實(shí)驗(yàn)十二質(zhì)粒DNA的小量制備、電泳檢測(cè)及細(xì)菌轉(zhuǎn)化

1、實(shí)驗(yàn)十二質(zhì)粒 DNA 的小量制備、電泳檢測(cè)及細(xì)菌轉(zhuǎn)化. 質(zhì)粒 DNA 的小量制備一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)并把握質(zhì)粒的小量制備技術(shù)。二 實(shí)驗(yàn)材料和用具菌種：DH5/pUC19培育基： LB ： Tryptone 1% ， Yeast Extract %，NaCl 1% ，(Agar 2%) ； 120滅菌 20min 。D0001 碧云天質(zhì)粒小量抽提試劑盒（或其它公司的產(chǎn)品）恒溫培育箱、恒溫?fù)u床、超凈工作臺(tái)、臺(tái)式高速離心機(jī)、臺(tái)式小型振蕩儀、EP 管（ Eppendorf 管，微量離心管） 、加樣器、吸頭等。三 原理實(shí)驗(yàn)采納國(guó)產(chǎn)的質(zhì)粒小量抽提試劑盒。它是一種新型的離子互換柱，在特定的條件下， 使質(zhì)粒能在離

2、心過(guò)柱的剎時(shí)，結(jié)合到質(zhì)粒純化柱上， 在必然條件下又能將質(zhì)粒充分洗脫，從而實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒的快速純化。而且在提取進(jìn)程中，無(wú)需酚 - 氯仿抽提、無(wú)需酒精沉淀，可在較短時(shí)刻內(nèi)完成質(zhì)粒的提取和純化。四 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1. 細(xì)菌培育及菌體的收成。2. 用試劑盒進(jìn)行小量質(zhì)粒制備。五 實(shí)驗(yàn)步驟1. 將菌株接種到液體LB 培育基中，加入氨芐青霉素至100 g/ml ， 150rpm 振蕩 16h；2. 吸取培育菌液與離心管中， 13000rpm 室溫下離心 2min 。倒掉上清， 然后倒置于吸水紙上，使液體流盡；3. 加入 150 l 溶液， vortex 或彈起沉淀，使完全散開(kāi)，無(wú)絮塊。4. 加入 200 l 溶液，倒置

3、離心管 68 次，使細(xì)菌完全裂解，溶液透明，注意不能振蕩；5. 加入 500 l 溶液，倒置 68 次，可見(jiàn)白色絮狀物產(chǎn)生；6. 13000rpm 離心 10min 。離心時(shí)預(yù)備好質(zhì)粒純化柱及最后的質(zhì)粒搜集管；7. 直接將上清液倒入質(zhì)粒純化柱，13000rpm 離心 1min，使質(zhì)粒結(jié)合于純化柱上；8. 倒棄搜集管內(nèi)的液體，在質(zhì)粒純化柱內(nèi)加入750 l 溶液， 13000rpm 離心 1min，洗去雜質(zhì)；9. 倒棄搜集管內(nèi)液體， 13000rpm 離心 1min，除去殘留液體；10. 將質(zhì)粒純化柱放在質(zhì)粒搜集管上，加50ul 溶液至管內(nèi)柱面上，放置1min ；11. 13000rpm 離心 1

4、min，所得液體確實(shí)是質(zhì)粒。質(zhì)粒于-20冰箱保藏備用。六 注意事項(xiàng)1. 在利用前，在溶液（洗滌液）加入 40ml 無(wú)水乙醇或 43ml95% 乙醇，然后在瓶蓋上作好記號(hào)。2. 溶液在溫度較低時(shí)，可能會(huì)產(chǎn)生沉淀，需先用水浴加熱溶解，混勻后再利用。溶液易被空氣中的 CO2 酸化，用完后應(yīng)當(dāng)即蓋緊瓶蓋。七 試探題1. 加入溶液后，什么緣故不能猛烈振蕩？附錄一： pUC19 圖譜.質(zhì)粒 DNA 的電泳檢測(cè)一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)并把握瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的技術(shù)。二 實(shí)驗(yàn)材料瓊脂糖， TAE 緩沖液，加樣緩沖液，溴化乙錠（EB），標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker電泳儀、穩(wěn)壓電源、凝膠電泳成像儀等三 實(shí)驗(yàn)原理瓊脂糖電

5、泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳是分離、鑒定和純化DNA片段的有效方式。瓊脂糖凝膠的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝膠低，但其分離范圍較廣。用各類濃度的瓊脂糖凝膠可分離長(zhǎng)度200bp50kb 的 DNA. 。瓊脂糖凝膠通常采納水平裝置在強(qiáng)度和方向恒定的電場(chǎng)下電泳。直接用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙錠進(jìn)行染色，可確信DNA 在凝膠中的位置。四 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容對(duì)所提取的質(zhì)粒DNA 樣品進(jìn)行電泳檢測(cè)。五 實(shí)驗(yàn)步驟1. 制膠 （見(jiàn)圖 3）(1) 膠模兩頭用膠帶封嚴(yán)，架好梳子備用；(2) 稱取的瓊脂糖于 100ml 燒杯中，加入 20mlTAE ，加熱熔化至無(wú)顆粒狀瓊脂糖，冷卻到 60左右加入EB （終濃度g/ml ），搖勻，即

6、倒入膠模中凝固30min以上；(3) 臨用前，撕去封口膠帶，放入電泳槽中，倒入適量的電泳緩沖液TAE（淹過(guò)膠面），拔取梳子備用。2. 樣品預(yù)備取已提取好的質(zhì)粒DNA 5l 于 500 l 指管中，加入1 l 的加樣緩沖液，混勻；3. 電泳(1) 將樣品和 5 l 標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量別離點(diǎn)樣到梳孔中；(2) 恒壓 50v，電泳 60 分鐘左右；(3) 電泳終止后關(guān)閉電源，掏出凝膠，用凝膠成像儀進(jìn)行攝影和記錄。圖 3 灌制水平瓊脂糖凝膠六 實(shí)驗(yàn)結(jié)果將質(zhì)粒 DNA 條帶與 DNA MW Marker進(jìn)行比對(duì)，對(duì)證粒提取結(jié)果進(jìn)行分析。七 注意事項(xiàng)溴化乙錠是強(qiáng)誘變劑，并有中度毒性， 取用含有這一染料的溶液時(shí)務(wù)

7、必戴上手套，這些溶液經(jīng)利用后應(yīng)按下面介紹的方式進(jìn)行凈化處置。附錄一溴化乙錠稀溶液的處置(適用于含有g(shù)/ml的溴化乙錠的電泳緩沖液)方式一1.每100ml溶液中加入Amberlite XAD-16,這是一種非離子型多聚吸附劑,可向Rohm& Haas 公司購(gòu)買；2. 于室溫放置 12 小時(shí)，不時(shí)搖動(dòng)；3. 用 Whatman 1 濾紙過(guò)濾溶液，拋棄濾液；4. 用塑料袋封裝濾紙和 Amberlite 樹(shù)脂，作為有害廢物予以拋棄。方式二1. 每 100ml 溶液中加入 100mg 粉狀活性炭；2. 于室溫放置 1 小時(shí)，不時(shí)搖動(dòng)；3. 用 Whatman 1 號(hào)濾紙過(guò)濾溶液，拋棄濾液；4.

8、用塑料袋封裝濾紙和活性炭，作為有害廢物予以拋棄。附錄二1. 電泳緩沖液Tris- 乙酸（ TAE ）： L Tris- 乙酸， L EDTA 。濃儲(chǔ)藏液液（50× TAE ）：每升含有242g Tris 堿，冰乙酸， 10ml L EDTA （）2. L EDTA （）在 80ml 蒸餾水中加入EDTA-Na ·2H2O ，在磁力攪拌器上猛烈攪拌，用NaOH 調(diào)劑溶液的 pH 值至，然后定容至1000ml ，分裝后滅菌備用。大腸桿菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)并把握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及外源基因?qū)爰?xì)胞的技術(shù)。二 實(shí)驗(yàn)材料和用具菌種：DH5；質(zhì)粒： pUC19 ；培育基：

9、 LB ：1. LB 液體試管： 5ml/ 管；2. LB 液體三角瓶： 20ml/250ml 三角瓶；3. LB+Amp 平板： Ampicillin 加量 100 g/ml ；器材：恒溫培育箱、恒溫?fù)u床、離心機(jī)、超凈工作臺(tái)、高壓蒸汽滅菌鍋、涂布棒、EP管、可調(diào)移液器、吸頭等。三 實(shí)驗(yàn)原理轉(zhuǎn)化活性是檢測(cè)質(zhì)粒生物活性的重要指標(biāo)。用于轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞一樣是限制-修飾系統(tǒng)缺點(diǎn)的變異株，以避免對(duì)外源DNA 的切割。質(zhì)?？煞襁M(jìn)入受體細(xì)胞取決于該細(xì)胞是不是處于容易吸收外源 DNA 的感受態(tài)。細(xì)胞的感受態(tài)能夠通過(guò)理化因素誘導(dǎo)產(chǎn)生。大腸桿菌是經(jīng)常使用的受體菌， 其感受態(tài)一樣是通過(guò)用CaCl2 在 0條件下處置

10、細(xì)胞而形成。細(xì)胞處于 0的 CaCl 2 低滲溶液中， 會(huì)膨脹成球形， 細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，轉(zhuǎn)化混合物中的質(zhì)粒DNA形成抗 Dnase 的羥基 -鈣磷酸復(fù)合粘附于細(xì)胞表面，經(jīng) 42短時(shí)刻熱激處置，增進(jìn)細(xì)胞吸收 DNA 復(fù)合物，在 LB 培育基上培育數(shù)小時(shí)后，球形細(xì)胞恢復(fù)并增殖，在選擇培育基上即可取得所需的轉(zhuǎn)化子。四 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1. 制備 DH5 的感受態(tài)細(xì)胞；2. 進(jìn)行質(zhì)粒 pUC19 的轉(zhuǎn)化五 操作步驟1. 菌種在 LB 液體培育基中活化， 37， 150rpm 振蕩培育留宿；2. 轉(zhuǎn)接到新鮮 LB 液體培育基中，接種量 5%；3. 37， 150rpm 培育至 OD600 =；4. 將培育液放入冰浴冷卻 10min ；5. 取培育液于 6500rpm 離心 5min，棄上清液；6. 加冰涼 CaCl2 溶液（ 50mmol/LCaCl 2，10mmol/L Tris ，），用混勻器混勻或用手指彈離心管混勻；7. 將離心管置于冰浴 45min；8. 6500rpm 5min 離心搜集細(xì)胞；9. 將細(xì)胞警惕懸浮于冰涼 CaCl 2 溶液中（用移液器警惕混勻） ；10. 加 1 l 質(zhì)粒，警惕混勻，置冰浴45min ；11. 將離心管置于 42恒溫水浴熱處置 2min （準(zhǔn)確?。?；12. 加 1