蛋白質(zhì)組與轉(zhuǎn)錄組比較關(guān)聯(lián)分析方案

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上蛋白質(zhì)組與轉(zhuǎn)錄組比較關(guān)聯(lián)分析方案一概述1研究背景生命體是一個多層次，多功能的復(fù)雜結(jié)構(gòu)體系，高通量技術(shù)的發(fā)展積累了大量的組學(xué)數(shù)據(jù)，這使得由精細的分解研究轉(zhuǎn)向系統(tǒng)的整體研究成為可能，整合多組學(xué)數(shù)據(jù)能夠?qū)崿F(xiàn)對生物系統(tǒng)的全面了解。當(dāng)部分層面上的研究都逐漸走向完善的時候，從部分到整體就是一種必然發(fā)展趨勢。相關(guān)研究表明，基因表達不僅僅是從轉(zhuǎn)錄組到蛋白質(zhì)組的單向流動，而是兩者的相互連接。對這種功能調(diào)控的了解通常只限于特殊的信號途徑，要了解轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組之間的相互調(diào)控作用，就需要對RNA和蛋白質(zhì)的表達進行同步監(jiān)測。正如RNA可作為部分生物學(xué)功能的酶反應(yīng)的效益物一樣，蛋白質(zhì)也是大多數(shù)

2、生物學(xué)功能的效益物。因此，蛋白質(zhì)水平廣泛的基因組分析是基因表達更直接的反映。質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，使得定量的蛋白組學(xué)研究成為可能。然而，當(dāng)細胞適應(yīng)了轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后（如mRNA的剪接）、翻譯后（蛋白降解和輸出）的精細調(diào)控機制后，轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)豐度測量結(jié)果可能會不一致。因此，定量的轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)豐度測量可作為相互的標(biāo)準(zhǔn)，為高通量分析得出的基因表達數(shù)據(jù)做出合理的解釋。正如蛋白質(zhì)和RNA之間類似點可以增加我們對新的生物標(biāo)記的信任度一樣，差異也能暗示我們“其他的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控結(jié)合點可作為重要的調(diào)控研究靶點”。在蛋白組學(xué)分析過程中，一些研究選擇了雙向凝膠電泳（2一DE）分析蛋白質(zhì)混合物。要么是對不同的凝膠染色，要

3、么是讓不同的細胞與不同的染料相結(jié)合，通過斑點染色亮度可以看到蛋白質(zhì)的亮度。隨后用質(zhì)譜儀對分離出的定量凝較斑點進行鑒定，與轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析不同的是，雙向凝膠電泳分析的鑒定結(jié)果與定量分析是散耦合（de一coupled)。液相色譜法（LC）是作為一種替代2一DE的蛋白質(zhì)分析方法而出現(xiàn)的。LC一MS分析是典型的“自下而上（Bottom一up)”分析方法，通常要用特異的蛋白酶（如胰蛋白酶）將蛋白質(zhì)消化為肽段。與2一DE不同，LC一MS對肽的定量和鑒定是同時進行的，可以選擇定量的MS峰（m/z）用于鑒定，通過肽段的信息推測對應(yīng)蛋白質(zhì)的定量信息。雖然采用的技術(shù)不同，迄今為止公開發(fā)表的整合分析文章中，都指出了轉(zhuǎn)錄

4、組學(xué)和蛋白組學(xué)的重要性。轉(zhuǎn)錄組學(xué)或蛋白組學(xué)通常只考慮調(diào)節(jié)系統(tǒng)和分解作用平衡態(tài)的凈效應(yīng)，實際上，出現(xiàn)的不一致性只是合成與降解兩種替換過程中的一種反映?？茖W(xué)家可能對變化過程中的機制更感興趣。正如中心法則預(yù)測的那樣，在轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)水平，如果只能通過嚴(yán)格的轉(zhuǎn)錄調(diào)控去控制蛋白質(zhì)的合成，細胞是不太可能選擇精細調(diào)節(jié)機制的。當(dāng)點對點進行比較時，蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄物之間的一致性通常很弱，這些觀察說明了“從個體基因座的局部分析擴展到功能途徑系統(tǒng)分析”為重要性。轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)都是研究系統(tǒng)的生理化學(xué)狀態(tài)的有用工具。當(dāng)然，沒有一種工具可以為系統(tǒng)提供完全的覆蓋范圍及相應(yīng)的精確度。問題的核心，不是用工具找出mRNA和蛋白質(zhì)

5、之間一對一的相互關(guān)系，而是要用它們區(qū)別出真陽性和假陽性，即區(qū)別出真正的mRNA-蛋白質(zhì)一致性或者是不一致性。沒有這些整體分析，就無法觀察到真正的mRNA-蛋白質(zhì)不一致性，并且這些不一致性要比一致性更吸引科學(xué)家，因為它們透露出的更多的轉(zhuǎn)錄后干涉情況。更重要的是，在轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)水平上的整合表達分析，能對整體的基因-基因相互作用網(wǎng)進行描述，提供單個基因活性中的功能內(nèi)容，這些內(nèi)容會影響到生物學(xué)功能。新的分析軟件工具將幫助研究者儲存在蛋白組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)中新出現(xiàn)的高通量技術(shù)的全部力量。二蛋白質(zhì)組與轉(zhuǎn)錄組比較關(guān)聯(lián)分析研究1蛋白質(zhì)組與轉(zhuǎn)錄組比較關(guān)聯(lián)分析的優(yōu)勢雖然轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組在實驗方法上差異很大，但由于這

6、兩種方法的首要目的都是獲得基因的表達情況，其間存在著某種共同之處。從生物學(xué)角度上看，mRNA水平代表了基因表達的中間狀態(tài)，能代表著潛在的蛋白質(zhì)表達情況。轉(zhuǎn)錄組能在較低消耗下實現(xiàn)較高的通量，并能在某種程度上捉供較詳細的信息。然而蛋白質(zhì)是直接的功能執(zhí)行體，因而，對蛋白質(zhì)表達水平的度量有著不可取代的優(yōu)勢。最近的文獻也明確報道了轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的部分不相關(guān)或負相關(guān)的結(jié)果，并且用統(tǒng)計方法證明了這種顯著差異很大程度上是由生物學(xué)因素造成的，而不僅僅是噪音，說明了基因表達情況不能單純用轉(zhuǎn)錄組的方法解決。由于這兩種不同的表達譜研究手段的不完全性和互補性，現(xiàn)有的研究傾向于綜合轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的研究，目的在于：1)

7、 獲得一個表達譜的“全景圖”，并實現(xiàn)其問的互補和整合，對生物體特定狀態(tài)下的基因和蛋白質(zhì)表達水平進行全方位分析；2) 通過全局上獲得對差異表達譜的廣泛理解，挖掘受轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的關(guān)鍵蛋白基因，尋找驗證某些重要的生物學(xué)調(diào)控，這種研究方式在基礎(chǔ)研究上己經(jīng)有不少報道。3) 對于一些蛋白數(shù)據(jù)庫少的物種，通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)構(gòu)建蛋白質(zhì)搜索庫，大幅度提高蛋白鑒定數(shù)，這同時也是本方案的一大亮點。由于轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的比較關(guān)聯(lián)研究能揭示基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控狀態(tài)，因此，轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組之間的關(guān)系很可能將是未來的系統(tǒng)生物學(xué)研究中不可忽略的一部分。2研究目標(biāo)分析有意向采用多組學(xué)分析策略來研究一些動植物的重要生物過程的調(diào)控機制；

8、己有轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，希望通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)從另一層面去驗證所獲得結(jié)果（如mRNA可變剪接在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的相互驗證）：同時，對所獲得的兩組學(xué)數(shù)據(jù)進行比較關(guān)聯(lián)分析，以期更加深入的探討某種重要的生命調(diào)控機理?？偟膩碇v，本方案的目標(biāo)客戶為已在華大做過轉(zhuǎn)錄組，希望通過進一步深入研究，發(fā)更高點數(shù)文章的客戶：或者是將要做蛋白組轉(zhuǎn)錄組的潛在客戶。三研究方案1材料根據(jù)研究目的，選取不同處理組動植物樣本（某種生物或非生物壓力脅迫誘導(dǎo)、野生型與突變體），分別提取相同組織樣本中的總RNA和總蛋白，即轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組分析所用的樣本盡量保持一致，以最大限度的減小對后續(xù)基因與蛋白差異表達比較分析中所產(chǎn)生的誤差。2蛋白質(zhì)與轉(zhuǎn)錄

9、組比較關(guān)聯(lián)分析的整體方案分別進行轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組兩組學(xué)水平分析，經(jīng)相應(yīng)的生物信息學(xué)分析之后，整合兩組學(xué)的信息分析數(shù)據(jù)進行比較關(guān)聯(lián)研究，具體的方案流程如圖3-l所示。2.1轉(zhuǎn)錄組測序分析1) 技術(shù)路線采用Illumina HiseqTM2000進行轉(zhuǎn)錄組分析（圖3-2)：分別取對照組和處理組樣本（不同時期、不同組織樣本）進行RNA提取，將提取的總RNA分離純化出mRNA，隨機打斷并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，加接頭純化后上機測序，過濾接頭序列、去污染。每個樣本的測序量為4Gb的數(shù)據(jù)。2) 生物信息分析內(nèi)容數(shù)據(jù)處理對原始數(shù)據(jù)進行去除接頭、污染序列及低質(zhì)量reads的處理。標(biāo)準(zhǔn)信息分析（無參考序列）A. 數(shù)據(jù)

10、產(chǎn)出統(tǒng)計及測序數(shù)據(jù)的成分和質(zhì)量評估B. 組裝結(jié)果分析（contig長度分布、Unigene長度分布）C. Unigene功能注釋D. Unigene的GO分類E. Unigene代謝通路分析F. 預(yù)測編碼蛋白框（CDS)G. Unigene表達差異分析（兩個或兩個以上樣品）H. Unigene在樣品間的差異GO分類（需兩個或兩個以上樣品）和Pathway富集性分析標(biāo)準(zhǔn)信息分析（需提供參考基因序列、參考基因組序列及基因注釋結(jié)果）a) 測序評估（比對統(tǒng)計、測序隨機性評估、Reads在基因組上的分布）b) 基因表達注釋（基因覆蓋度、覆蓋深度分布等）c) 基因差異表達分析（兩個或兩個以上樣品）d) 對

11、基因結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化（僅針對真核生物）e) 鑒定基因的可變剪接（僅針對真核生物）f) 預(yù)測新轉(zhuǎn)錄本g) SNP（single nucleotide polymorphism：單核昔酸多態(tài)性）分析（僅針對真核生物）2.2 定量蛋白質(zhì)組分析（iTRAQ)(1) 技術(shù)路線(2) 生物信息學(xué)分析內(nèi)容1) 標(biāo)準(zhǔn)信息分析：2) 數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計及QC評估3) 蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果4) 蛋白質(zhì)定量結(jié)果5) 蛋白質(zhì)GO分析6) 蛋白質(zhì)COG分析7) 蛋白質(zhì)pathway代謝通路分析8) 差異蛋白的GO富集分析9) 差異蛋白的pathway富集分析10) 差異表達蛋白聚類分析2.3 蛋白質(zhì)組與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比較關(guān)聯(lián)分析2.3.1

12、 蛋白質(zhì)組與轉(zhuǎn)錄組測序的組裝結(jié)果關(guān)聯(lián)分析利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來建立蛋白搜索數(shù)據(jù)庫，這將大大提升肽段及蛋白的鑒定數(shù)量。實驗表明，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)建立蛋白搜索數(shù)據(jù)庫，平均可以增加蛋白鑒定數(shù)量2050%，對于一些目前僅發(fā)現(xiàn)少許蛋白序列的物種，采用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)建庫，可以比僅采用NCBInr全庫的鑒定數(shù)據(jù)增加100以上。下圖為利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)建庫和不利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)建庫對比圖。2.3.2 差異蛋白與差異基因表達水平比較關(guān)聯(lián)分析對于上述兩組學(xué)水平研究所獲得的數(shù)據(jù)，首先將鑒定到的所有可靠性蛋白和與之相對應(yīng)的基因的轉(zhuǎn)錄本進行綜合關(guān)聯(lián)比較分析。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)各自的表達變化的定量信息，對關(guān)聯(lián)上的差異表達蛋白和與之相對應(yīng)的差異

13、基因的轉(zhuǎn)錄本進行比較分析。2.3.3 蛋白質(zhì)組與轉(zhuǎn)錄組表達模式聚類分析為了更加直觀地展示兩組學(xué)水平上不同基因或蛋白表達水平的變化情況利用Cluster聚類分析軟件對所獲得的組學(xué)數(shù)據(jù)進行表達量聚類分析，包括l）對所有可定量蛋白質(zhì)及其關(guān)聯(lián)轉(zhuǎn)錄本作表達量關(guān)聯(lián)聚類分析；2）對差異蛋白質(zhì)及其關(guān)聯(lián)轉(zhuǎn)錄本作表達量關(guān)聯(lián)聚類分析。最終分別以不同顏色來表示表達水平的變化情況（一般情況下，紅色-上調(diào)，綠色-下調(diào)，灰色或黑色-表達量無變化）。2.3.4 mRNA可變剪接在轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組兩水平的相互驗證（個性化分析）可變剪接使一個基因產(chǎn)生多個mRNA轉(zhuǎn)錄本，不同mRNA可能翻譯成不同蛋白質(zhì)。因此，通過可變剪接一個基因

14、可能產(chǎn)生多個蛋白，極大地增加了蛋白多樣性（Black, 2003; Stamm, 2005; Lareau, 2004）。雖然己知可變剪接在直核生物中普遍存在，但我們可能仍低估了可變剪接的比例，基于高通量測序的可變剪接研究在小鼠（Tang, 2009; Mortazavi, 2008）、擬南芥（Filichkin）中發(fā)現(xiàn)了很多新的可變剪接事件。在生物體內(nèi)，主要存在7種可變剪接類型：A）Exon skjpping；B)Intron retention；C)Alternative 5 splice cite；D) Alternative 3 splice cite；F)Alternative fi

15、rst exon；F) Alternative last exon；G）Mutually exclusive exon。圖3-7是我們利用高通量測序數(shù)據(jù)鑒別出來的4種可變剪接類型，圖中每個位置的Exp level等于log2（Reads數(shù)）。轉(zhuǎn)錄組Reference分析里有對mRNA可變剪接結(jié)果的預(yù)測，通過mRNA的可變剪接可能會產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)（蛋白序列我們可以根據(jù)核酸序列推斷出來），而我們在蛋白層面對這些新蛋白進行鑒定，從而來驗證轉(zhuǎn)錄組中可變剪切的分析。2.3.5 轉(zhuǎn)錄組和蛋白組GO功能、Pathway的關(guān)聯(lián)比較分析無論是轉(zhuǎn)錄組測序還是蛋白質(zhì)組分析的結(jié)果中，都會給出差異基因或差異蛋白的Pathway代謝通路富集分析結(jié)果，比較關(guān)聯(lián)分析兩組學(xué)水平上的不同的Pathway代謝通路，之后對能關(guān)聯(lián)上的代謝通路中的蛋白/基因的相互對應(yīng)及表達情況進行一致性分析，從而挖掘出通路中幾個代表性的關(guān)鍵基因蛋白，此項分析內(nèi)容需要結(jié)合老師的研究背景，具體情況具體分析。四 小結(jié)1