shè)1mg/mL1mg/mL蛋白質(zhì)溶液的蛋白質(zhì)溶液的A A280280為為1.01.0）編輯課件第二節(jié)第二節(jié) 多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗品檢驗（3 3）考馬斯亮藍考馬斯亮藍G-250G-250染色法染色法 考馬斯亮藍考馬斯亮藍G-250G-250在酸在酸性溶液中為棕紅色，當它與蛋白質(zhì)通過性溶液中為棕紅色，當它與蛋白質(zhì)通過疏水作用疏水作用結(jié)結(jié)合后變?yōu)楹虾笞優(yōu)樗{色藍色，可在，可在595nm595nm波長處進行比色測定波長處進行比色測定。 該法反應快、操作簡便、消耗樣品少，但不同蛋白該法反應快、操作

42、簡便、消耗樣品少，但不同蛋白質(zhì)之間差異較大，且質(zhì)之間差異較大，且標準曲線線性較差標準曲線線性較差。 測定范圍為測定范圍為0.010.011.0mg/mL1.0mg/mL蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)。 高濃度的高濃度的TrisTris、EDTAEDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸銨、去垢劑對測定有干擾，緩沖液濃度過高或硫酸銨、去垢劑對測定有干擾，緩沖液濃度過高或改變測定液的改變測定液的pHpH也會影響顯色。也會影響顯色。編輯課件第二節(jié)第二節(jié) 多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥多肽因子類和蛋白質(zhì)類藥品檢驗品檢驗 A A、溶液的配制溶液的配制 標準蛋白質(zhì)溶液標準蛋白質(zhì)溶液 0.1 0.1或或1.0mg

43、/mL1.0mg/mL牛牛血清白蛋白。血清白蛋白。 染色液染色液 稱取稱取100mg100mg考馬斯亮藍考馬斯亮藍G-250G-250溶解于溶解于50mL 9550mL 95乙醇中，加乙醇中，加100mL 85100mL 85的磷酸，加水稀釋到的磷酸，加水稀釋到1000mL1000mL。該染色液可保存數(shù)月。若不加水可長期保存，臨用前該染色液可保存數(shù)月。若不加水可長期保存，臨用前再稀釋。再稀釋。 B B、標準曲線標準曲線 在試管中分別加標準蛋白質(zhì)溶液在試管中分別加標準蛋白質(zhì)溶液0 0、6 6、1212、2424、3636、4848、60L60L，用水補足至，用水補足至60L60L，加，加3mL3mL