曲線測(cè)試實(shí)驗(yàn)流程

1、IC50 曲線的測(cè)定IC50即半抑制率， 標(biāo)準(zhǔn)曲線是一個(gè)S型曲線。IC50為50%抑制濃度即細(xì)胞存活量為對(duì)照樣本一半時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度，半數(shù)抑制越低，說(shuō)明藥物對(duì)細(xì)胞的毒性越高。實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：1. 細(xì)胞準(zhǔn)備：A 細(xì)胞狀態(tài)檢測(cè)：從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，顯微鏡下觀察。狀態(tài)描述：觀察結(jié)果，細(xì)胞匯合度：B 細(xì)胞處理：將細(xì)胞培養(yǎng)基吸出后，加入2ml PBS緩沖液洗一次，加入1ml 0.25% Trypsin-EDTA，放入培養(yǎng)箱中靜置數(shù)分鐘，直至細(xì)胞完全離壁懸浮，加入5ml 含10%FBS的培養(yǎng)基(無(wú)抗生素)終止酶活，混勻后液體轉(zhuǎn)移至15ml離心管，1000rpm 離心3min，棄去液體。C 細(xì)胞計(jì)數(shù)：于15

2、ml離心管中加入1ml 含10%FBS的培養(yǎng)基 (無(wú)抗生素)，充分混勻。取40ul計(jì)數(shù)，公式如下：細(xì)胞濃度（數(shù)/ml）=（4大方格細(xì)胞數(shù)之和/4）×104×稀釋倍數(shù)最終得到的細(xì)胞密度填入下表，根據(jù)最終需要細(xì)胞濃度及體積進(jìn)行稀釋。細(xì)胞 數(shù)/孔 起始濃度(/ml)所需體積(ml)需20%FBS DMEM (ml)總體積終濃度(/ml)細(xì)胞株名D 稀釋細(xì)胞2. 將稀釋好的細(xì)胞用排槍加至96 / 384孔板：置于培養(yǎng)箱37 5%CO2條件下培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞貼壁后加藥。3. 藥物稀釋?zhuān)簩⑺幬镞M(jìn)行3倍倍比稀釋。4. 將稀釋好的藥物加入前一天鋪好細(xì)胞的細(xì)胞板上，37 5%CO2培養(yǎng)箱

3、培養(yǎng)72h。5. 熒光素酶檢測(cè)：將Celltiter-Glo與ddH20 以1:1混合，加入細(xì)胞板（96板：20ul/well; 384板：10ul/well），靜置10min后，TECAN infinite F200酶標(biāo)儀讀值。6. 分析數(shù)據(jù)，繪制IC50曲線，尋找IC30,IC50等值。7. 驗(yàn)證IC50:根據(jù)IC50曲線找出IC50理論值，分別取1/2 倍、1倍及2倍的理論值進(jìn)行藥物濃度驗(yàn)證。附錄：Materials for ExperimentNameCorporation96-well plateCorning384-well plateGreinerCentrifugeTube (

4、15ml)BD FalconPipets(10ml)GreinerT-25 FlaskCorningTips,EP TubeAxygen, MatrixReagents for ExperimentNameCorporationFBSExcellDPBSHyclone0.25%Trypsin-EDTAGIBCOMediumHycloneCell-Titer GloPromegaInstruments for ExperimentNameModelCorporationInverted MicroscopeTS100NikonCO2 IncubatorBB16UVHeraeusBechtopZHJH-1109ZHCHENGCentrifuge5