CO2和二類疏水蛋白之間的相互作用的建模和生理特性

1、CO2與二組疏水蛋白之間的相互作用的建模和生理特性：原始噴涌機(jī)制的新發(fā)現(xiàn)付臣譯自ASBCJ-2012-0905-01摘要：盡管普遍認(rèn)同疏水蛋白和CO2是造成CO2飽和飲料的原始噴涌的原因，但是這個(gè)現(xiàn)象的生物分子機(jī)制并沒有被很好的理解，在此疏水蛋白HFBII已經(jīng)被生產(chǎn)、萃取和純化，一個(gè)噴涌實(shí)驗(yàn)和DLS分析已經(jīng)完成，并允許作者設(shè)計(jì)了一個(gè)MD模擬計(jì)劃以研究CO2分子與HFBII之間的相互作用，結(jié)果預(yù)示CO2分子傾向于聚積在疏水蛋白的疏水補(bǔ)丁上能達(dá)到蛋白質(zhì)其它區(qū)域的兩倍，這就提出了這樣一個(gè)用“納米炸彈”的形成，闡明了原始噴涌機(jī)制的一定的化學(xué)和生理性質(zhì)的模型。關(guān)鍵詞：CO2,噴涌，疏水蛋白，MD模擬，納

2、米氣泡導(dǎo)言在受污染的象啤7S這樣的含有CO2的飲料中，瓶裝啤酒在開瓶時(shí)，不受控制脫氣現(xiàn)象的科學(xué)描述，來自受霉菌污染的有機(jī)物質(zhì)參與，以及涉及圍繞在被加壓的CO2周圍的固體膜及大約100納米（大氣壓力下氣態(tài)CO2的臨界直徑）的球形氣體結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)的假說，都是報(bào)道啤酒原始噴涌機(jī)制的基本陳述。實(shí)際上，所有研究都是說了只言片語，只說原始噴涌的機(jī)制，但并沒有解釋噴涌機(jī)制的生理細(xì)節(jié)。先前的研究暗示溶解的氣態(tài)CO2與疏水蛋白的疏水補(bǔ)丁有關(guān)，這個(gè)相互作用易受純的疏水分子，例如不飽和脂肪酸和一些植物提取物如酒花油的存在的影響。然而，納米氣泡形成的詳細(xì)機(jī)制及關(guān)于在一個(gè)密閉的受污染的壓力容器中發(fā)生了什么的原子假說構(gòu)想仍

3、然沒有被闡明，這種納米結(jié)構(gòu)被定義為納米炸彈，因?yàn)樗鼈儗⒃谄看蜷_時(shí)突然爆發(fā)，因此一個(gè)深入的物理化學(xué)研究被執(zhí)行以研究在水溶液中氣態(tài)的CO2存在下疏水蛋白的行為作用。一組疏水蛋白SC3和同類型的二組疏水蛋白HFBI及HFBII是理解原始噴涌期間發(fā)生的納米規(guī)模變更的基礎(chǔ)事件，疏水蛋白聚集成納米結(jié)構(gòu)的彈性對闡明親-疏水界面的特殊重新修整是必須的。再者，完全有必要理解在潛在污染劑存在的情況下，控制氣態(tài)CO2在水溶液中溶解的物理法則，所以花費(fèi)科學(xué)家25年的時(shí)間去完成一個(gè)解釋液體中納米球面結(jié)構(gòu)逐步形成和瓦解的具體模型是可以理解的。疏水蛋白是真菌引起的蛋白質(zhì)（大約100個(gè)氨基酸，7-15kDa）,通過它們能在疏

4、-親水界面如空氣和水界面形成兩性分子層的能力來定性的，基于在這個(gè)聚集層上的溶解度，疏水蛋白被分成兩組，一組疏水蛋白能夠組裝進(jìn)入蛋白質(zhì)膜成為剛性膜，除非使用強(qiáng)酸否則很難溶于水中，相反二組疏水蛋白自己組裝成一個(gè)單層彈性膜，它可以被試劑或使用壓力解離。原始噴涌看起來主要與二組疏水蛋白有關(guān)，并且報(bào)道較低的數(shù)量（大約3g/L）就足以引起噴涌。疏水蛋白的疏水補(bǔ)丁被猜想是造成和氣態(tài)CO2相互作用，導(dǎo)致具有高彈性的疏水蛋白聚集形成膜而致穩(wěn)定的氣態(tài)CO2納米氣泡的形成的原因。為了理解這樣一個(gè)機(jī)制，要求有一個(gè)計(jì)算技術(shù)的使用，基于經(jīng)典的牛頓物理學(xué)法則，分子動(dòng)力學(xué)模擬用于此研究以了解CO2分子與疏水蛋白HFBII之間

5、在溶劑（水）中自由基鍵合傾向，總之，通過描述HFBII與分子氣態(tài)CO2的密切關(guān)系，MD結(jié)果支持了此實(shí)驗(yàn)結(jié)果及存在納米炸彈的假說。實(shí)驗(yàn)HFBII蛋白的生產(chǎn)里氏木霉MUCL44908在安裝有攪拌器的1升的發(fā)酵桶中25c發(fā)酵7天，含水的培養(yǎng)基由乳糖（40.0g/L）、蛋白陳（4.0g/L）、酵母浸膏（1.0g/L）、KH2P04（4.0g/L）、（NH4）2SO4（2.8g/L）、MgSO2.7H2O（0.6g/L）、CaCl2.2H2O（0.8g/L）及含有FeO4.7H2O（0.5g/L）,CoCl2.6H2O（3.7g/L）、MnSO4.H2O（1.6g/L）和ZnSO4.7H2O（1.4g/

6、L）的微量溶液（2mL/L）組成，用磷酸調(diào)節(jié)PH到4.55.0,最后菌絲體通過離心分離（8,000xg離心25min）,然后上清液在2c下貯存直到將來的分析。萃取步驟后，上清液泡沫分儲(chǔ)，泡沫用一個(gè)親水的聚酯碉過濾器過濾，使用RP-LC來源15RPC色譜柱（4.6X200mm）的液相色譜進(jìn)行純化，用線性梯度（從0至60%,50min）的乙晴以1mL/min的流速進(jìn)行洗脫，并在214nm下進(jìn)行紫外檢測，乙晴為含有0.1%三氟乙酸（TFA）的MilliQ水（millipore公司生產(chǎn)的超純水）溶液。使用帶有一個(gè)UltraflexII儀器的基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間和a-氟基-4-羥基肉桂酸進(jìn)行鑒

7、定，一個(gè)顯微分光光度計(jì)（280nm波長，&=10）用于純化的疏水蛋白HFBII的最終定量。噴涌實(shí)驗(yàn)和DLS分析噴涌實(shí)驗(yàn)和動(dòng)態(tài)光散射（DLS）分析按以前描述的方式進(jìn)行，研究了在封閉的系統(tǒng)中氣態(tài)CO2存在的情況下二組疏水蛋白的行為，為此一定數(shù)量有純HFBII被加入冷卻到2c的蘇達(dá)水（7g/LCO2）中，以使HFBII的最終濃度等于0、4.5、9和18g/L,然后進(jìn)行噴涌實(shí)驗(yàn)，并收集溢出泡沫進(jìn)一步用DLS進(jìn)行分析。MD模擬參數(shù)超高分辨率的晶體結(jié)構(gòu)2B97被用于模擬二組疏水蛋白的隨時(shí)間變化的行為，這個(gè)晶體結(jié)構(gòu)是一個(gè)含有兩個(gè)鏈，A和B鏈的二聚體構(gòu)造，在此只獲得A鏈，鈕離子和水分子去除的也很好，疏

8、水蛋白是一個(gè)中性結(jié)構(gòu)，因此沒有抗平衡離子被加入系統(tǒng)，氨基酸適當(dāng)?shù)馁|(zhì)子化狀態(tài)用MOE分子操作環(huán)境軟件中的質(zhì)子化3D工具來核實(shí)。蛋白質(zhì)被放在一個(gè)十二面體的盒子中，蛋白質(zhì)與盒邊的距離設(shè)定為0.85nm,以確保在MD擬態(tài)期間蛋白質(zhì)不與它們的影像相互作用，考慮到這些設(shè)定，盒子的總體積大約為90nm3,9個(gè)CO2分子被隨便加入盒中，殘余部分用2525TIP3P水分子填充，整個(gè)系統(tǒng)（蛋白質(zhì)、水和CO2）大約包含9000個(gè)原子。MD模擬所有模擬都用與OPLS-AA力場連接在一起的GROMACS包完成，CO2分子的部分電荷在先前的研究中得到的，通過執(zhí)行2000步的最速下降及接下來的2000共腕梯度能最小值，系統(tǒng)

9、松弛下來。兩次平衡被完成，首先是100Ps的等容（NVT系綜），然后是100Ps的恒壓（NPT系綜），在平衡步驟期間，所有重蛋白原子都被位限固定，接下來位限固定被去除，系統(tǒng)在NPT系綜下被模擬100ns,每4Ps貯存一個(gè)系統(tǒng)快照，通過使用0.1ps耦合常數(shù)的V-rescale恒溫調(diào)節(jié)器及分別耦合蛋白質(zhì)和溶劑，模擬溫度保持恒定為外部水浴溫度298K。通過分別耦合蛋白質(zhì)和溶劑及使用1ps耦合常數(shù)的Parrinello-Rahman恒壓調(diào)節(jié)器，使模擬壓力保持外部水浴壓力在4atm。網(wǎng)絡(luò)粒子埃瓦爾德法被用于長程靜電學(xué)計(jì)算，一個(gè)1.4nm的近路用于范德華力。LINCS運(yùn)算法則用于通過限制系統(tǒng)內(nèi)所有結(jié)合力

10、以確保有一個(gè)2fs的積分步長。測量我們計(jì)算了疏水補(bǔ)丁附近10?球體內(nèi)每？2可及表面積CO2分子的數(shù)量，同剩余蛋白質(zhì)表面積相比較，下面的18個(gè)殘余物被定義為疏水補(bǔ)?。篏ly6、Leu7、Leu12、Val18直到Val24、Val54直到Ala58、Ala61直到Cys64。結(jié)果和討論fHFBII的特性純化期間生成的RP-LC色譜圖的例子顯示在圖1中，使用MALDI-TOF分析了幾個(gè)微分后，獲得了分子量為7.042kDa的物質(zhì)，這與缺少末位氨基酸的HFBII分子完全相符，此蛋白質(zhì)被收集在40-50%的ACN中，末位氨基酸的去除能被解釋為生物降解，因?yàn)榇诵Ч惨呀?jīng)在毒枝毒素中觀察到。對于所有包含H

11、FBII疏水蛋白的瓶子，噴涌實(shí)驗(yàn)和DLS分析（圖2）都是陽性的，像Deckers等人描述的一樣，當(dāng)至少100nm直徑（即大氣壓下氣態(tài)CO2分子的臨界直徑）的微粒被檢測時(shí)，DLS分析是陽性的，此直徑考慮到了用在MD實(shí)驗(yàn)中的CO2分子數(shù)量的測定。分子動(dòng)力學(xué)模擬盡管噴涌在不同的碳酸飲料中也已經(jīng)被描述過，但它對于啤酒來說是有最重大意義的，疏水蛋白和CO2是導(dǎo)致原始噴涌的兩個(gè)主要因素，當(dāng)HFBII被加到蘇達(dá)水時(shí)，正如在啤酒中一樣觀察到了噴涌，噴涌機(jī)制中重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)了疏水蛋白和CO2兩者的作用。盡管現(xiàn)在廣泛認(rèn)為疏水蛋白是導(dǎo)致噴涌的主要因子，但我們在此建議CO2扮演了更主要的作用，如果碳酸飲料被裝于PET瓶中，

12、隨時(shí)間的推移觀察到噴涌完全消失，此效果能解釋為PET瓶易滲出CO2,這導(dǎo)致CO2減少而最終阻止了噴涌潛勢。當(dāng)CO2溶解在水中，便產(chǎn)生下面的平衡：I壇1%C03te）.、COJd）+HjO,>H2COi.>HCO/*H*CO+2H*Kh是亨利常數(shù)，Ks是溶解常數(shù)，Ka1和Ka2代表碳酸的兩個(gè)離解常數(shù)。二氧化碳與水分子起化學(xué)反應(yīng)形成碳酸，碳酸是不穩(wěn)定的雙質(zhì)子酸，反應(yīng)性明顯促進(jìn)了二氧化碳的溶解，溶解常數(shù)在25c下等于1.7X10-3,但是H2CO3濃度取決于PH,在PH7.0情況下，80%的碳酸解離為HCO3，在25c下Ka1=6.4。為了獲得大約7g/L的CO2濃度，如亨利法則陳述的要

13、施加壓力提高CO2的溶解度，CO2在水中溶解越多，碳酸形成越多，解離的HCO3也越多，同時(shí)提高了H+濃度導(dǎo)致了PH降低。當(dāng)PH降低到比Kai值低時(shí)，平衡將向左移動(dòng)，碳酸最終變成CO2,蘇達(dá)水有終PH為4.0以致于主要的物質(zhì)都是溶解的CO2,啤酒的情形也沒有太大區(qū)別，啤酒認(rèn)為是一種磷酸緩沖液，有PH4.0-4.3,平衡也直接向溶解的CO2進(jìn)行。先前為了研究疏水蛋白的行為例如可折疊的及與疏水-親水表面相互作用的行為，進(jìn)行了多個(gè)MD模擬實(shí)驗(yàn)。在此我們進(jìn)行了MD模擬以研究CO2聚集在溶劑中二組疏水蛋白的疏水補(bǔ)丁上，此補(bǔ)丁包含專一的疏水脂肪族側(cè)鏈，在中央的B-桶結(jié)構(gòu)中形成兩個(gè)環(huán)形區(qū)域。作為一個(gè)核實(shí)CO2

14、參數(shù)的初始實(shí)驗(yàn)，170個(gè)CO2分子和2641個(gè)水分子被隨機(jī)加到約90nm3盒子中，系統(tǒng)被模擬100ns,象預(yù)期的一樣，疏水的CO2分子快速地?cái)U(kuò)散并在系統(tǒng)中形成聚集體，這個(gè)在10ns聚集的一個(gè)例子顯示在圖3中。接下來，帶有HFBII疏水蛋白、CO2和水分子的系統(tǒng)被模擬100ns,此模擬只有水分子而沒有其它成分目的是研究最簡單的模式，圖4顯示在疏水補(bǔ)丁的鄰近區(qū)域內(nèi)（10?）CO2分子的數(shù)量，在整個(gè)軌線期每？2的ASA的CO2數(shù)量都被計(jì)算，并與蛋白質(zhì)的其它區(qū)域進(jìn)行對比，能看出疏水補(bǔ)丁的鄰近區(qū)域，每？2的ASA的CO2分子數(shù)量多于蛋白表面的其它區(qū)域兩倍，這個(gè)效果在20ns模擬時(shí)間后最強(qiáng)，這被看作需要一

15、個(gè)平衡時(shí)間使CO2分子聚集在蛋白質(zhì)表面上。圖5說明CO2聚集體存在，鍵合在蛋白質(zhì)的疏水補(bǔ)丁上，疏水補(bǔ)丁本身就有使疏水的CO2分子緊緊地聚集到蛋白質(zhì)表面的趨勢，能猜想到更多的疏水蛋白存在下這個(gè)效果將會(huì)被加強(qiáng)，并彼此聚合由此增加疏水補(bǔ)丁區(qū)域，并減少和蛋白質(zhì)其它區(qū)域的接觸，從模擬實(shí)驗(yàn)也看出CO2鍵合并沒有特定發(fā)生在疏水補(bǔ)丁上，而且在蛋白質(zhì)的其它疏水區(qū)域也發(fā)生了，如圖5看到的一樣，可能在多量的疏水蛋白低聚反應(yīng)下，這些區(qū)域能被掩埋，從而減少了CO2在這些位置的鍵合。值得注意的是，在模擬期間某些CO2分子在疏水蛋白的內(nèi)腔被捕獲，并封存在蛋白質(zhì)內(nèi)。納米氣泡形成和噴涌機(jī)制在CO2和疏水蛋白之間的強(qiáng)相互作用導(dǎo)致

16、了噴涌現(xiàn)象需要的穩(wěn)定的納米氣泡的形成，在一個(gè)封閉容器中，這些穩(wěn)定的納米氣泡的形成能在6個(gè)連續(xù)的階段被描述（圖6）0在第一階段，被CO2污染的疏水蛋白和沒有被污染的疏水蛋白都存在于液體中；第二階段，由于疏水蛋白是兩性分子，它們遷移到疏水-親水液-氣界面，在界面上由于與大氣中CO2接觸都被污染；第三階段，疏水蛋白在界面上自我組合，當(dāng)臨界濃度到達(dá)時(shí)形成水晶單層。提供能量（例如搖動(dòng)）給這個(gè)封閉系統(tǒng)將會(huì)打破通過亨利法規(guī)建立的這個(gè)平衡，并且疏水蛋白薄層進(jìn)入液體，這將導(dǎo)致瓶子的親水玻璃壁與疏水蛋白層的親水部分之間相互吸引，并且通過氣態(tài)CO2的聚集，疏水部分將扮演一個(gè)納米氣泡形成的停泊地或加油站。事實(shí)上，為了

17、回到平衡，在氣相和液相間CO2分子的交換發(fā)生了，由于它們能減少表面張力從72mJ/m2到30mJ/m2的能力，也因?yàn)樗鼈兊慕Y(jié)構(gòu)彈性，二組疏水蛋白能聚集氣態(tài)CO2分子，并且最終通過由Young-Laplace法則引起的側(cè)向力形成穩(wěn)定的納米氣泡。納米氣泡形成后，噴涌現(xiàn)象能被在5個(gè)階段考慮，在一個(gè)封閉的瓶子中、瓦解和爆炸、晶核形成、起泡和脫氣。在密閉瓶子中，被疏水蛋白的結(jié)晶層穩(wěn)定的氣態(tài)CO2納米氣泡與啤酒隔絕，穩(wěn)定的納米氣泡的內(nèi)壓力等于瓶內(nèi)壓（4bar左右），在打開瓶子時(shí)，這些被增壓的納米氣泡將扮演納米炸彈的角色。當(dāng)瓶子打開時(shí)，壓力下降導(dǎo)致彈性的疏水蛋白結(jié)構(gòu)瓦解及納米氣泡爆炸，爆炸提供了晶核形成的能

18、量，并且溶解的CO2釋放，由爆炸引起的氣泡代表了局部有較高的氣態(tài)CO2濃度，由于啤酒中過飽和的CO2的擴(kuò)散使氣泡越來越多，當(dāng)它們上升到表面，增長的氣泡吸引蛋白質(zhì)并產(chǎn)生溢泡現(xiàn)象，如果溢泡及殘余飲料任其在大氣壓下脫氣，通過直徑等于大氣壓下臨界直徑，被疏水蛋白薄層穩(wěn)定的納米氣泡將被改造，這通過DLS分析能發(fā)現(xiàn)。結(jié)論為了揭示原始噴涌機(jī)制的生理細(xì)節(jié)，首次進(jìn)行了MD模擬實(shí)驗(yàn)，通過此技術(shù)我們證實(shí)在CO2的二組疏水蛋白之間的疏水相互作用導(dǎo)致了CO2納米炸彈的形成，此納米炸彈有在壓力釋放時(shí)劇烈起泡的能力，這些發(fā)現(xiàn)讓我們認(rèn)為這些納米炸彈以這樣幾個(gè)步驟形成：首先，疏水蛋白被CO2污染；第二，疏水蛋白遷移到界面；然后

19、當(dāng)達(dá)到臨界濃度時(shí)結(jié)晶化，接下來通過提供能量給系統(tǒng)，由于平衡被打破，CO2分子交換，最后納米氣泡形成。補(bǔ)充數(shù)據(jù)為了精確模擬疏水蛋白HFBII和CO2分子之間的相互作用，放在盒子中用于MD模擬的CO2分子的數(shù)量必須被計(jì)算，這些計(jì)算以DLS實(shí)驗(yàn)和在大氣壓下CO2納米氣泡顆粒大小的觀察為基礎(chǔ)，這里給出了詳細(xì)的計(jì)算：計(jì)算S1:詳細(xì)計(jì)算放在盒子里用于MD模擬的CO2分子的數(shù)量由于通過DLS檢測到CO2分子在1大氣壓下（也就是開瓶狀態(tài)下）的臨界直徑是100nm,一個(gè)氣泡的體積等于：Vlaim=xr3=524x10，nmJ通過氣體一般法則的運(yùn)用，一個(gè)氣泡的體積及CO2在4atm下的臨界直徑能按以下方式測定出來

20、：Be X 卅Platm X V 1atm“ Laim 入 * 1 latm常數(shù)u4atm A 14atmPXV4atm= 31.5nm=>d4attn=63nmCO2分子的體積（VCO2）估算為1.35nm3,結(jié)合氣泡的體積（V4atm）和CO2分子的體積，在一個(gè)氣泡中CO2分子的數(shù)量按以下方式估算：y一個(gè)氣泡中CO2分子的數(shù)量=芽上=97,000個(gè)分子。這個(gè)數(shù)量必須轉(zhuǎn)換為用于模擬中的盒子的尺寸，知道氣泡的表面積（S4atm）,知道HFBII疏水補(bǔ)丁的溶劑可近區(qū)域是7.4nm2,假定只有2/3的氣泡表面積被覆蓋，覆蓋氣泡表面的疏水單體數(shù)量按以下方式測定：S4Mm=4立x4凱m=L2x10nm2S,覆蓋一個(gè)氣泡的HFBII單體的數(shù)量=|,081那么在4atm下，CO2與HFBII的比率等于一個(gè)氣泡中CO2分子的數(shù)量比率=90覆蓋一個(gè)氣泡的HFBII數(shù)量意