藥物遺傳毒性研究技術指導原則

1、附件藥物遺傳毒性研究技術指導原則一、概述遺傳毒性研究（Genotoxicity Study）是藥物非臨床安全性評價的重要內容，與其他研究尤其是致癌性、生殖毒性等研究有著密切的聯(lián)系，是藥物進入臨床試驗及上市的重要環(huán)節(jié)。擬用于人體的藥物，應根據(jù)受試物擬用適應癥和作用特點等因素考慮進行遺傳毒性試驗。遺傳毒性試驗是指用于檢測通過不同機制直接或間接誘導遺傳學損傷的受試物的體外和體內試驗，這些試驗能檢測出DNA損傷及其損傷的固定。以基因突變、較大范圍染色體損傷或重組形式出現(xiàn)的DNA損傷的固定，通常被認為是可遺傳效應的基礎，并且是惡性腫瘤多階段發(fā)展過程的重要因素（惡性腫瘤發(fā)展變化是一個復雜的過程，遺傳學改變

2、可能僅在其中起部分作用）。染色體數(shù)目的改變也與腫瘤發(fā)生有關，并可提示生殖細胞出現(xiàn)非整倍體的可能性。在遺傳毒性試驗中呈陽性的化合物為潛在的人類致癌劑和/或致突變劑。由于在人體中已建立了某些致突變/遺傳毒性化合物的暴露與致癌性之間的相關性，而對于遺傳性疾病尚難以證明有類似的相關性，因此遺傳毒性試驗主要用于致癌性預測。但是，因為生殖細胞突變與人類疾病具有明確的相關性，所以也應同樣重視化合物引起潛在可遺傳性效應的風險。此外，遺傳毒性試驗結果可能對致癌性試驗的結果分析有重要作用。因此，在藥物開發(fā)的過程中，遺傳毒性試驗的目的是通過一系列試驗來預測受試物是否有遺傳毒性，在降低臨床試驗受試者和藥品上市后使用人

3、群的用藥風險方面發(fā)揮重要作用。本指導原則重點闡述遺傳毒性試驗的基本原則，介紹標準試驗組合方案，闡述體內外試驗的基本原則，以及對試驗結果的分析評價與追加研究策略。本指導原則適用于中藥、天然藥物和化學藥物。二、基本原則（一）實驗管理藥物遺傳毒性試驗必須執(zhí)行藥物非臨床研究質量管理規(guī)范（GLP）。（二）具體問題具體分析遺傳毒性試驗的設計，應該在對受試物認知的基礎上，遵循“具體問題具體分析”的原則。應根據(jù)受試物的結構特點、理化性質、已有的藥理毒理研究信息等選擇合理的試驗方法，設計適宜的試驗方案，并試驗結果進行全面的分析與評價。（三）隨機、對照、重復遺傳毒性試驗應符合毒理學試驗隨機、對照、重復的基本原則。

4、三、基本內容（一）受試物中藥、天然藥物：受試物應采用能充分代表臨床試驗擬用樣品和/或上市樣品質量和安全性的樣品。應采用工藝路線及關鍵工藝參數(shù)確定后的工藝制備，一般應為中試或中試以上規(guī)模的樣品，否則應有充分的理由?；瘜W藥物：受試物應采用工藝相對穩(wěn)定、純度和雜質含量能反映臨床試驗擬用樣品和/或上市樣品質量和安全性的樣品。受試物應注明名稱、來源、批號、含量（或規(guī)格）、保存條件、有效期及配制方法等，并提供質量檢驗報告。試驗中所用溶媒和/或輔料應標明名稱、標準、批號、有效期、規(guī)格和生產單位等，并符合試驗要求。應進行受試物樣品分析，并提供樣品分析報告。在藥物研發(fā)的過程中，若受試物的工藝發(fā)生可能影響其安全性

5、的變化，應進行相應的安全性研究。（二）標準試驗組合對藥物而言，需對潛在的遺傳毒性進行全面評價。遺傳毒性試驗方法有多種，根據(jù)試驗檢測的遺傳終點，可將檢測方法分為三大類，即基因突變、染色體畸變、DNA損傷；根據(jù)試驗系統(tǒng)，可分為體內試驗和體外試驗。由于沒有任何單一試驗方法能檢測出所有的與腫瘤發(fā)生相關的遺傳毒性機制，因此，通常采用體外和體內試驗組合的方法，以全面評估受試物的遺傳毒性風險。這些試驗相互補充，對結果進行判斷時應綜合考慮。標準試驗組合應反映不同遺傳終點，包括體內和體外試驗，應包含以下內容：（1）應包含細菌回復突變試驗（又稱Ames試驗）。該試驗已證明能檢出相關的遺傳學改變和大部分嚙齒類動物和

6、人類的遺傳毒性致癌劑。（2）應包含哺乳動物細胞體外和/或體內試驗。哺乳動物細胞體外試驗中，體外中期相染色體畸變試驗、體外微核試驗、體外小鼠淋巴瘤L5178Y細胞Tk基因突變試驗（簡稱小鼠淋巴瘤細胞試驗，MLA）已經過充分驗證并廣泛應用，且同樣適合于檢測染色體損傷。若實驗室對這些方法已進行了充分的驗證，當用于標準試驗組合中時，這幾個試驗可互相替換。體內試驗具有考慮到如吸收、分布、代謝、排泄等因素的優(yōu)勢，并且可檢出體外試驗無法檢出的某些遺傳毒性物質（注釋1），因此標準試驗組合應至少包含一項體內試驗?？刹捎脟X類動物造血細胞染色體損傷試驗（包括骨髓或外周血紅細胞微核試驗、骨髓中期相細胞染色體畸變試驗

7、）或其他合適的體內試驗。組合一：（1）一項細菌回復突變試驗；（2）一項檢測染色體損傷的體外細胞遺傳學試驗（體外中期相染色體畸變試驗或體外微核試驗），或一項體外小鼠淋巴瘤細胞Tk基因突變試驗；（3）一項體內遺傳毒性試驗，通常為嚙齒類動物造血細胞染色體損傷試驗，用于檢測微核或中期相細胞染色體畸變。組合二：（1）一項細菌回復突變試驗；（2）采用兩種不同組織進行的體內遺傳毒性試驗，通常為一項嚙齒類動物造血細胞微核試驗和第二項體內試驗。以上兩種試驗組合同等適合（注釋2），可根據(jù)受試物特點自主選擇。體內試驗可采用單次給藥或重復給藥的試驗設計。如果試驗設計科學合理，采用重復給藥時可將遺傳毒性終點指標整合入一

8、般毒性試驗中；當在體內評價一項以上的遺傳毒性終點指標時，也可將它們整合在一項試驗中。但是，整合的前提條件是試驗設計（例如劑量、采樣）對于重復給藥試驗是合適的，并且需要獲得充分的支持信息。完成上述任何一種標準試驗組合，若試驗結果為陰性，通常可提示受試物不具有遺傳毒性。對于標準試驗組合結果為陽性的受試物，根據(jù)其治療用途，可能需要進一步的試驗。標準試驗組合不包含為檢測非整倍體而設計的特定試驗。但是，檢測中期相細胞染色體畸變的體外和體內試驗可檢測多種類型的染色體完整性方面的改變，微核試驗具有檢測某些非整倍體誘導劑的能力，小鼠淋巴瘤細胞試驗也可檢測染色體丟失（可能導致非整倍體）。建議采用標準試驗組合并不

9、意味著其他遺傳毒性試驗不合適，這些試驗可作為標準試驗組合以外的供選試驗，用于對標準試驗組合得到的遺傳毒性試驗結果的進一步研究。在某些情況下，標準試驗組合中的一項或多項試驗對于受試物不適合或因技術原因無法實施時，可采用其他經過驗證的試驗作為替代試驗，但應提供充分的科學合理性及依據(jù)。附錄部分簡介標準試驗組合中常用的幾種試驗方法，該部分內容只是基本原則，試驗時應根據(jù)具體情況具體分析，合理設計。標準試驗組合在一些特殊情況下不適合，需要根據(jù)情況進行調整。（1）當受試物對細菌有高毒性時（如某些抗生素），仍應進行細菌回復突變試驗，因為致突變性可能出現(xiàn)在較低的、毒性較小的濃度。同時，還應進行一項體外哺乳動物細

10、胞試驗，即采用標準試驗組合一。（2）標準試驗組合通?？蓹z出具有遺傳毒性作用警示結構的受試物（注釋3），因為大部分“警示結構”被定義為與細菌誘變性有關。但是，對于具有某些特殊警示結構的化合物，需要對標準組合方案進行調整（注釋4）。附加試驗的選擇或方案的調整取決于這些具有警示結構受試物的化學性質、已知活性和代謝信息。（3）某些特殊的受試物，如一些放射影像劑、抗酸鋁合劑、一些吸入用藥、一些皮膚或其他局部用藥，毒代或藥代動力學研究提示其不被全身吸收，因此在體內遺傳毒性試驗中無法到達靶組織（注釋5）。對于這些受試物，體內試驗（尤其是骨髓、血液、肝臟）難以提供有用的信息。在改變給藥途徑也不能提供足夠的靶組

11、織暴露，且對暴露量最高的組織無合適的遺傳毒性試驗的情況下，僅根據(jù)體外試驗進行評價可能是合適的。某些情況下，采用接觸部位評價遺傳毒性作用可能也是合理的，盡管這些試驗尚未廣泛應用（注釋6）。遺傳毒性對生殖細胞的影響也極其重要。標準試驗組合中不包含專門檢測生殖細胞誘變劑的試驗。但是，比較研究結果顯示，從定性的角度，大多數(shù)生殖細胞誘變劑能在體細胞試驗中檢出，因此體內體細胞遺傳毒性試驗的陰性結果通?？商崾臼茉囄飳ι臣毎麩o影響。體內體細胞試驗結果為陽性時，在綜合評價及指導用藥時應關注受試物對生殖細胞的影響。（三）體外、體內試驗基本要求遺傳毒性的體內外試驗方法較多，本指導原則僅討論常用方法及需要重點關注的

12、問題，試驗時需具體情況具體分析。無論體外、體內試驗，方法學均應經過充分驗證。各實驗室應建立歷史背景對照數(shù)據(jù)庫（包括陰性和陽性對照數(shù)據(jù)庫）。1.1 細菌回復突變試驗中采用的菌株細菌回復突變試驗至少應采用5種菌株，包括用于檢測組氨酸靶基因中鳥嘌呤-胞嘧啶（G-C）位點堿基置換或移碼突變的4種組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌（TA98；TA100；TA1535；TA1537/TA97/ TA97a），以及用于檢測組氨酸或色氨酸基因中腺嘌呤-胸腺嘧啶（A-T）位點堿基置換與檢測交聯(lián)劑的鼠傷寒沙門氏菌TA102或埃希氏大腸桿菌WP2 uvrA或埃希氏大腸桿菌WP2 uvrA （pKM101）。1.2 體外

13、試驗中最高濃度的確定（注釋7） 體外試驗中受試物的最高濃度主要取決于受試物對細菌/細胞的毒性和溶解度。對不受溶解度或細胞毒性限制的受試物，細菌回復突變試驗應達到的最高濃度為5mg/皿（液體受試物為5µl/皿），哺乳動物細胞試驗為1mM 或0.5mg/ml（選用較低者）。在遺傳毒性體外試驗中，某些遺傳毒性致癌劑只有在檢測濃度高達可產生一定程度的細胞毒性時才可檢出，但毒性過高又會影響對相應的遺傳終點進行恰當?shù)脑u價。當哺乳動物細胞存活率很低時，一些遺傳毒性以外的作用機制如細胞毒性（如與細胞凋亡、溶酶體釋放核酸內切酶等有關的結果）會導致遺傳毒性假陽性結果，這種情況常發(fā)生于受試物濃度達到毒性閾

14、濃度時。鑒于以上情況，在體外細菌和哺乳動物細胞試驗中，目前可接受以下的細胞毒性水平（濃度不應超過1.2.1中的規(guī)定）：（1）細菌回復突變試驗中，進行評價的濃度應能顯示明顯的毒性，如回復突變菌落數(shù)目減少、背景菌苔減少或消失。（2）哺乳動物細胞體外遺傳學試驗中，最高濃度產生的細胞毒性應約為50%。（3）對于小鼠淋巴瘤細胞Tk基因突變試驗，最高濃度產生的細胞毒性應為80%90%。用細菌和哺乳動物細胞遺傳毒性試驗檢測某些受試物時，在不溶解的濃度范圍內也能檢測出劑量相關性的遺傳毒性。建議采用以下策略檢測相對不溶的受試物：（1）對于細菌回復突變試驗，如果沉淀不干擾計數(shù)，應對產生沉淀的濃度進行計數(shù)，且最高濃

15、度不超過5mg/皿或5µl/皿。當未觀察到細菌毒性時，應以產生沉淀的最低濃度作為計數(shù)的最高濃度；當觀察到劑量相關的細菌毒性或誘變性時，應按上述細胞毒性的要求來確定最高濃度。（2）對于哺乳動物細胞試驗，若沉淀不干擾計數(shù)，最高濃度應是培養(yǎng)液中產生最少可見沉淀的最低濃度。應通過肉眼觀察或鏡檢等方法來觀察記錄沉淀在培養(yǎng)過程中持續(xù)存在或培養(yǎng)過程中出現(xiàn)（至處理結束時）。1.3 體外試驗的重現(xiàn)性體外試驗應關注重現(xiàn)性。當采用新方法或試驗出現(xiàn)非預期結果時，有必要進行重復試驗。但是，當采用標準的、已廣泛應用的常規(guī)體外試驗方法時，若這些試驗經過了充分驗證且進行了有效的內部質量控制，得到明確的陽性或陰性結果

16、，通常不需要重復試驗。但是，若得到可疑結果，則需要進一步試驗。2.1 檢測染色體損傷的體內試驗采用骨髓細胞分析染色體畸變或檢測含微核的嗜多染紅細胞的體內試驗方法均可用于檢測染色體斷裂劑。由于細胞分裂后期的一個或多個染色體相對滯后也能形成微核，因此微核檢測方法也能檢測一些非整倍體誘導劑（注釋8）。大鼠和小鼠均適用于骨髓微核試驗。微核也可通過小鼠外周血中未成熟紅細胞（如嗜多染紅細胞）或大鼠血液新生網織紅細胞測定（注釋9）。同樣，也可使用已證明了對檢測斷裂劑/非整倍體誘導劑具有足夠靈敏度、來源于其他種屬動物的骨髓或外周血的未成熟紅細胞。除人工鏡檢方法外，若方法學經過了充分驗證，也可采用自動化分析系統(tǒng)

17、（如圖像分析系統(tǒng)和流式細胞術）對微核進行檢測。嚙齒類動物給藥后，取外周血淋巴細胞進行體外培養(yǎng)，也可用于分析染色體畸變（注釋10）。2.2 其他體內遺傳毒性試驗第二項體內試驗可作為第二種標準試驗組合的一部分，并可用作追加試驗以在評價體外或體內試驗結果時提高證據(jù)權重（注釋11）。體內組織和試驗的選擇應根據(jù)多種因素來確定，例如受試物可能的作用機制、體內代謝特征或者被認為是相關的暴露組織等信息。由于肝臟的暴露和代謝能力，肝臟是代表性的首選組織。第二種體內試驗經常以評價DNA損傷為終點指標作為替代終點。目前，已有大量應用經驗的試驗包括：DNA鏈斷裂試驗如單細胞凝膠電泳試驗（彗星試驗）和堿洗脫試驗、轉基因

18、小鼠體內突變試驗、DNA共價結合試驗。2.3 體內試驗的給藥途徑一般情況下，給藥途徑應與臨床擬用途徑一致。若不一致，應說明理由。但是，為獲得全身暴露，在適當時可進行調整，如局部給藥的受試物。2.4 體內試驗嚙齒類動物性別的選用短期給藥（通常是給藥13次）的體內遺傳毒性試驗一般可單用雄性動物。若已有的毒性、代謝或暴露資料提示在所用動物種屬上存在毒理學意義的性別差異，則應采用兩種性別的動物。當遺傳毒性試驗整合在重復給藥毒性試驗中時，應對兩種性別動物進行采樣，如果毒性、代謝方面沒有明顯性別差異，可僅對單一性別進行評價。如果受試物擬專用于單一性別，可選用相應性別的動物進行試驗。2.5 體內試驗的劑量選

19、擇（注釋7）通常應對有代表性的三個劑量水平進行分析檢測。對于短期試驗（通常是給藥13次），推薦的最高劑量是：限度劑量2000mg/kg（若可耐受），或最大耐受量（為產生毒性的劑量，而基于同樣的給藥方案，比該劑量稍高即預期會出現(xiàn)死亡）。劑量選擇時還應考慮骨髓紅細胞生成的抑制。最高劑量之下的其他劑量一般劑量間距為約23倍。對于多次給藥試驗，分為兩種情況：（1）當采用標準試驗組合一時，若該試驗整合在重復給藥毒性試驗中，如果該重復給藥毒性試驗符合支持人體臨床試驗的一個充分試驗的標準，則通常認為對于遺傳毒性評價劑量是合適的，該原則適用于體外哺乳動物細胞試驗結果為陰性或不相關的陽性時。（2）當進行追加試驗

20、或當采用標準組合二時，應對多種因素進行評價以確定高劑量是否適合用于遺傳毒性評價。毒性試驗（尤其是大鼠試驗）的高劑量需滿足以下任何一條標準，才可用于遺傳毒性評價：最大給藥量，基于受試物在溶劑中的理化性質。對于給藥14天或更長時間的試驗，如果能耐受，限度劑量為1000 mg/kg。最大可能暴露量，通過達到暴露峰值/穩(wěn)態(tài)或受試物的蓄積來證明。若受試物的暴露量隨給藥時間增加而明顯減少（如比起始暴露量減少50%），則不宜采用多次給藥試驗。高劑量急性給藥試驗所采用高劑量的50%，即接近最小致死量。僅基于無毒性的暴露范圍（高于臨床暴露量的若干倍）來選擇高劑量，不是充分合理的。對于具有血液或骨髓毒性的受試物，

21、進行遺傳毒性評價的劑量應在具有嚴重紅細胞系毒性（如具有明顯的嗜多染紅細胞或網織紅細胞抑制）的高劑量之下、間距不超過約2倍。（四）試驗的階段性細菌回復突變試驗可支持單次給藥的臨床試驗；為支持多次給藥的臨床試驗，應采用哺乳動物細胞進行一項評估染色體損傷試驗；在期臨床試驗開始前完成完整的遺傳毒性標準試驗組合。但是，為了減少藥物開發(fā)風險、保護受試者安全，建議在臨床試驗開始前完成遺傳毒性標準試驗組合。四、試驗結果評價與追加研究策略遺傳毒性研究是藥物安全性評價與藥物整體開發(fā)進程的一個重要組成部分，其最終目的在于預測受試物潛在的致癌性或其他遺傳危害性。試驗結果的分析與評價是試驗的必要組成部分，應對研究結果進

22、行科學和全面的分析與評價。在對遺傳毒性試驗結果進行評價時，應結合受試物的藥學特點、藥效學、藥代動力學和其他毒理學研究的結果等信息進行綜合分析。試驗結果的評價最終應落實到臨床試驗受試者范圍限定、風險效益評估以及必要防治措施的制定和應用上。遺傳毒性試驗組合檢測的是主要通過直接的遺傳損傷機制的致癌物質（如絕大多數(shù)已知的人類致癌劑），不適用于檢測非遺傳毒性致癌劑。每種試驗系統(tǒng)均可能產生假陰性或假陽性結果。一些試驗條件，如有限的體外代謝活化能力，可能導致體外試驗出現(xiàn)假陰性結果。試驗組合方法的設計是為了減少具有潛在遺傳毒性的受試物產生假陰性結果的風險。另一方面，任何一項遺傳毒性試驗中的陽性結果并不一定能說

23、明受試物對人類真正具有遺傳毒性或致癌性的危險。在對體內外試驗結果進行評價時，對陽性或陰性的結果均應予以充分考慮，尤其是在有疑問時。評價受試物的潛在遺傳毒性時，應全面考慮各項試驗結果、體內和體外試驗方法的內在價值及其局限性，進行綜合分析與評價。（一）體外試驗結果的評價1.1 體外細菌回復突變試驗陽性結果的評價由于細菌回復突變試驗的陽性結果提示DNA反應性，為評估對患者用藥的潛在風險，需進行充分的追加試驗以評價體內致突變和潛在致癌性，除非通過恰當?shù)娘L險獲益分析證明是合理的。細菌回復突變試驗出現(xiàn)陽性結果，應考慮受試物的純度，以確定陽性結果是否污染物所致。氨基酸（組氨酸或色氨酸）污染可能導致菌落數(shù)的升

24、高而出現(xiàn)假陽性結果，因此細菌回復突變試驗不適合檢測可能會降解的肽類。一些特殊情況下，細菌回復突變試驗陽性結果并不提示對人體有遺傳毒性潛力，例如當發(fā)生細菌特異性代謝時（如通過細菌硝基還原酶活化）。1.2 體外哺乳動物細胞試驗陽性結果的評價對于體外哺乳動物細胞試驗陽性結果，應采用下述的證據(jù)權重法進行分析，必要時進行追加試驗。例如（包括但不限于）：陽性結果是否歸因于體內不存在的條件（如pH值、滲透壓、沉淀物）；陽性結果僅發(fā)生于產生最高細胞毒性的濃度：在小鼠淋巴瘤細胞試驗中陽性結果發(fā)生于相對總細胞生長率（Relative total growth，RTG）減少80%時；在體外細胞遺傳學試驗中陽性結果發(fā)

25、生于細胞生長抑制50%時。對于以上情況，如果應用證據(jù)權重法分析提示缺乏潛在遺傳毒性，可采用標準試驗組合一，即一個體內試驗即可。對于體外試驗陰性結果，在一些特殊情況下需考慮進行進一步的試驗，例如（包括但不限于）：受試物的化學結構或已知代謝特征提示標準的體外代謝活化技術（如嚙齒類動物肝臟S9）可能不適用；受試物的化學結構或已知活性提示采用其他試驗方法或系統(tǒng)更合適。（二）體內試驗結果的評價與體外試驗相比，體內試驗方法具有考慮到與人體應用相關的吸收、分布、排泄的優(yōu)點，而且體內代謝相對于體外試驗中的代謝系統(tǒng)更具有相關性。因此，體內試驗在遺傳毒性試驗中具有更重要的意義。如果體外與體內試驗的結果不一致，對其

26、結果差異應采用具體問題具體分析的原則進行分析與評價，如代謝差異、受試物在體內快速和高效排泄等。體內試驗結果的意義與受試物在靶組織（注釋5）中是否有足夠的暴露直接相關，尤其是當體外試驗為確定的陽性結果而體內試驗結果為陰性時，或者是當未進行體外哺乳動物細胞試驗時更為重要。受試物在靶組織中具有足夠暴露的證據(jù)包括可疑組織的毒性，或下述的毒代動力學資料。如果受試物在靶組織中無法達到足夠的暴露量，則常規(guī)的體內遺傳毒性試驗的意義較小。對于體外遺傳毒性試驗結果為陽性（或未進行）而體內試驗結果為陰性的受試物，應采用以下任何一種方法來反映受試物在體內/靶組織的暴露水平：（1）細胞毒性對于細胞遺傳學試驗，可通過微核

27、試驗中各劑量組和各采樣時間點所用組織（骨髓或外周血）中未成熟紅細胞數(shù)與紅細胞總數(shù)的比例的顯著變化，或通過染色體畸變試驗中有絲分裂指數(shù)的顯著降低，來間接反映受試物的暴露水平。對其他體內遺傳毒性試驗，可通過肝臟或組織的毒性（如通過組織病理學檢查或血液生化學指標）來間接反映受試物的暴露水平。（2）暴露通過測定血液或血漿中的受試物相關物質水平來反映受試物的體內暴露（注釋12）；直接測定靶組織中的受試物相關物質；或通過放射自顯影檢測組織暴露水平。體內暴露的評估應采用與遺傳毒性試驗相同的動物種屬、品系和給藥途徑，在最高劑量或其他相關劑量中進行。如果全身暴露與預期的臨床暴露相似或更低，提示可能需要采用替代的

28、方法，如采用不同的給藥途徑、采用具有更高暴露的不同種屬、采用不同的組織或試驗。若體外試驗未顯示受試物有潛在遺傳毒性，可采用上述任何一種方法，也可用嚙齒類動物吸收、分布、代謝和排泄試驗結果來確定體內暴露水平。體內遺傳毒性試驗也可能出現(xiàn)假陽性結果，例如：未給予任何遺傳毒性物質，但由于干擾了紅細胞生成而導致微核升高；DNA加合物數(shù)據(jù)應根據(jù)內源性加合物的已知背景水平進行解釋分析；與毒性相關的間接作用可能影響DNA鏈斷裂試驗（如彗星試驗和堿洗脫試驗）的結果。因此評價遺傳毒性數(shù)據(jù)時應考慮所有的毒理學和血液學發(fā)現(xiàn)（注釋13）。與毒理學改變相關的間接作用可能有一個安全范圍，且可能不具有臨床相關性。（三）陽性結

29、果追加研究策略以下討論基于細菌回復突變試驗結果為陰性。1.1 追加機制/體內試驗體外哺乳動物細胞試驗為陽性結果且無充分證據(jù)以排除生物學相關性時，建議進行追加試驗以提供試驗證據(jù)?？蛇M行附加的體外試驗或進行兩種合適的體內試驗，具體如下：（1）進行附加的體外試驗。體外試驗可為陽性結果缺乏生物學相關性提供機制信息，如小鼠淋巴瘤細胞試驗中誘導染色體畸變或突變的受試物不是DNA損傷性物質的證據(jù)（如：除細菌回復突變試驗外的其他突變/DNA損傷試驗結果為陰性；化學結構上的考慮），或者體內可能不相關或可能具有閾值的間接機制的證據(jù)（如抑制DNA合成、僅在高濃度時產生活性氧簇等）。體外微核試驗陽性結果的追加試驗也可

30、采用類似的試驗，或者證據(jù)還可包含提示染色體丟失/非整倍體的已知機制、著絲點染色試驗（注釋14）提示染色體丟失。多倍體是體外染色體畸變試驗中的一種常見現(xiàn)象。雖然非整倍體劑可誘導多倍體產生，但僅多倍體產生并不能提示受試物具有誘導非整倍體的潛力，而可能僅提示細胞周期紊亂；多倍體也常常與細胞毒性的升高有關。如果在體外試驗中僅見多倍體，而未見結構上的染色體斷裂，一個確保具有合適暴露的體內微核試驗的陰性結果，通常可提供不具有潛在非整倍體誘導作用的充分證據(jù)。如果上述機制信息和證據(jù)權重分析支持受試物不具有相關的遺傳毒性，僅需要一個具有合適暴露證據(jù)的體內試驗，以確定受試物不具有遺傳毒性作用。通常采用體內細胞遺傳

31、學試驗，而且，當對潛在染色體丟失進行追加研究時要求進行體內微核試驗。（2）進行兩項合適的體內試驗，通常采用不同的組織，并有支持暴露的證據(jù)。如果無充分的證據(jù)或機制信息以排除相關的潛在遺傳毒性，通常要求進行兩項體內試驗，需要采用合適的終點指標和合適的組織（通常是兩種不同組織），且應在體內獲得充分的暴露。終點指標充分合理并且證明有暴露的合適的體內試驗的陰性結果，足以證明受試物不具有遺傳毒性風險。 1.2 依賴于S9的體外試驗陽性結果的追加當陽性結果僅見于S9代謝活化條件下，首先應確認是否是代謝活化的原因而非其他一些不同條件（如，與非代謝活化培養(yǎng)條件下的10%血清濃度相比，S9混合物中血清濃度低或無血

32、清）。因此追加策略的目的是確定體外結果與體內條件的相關性，通常采用肝臟體內試驗（注釋15）。若體內微核升高，應對所有的毒理學資料進行評價，以確定是否是由于非遺傳毒性作用所致或非遺傳毒性作用是其中的一個作用因素。如果懷疑存在干擾紅細胞生成作用或生理學的非特異性因素（如體溫偏低或過高），進行一項體內染色體畸變試驗更為合適。如果懷疑一個升高的結果，應進行研究以證明該升高是否是由于染色體丟失或染色體斷裂所致（注釋14）。有證據(jù)顯示非整倍體誘導作用，如紡錘體抑制劑，具有非線性劑量反應關系。因此，可能可確定該作用是否有閾值暴露（低于該暴露下預期不會有染色體丟失），以及確定與臨床暴露比較是否存在合適的安全范

33、圍。總之，受試物潛在遺傳毒性的評價應考慮所有結果，并認識到體外與體內試驗各自的內在價值及局限性。（四）與致癌性試驗的腫瘤發(fā)現(xiàn)有關的追加遺傳毒性試驗在遺傳毒性標準試驗組合中呈陰性結果，但在致癌性試驗中顯示腫瘤發(fā)生率升高，而且無充分證據(jù)確定是非遺傳毒性作用機制的受試物，應在合適的模型上進行附加的遺傳毒性試驗。為了幫助了解作用方式，附加試驗可包括改變體外試驗的代謝活化條件，或包括測定腫瘤誘導靶器官遺傳學損傷的體內試驗，如DNA鏈斷裂試驗（如彗星試驗或堿洗脫試驗）、DNA加合試驗（如通過32P-后標記）、轉基因突變誘導試驗，或腫瘤相關基因遺傳學改變的分子特征性分析。（五）綜合分析與評價當遺傳毒性試驗結

34、果為陽性時，對進入臨床試驗是否安全，應考慮所有的安全性資料，包括對所有遺傳毒性資料的全面評價，以及擬進行的臨床試驗的性質。對于遺傳毒性試驗出現(xiàn)陽性結果、但不直接與DNA發(fā)生作用的受試物，不全都會帶來明顯的體內給藥的風險。因此，當遺傳毒性試驗出現(xiàn)陽性結果時，建議提供有關遺傳毒性機制的證據(jù)以及這種機制與預期體內暴露的相關性，或者通過試驗排除為直接與DNA作用的機制，如證明受試物不使DNA烷化或DNA鏈斷裂，并提供未觀察到遺傳毒性的劑量水平。若確認受試物可直接損傷DNA，在極特殊情況下，可能會被允許用于危及生命的疾病（如晚期癌癥），但不能在健康受試者中使用。五、參考文獻1.ICH. S2(R1)：G

35、uidance on genotoxicity testing and data interpretation for pharmaceuticals intended for human use. 20112. ICH. M3 (R2): Non-clinical safety studies for the conduct of human clinical trials and marketing authorization for pharmaceuticals. 20093.FDA. Guidance for industry and review staff: Recommende

36、d approaches to integration of genetic toxicology study results. 20065.OECD. Guideline for testing of chemicals No.473：In Vitro mammalian chromosomal aberration test. 20166.OECD. Guideline for testing of chemicals No.474：Mammalian erythrocyte micronucleus test. 20167.OECD. Guideline for testing of c

37、hemicals No. 475：Mammalian bone marrow chromosome aberration test. 20168.OECD. Guideline for testing of chemicals No. 476: In vitro mammalian cell gene mutation tests using the Hprt and xprt genes. 20169.OECD. Guideline for testing of chemicals No. 487：In vitro mammalian cell micronucleus test. 2016

38、10.OECD. Guideline for testing of chemicals No. 488：Transgenic rodent somatic and germ cell gene mutation assays. 201311.OECD. Guideline for testing of chemicals No. 489：In vivo mammalian alkaline comet assay. 201612.OECD. Guideline for testing of chemicals No. 490：In vitro mammalian cell gene mutat

39、ion tests using the thymidine kinase gene. 2016六、注釋注釋1：盡管只有少數(shù)但仍有一定數(shù)量的遺傳毒性致癌劑能被骨髓染色體損傷試驗檢出，而在標準組合所列出的體外試驗中卻得到陰性、弱陽性或相互矛盾的結果。丙卡巴肼、對苯二酚、氨基甲酸乙酯、苯等致癌劑即為此類物質。注釋2：雖然兩種標準試驗組合同等適合，但是某些受試物的特異性信息提示應首選其中一種組合。例如，如果動物上的全身暴露與預期臨床暴露相當或更低，應進行體外試驗即組合一；當預期在肝臟產生短暫的活性代謝物時，推薦采用包含有一項肝臟體內試驗的組合二。注釋3：某些具有遺傳毒性警示結構的化合物被認為與致癌和/

40、或致突變潛力有因果關系。警示結構包括烷化親電子中心、不穩(wěn)定過氧化物、芳香胺、偶氮結構、N-亞硝基基團、芳香硝基基團。注釋4：對有特殊警示結構的幾類化合物，如含有偶氮基團的分子、糖苷類、活化需要還原硝基的化合物如硝基咪唑類、代謝活化需要不同的嚙齒類動物S9的化合物如非那西汀，為最適合檢測遺傳毒性，采用特殊的方案調整或附加試驗是非常重要的。注釋5：靶組織：此處特指體內試驗的檢測目標組織，如小鼠骨髓微核試驗中的骨髓。注釋6：采用皮膚和結腸進行誘導微核的體內試驗已有一些經驗，而且在這些組織中進行DNA損傷試驗也是一種合適的替代方法。注釋7：此處所指最高濃度的確定主要針對化學藥物，因中藥、天然藥物所包含

41、范圍寬且情況復雜，在合適時可參考化學藥物的最高濃度的確定原則進行設計，不合適時需根據(jù)具體情況進行合理的設計。注釋8：雖然微核的形成源于受試物與紡錘體相互作用導致整條染色體分裂的滯后，但微核試驗無法檢測所有非整倍體誘導劑。更特異的非整倍體誘導檢測方法之一是采用快速、靈敏的技術分析個體（嚙齒類動物）分裂間期核中的染色體，如熒光原位雜交（FISH）方法。注釋9：原則上，造血細胞的微核可采用任何動物種屬的骨髓，以及循環(huán)系統(tǒng)中的含微核紅細胞不會被脾臟清除的動物種屬的外周血進行評價。在小鼠上，微核可通過血中的嗜多染紅細胞進行測定，當小鼠持續(xù)給藥約4周或更長時間時也可采用成熟紅細胞進行測定。雖然大鼠可快速清

42、除循環(huán)中的含微核紅細胞，但是大鼠血液網織紅細胞中可檢測到由一系列斷裂劑和非整倍體劑誘導的微核，因此大鼠外周血也可用于微核分析，但所采用方法學需確保能分析新生網織紅細胞且方法學經過充分驗證。注釋10：在某些情況下，動物單次或多次給予受試物后取外周血淋巴細胞進行培養(yǎng)，可檢測中期相染色體畸變，就如同可采用骨髓中期相細胞一樣。因為循環(huán)中的淋巴細胞是不可復制的，所以該試驗系統(tǒng)無法檢測需要通過細胞復制才能顯示出遺傳毒性作用的受試物（如某些核苷類似物）。由于一些淋巴細胞壽命相對較長，原則上它們具有體內蓄積未修復DNA損傷的潛力，這使得細胞在體外受到刺激進行分裂時畸變率升高。體內淋巴細胞試驗可用于斷裂劑指征的

43、追加研究，但是，對于造血細胞微核試驗，采用其他組織（如肝臟）的試驗通?？裳a充提供更多信息量，因為肝臟中藥物和代謝物的暴露通常更高。注釋11：在標準試驗組合中包含第二項體內試驗，是為了通過一種對受試物和/或其代謝物具有良好暴露的組織來確證受試物不具有遺傳毒性。另外，一小部分被認為有遺傳毒性的致癌劑在肝臟試驗中結果為陽性，但在體內骨髓細胞遺傳學試驗中結果卻為陰性。這些案例很可能反映了缺乏合適的代謝活性或缺乏活性中間體傳遞至骨髓造血細胞。注釋12：骨髓是血液灌流性良好的組織，故血液或血漿中受試物相關物質的水平與骨髓中水平相似。無論何種給藥途徑，肝臟對于有全身暴露的受試物預期會有暴露。注釋13：微核升

44、高可發(fā)生于未給予任何遺傳毒性物質時，而是由于紅細胞生成的干擾（如再生障礙性貧血、髓外造血作用）、應激、體溫偏低或體溫過高所致。脾臟功能的改變可影響含微核細胞從血液中的清除，可導致循環(huán)中的含微核紅細胞數(shù)量輕微升高。注釋14：確定微核誘導是否主要由于染色體丟失或染色體斷裂所致，試驗應包括對體外或體內微核染色以確定著絲粒是否存在，例如，在著絲粒位置的DNA序列采用有探針的熒光原位雜交（FISH），或者采用抗著絲粒蛋白的標記抗體。如果大多數(shù)誘導的微核是著絲粒陽性，這提示有染色體丟失。但是，需要注意，強微管毒物如秋水仙堿和長春堿為一種特殊情況，它們雖然不會產生100%著絲粒陽性的微核，但典型的著絲粒陽性

45、微核超過70%80%，而在風險評估中卻被公認為主要是非整倍體誘導劑。一種替代的方法是進行一項體外或體內中期相結構畸變試驗，如果該試驗結果是陰性，則提示微核誘導與染色體丟失有關。注釋15：標準誘導的S9混合物比人S9具有更高的活化能力，并且缺乏相解毒能力，除非添加特異性的輔助因子。此外，在體外測試底物濃度很高時可發(fā)生非特異的代謝活化作用。采用人S9或其他人類相關的代謝活化系統(tǒng)進行遺傳毒性試驗是有用的。分析遺傳毒性試驗中培養(yǎng)物的代謝產物特性，與非臨床種屬（非誘導的微粒體或肝細胞，或體內）或來自于人體樣本的已知代謝產物特性進行比較，也可有助于確定試驗結果的相關性。而且，追加試驗通常采用肝臟的體內試驗

46、。在S9存在條件下體外試驗得到陽性結果的受試物，在體內可能不誘導遺傳毒性，因為不形成代謝產物或形成極微量，或被代謝性解毒或快速排泄，這種情況可提示缺乏體內風險。注釋16：小鼠淋巴瘤細胞試驗為一種體外哺乳動物細胞Tk基因突變試驗。除小鼠淋巴瘤L5178Y細胞外，人淋巴母細胞TK6細胞也可用于檢測Tk基因位點突變。目前，TK6試驗已納入OECD指導原則，但是，對于該試驗，目前積累的試驗經驗較少，且未進行充分的方法學驗證。在該試驗經過充分的方法學驗證后才可用于藥物注冊目的。七、附錄推薦的標準試驗組合中的遺傳毒性試驗方法注：以下方法中所提供的最高濃度和最高劑量設計原則主要針對化學藥物，中藥、天然藥物由

47、于情況復雜，應綜合考慮多方面因素，不能簡單套用該原則，試驗時應根據(jù)具體情況進行合理的設計。（一）細菌回復突變試驗（Bacterial reverse mutation test）組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌和/或色氨酸營養(yǎng)缺陷型埃希氏大腸桿菌，至少應包含下述五種菌株組合（除特殊說明外，均為鼠傷寒沙門氏菌）：（1）TA98；（2）TA100；（3）TA1535；（4）TA1537或TA97或TA97a；（5）TA102或大腸埃希桿菌WP2 uvrA或大腸埃希桿菌WP2 uvrA（pKM101）。菌株特性鑒定需符合要求，80或液氮凍存?zhèn)溆?。至少應包?個可用于結果分析的濃度。最高濃度主要取決于受

48、試物對細菌的毒性和/或溶解度：（1）對于可溶性的無細菌毒性的受試物，推薦的最高濃度一般為5mg/皿（液體受試物為5µl/皿）。 （2）對于可溶性的有細菌毒性的受試物，應根據(jù)細菌毒性情況確定最高濃度（詳見正文1.2.2）。（3）對于難溶性的受試物，若未觀察到細菌毒性，一般以最小沉淀濃度為評價的最高濃度；若觀察到濃度相關性的細菌毒性或誘變性，則要求檢測多個產生沉淀的濃度（詳見正文1.2.3）。一般采用誘導劑，如Aroclor 1254或苯巴比妥和-萘黃酮聯(lián)合誘導處理后的哺乳動物肝臟微粒體酶（S9）進行體外代謝活化試驗，即在加S9和不加S9平行條件下測試。S9在S9混合液中的濃度一般為5%

49、30%（v/v）。代謝活化或非代謝活化條件下，均應設立平行陰性（空白對照和/或溶劑對照）和陽性對照組。陽性對照物應為已知的菌株特異性的陽性致突變劑?？刹捎脴藴势桨鍝饺敕ɑ蝾A培養(yǎng)法，受試物處理后4872小時觀察結果。每一濃度至少平行三皿。結果中應描述各濃度組細菌毒性大小和沉淀情況；結果表示為每皿的回復突變菌落數(shù)，并計算各組的均值和標準差。至少在一個菌株上，在有或無代謝活化條件下，受試物所誘發(fā)的回復突變菌落數(shù)出現(xiàn)濃度依賴性的增加和/或在一個或多個濃度組上出現(xiàn)可重復性的增加，可判定為陽性結果。結果判定時應首先考慮試驗結果的生物學意義，統(tǒng)計學分析有助于結果的評價。（二）體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗（

50、In vitro mammalian chromosomal aberration test）可采用哺乳動物或人的細胞進行試驗，如CHL細胞、CHO細胞、TK6細胞、人外周血淋巴細胞等，細胞系需定期檢查核型和有無支原體污染等。-80或液氮凍存?zhèn)溆?。至少應包?個可用于結果分析的濃度。最高濃度主要取決于受試物的細胞毒性和/或溶解度。（1）對于可溶性的無細胞毒性的受試物，推薦的最高濃度一般為1 mM或0.5 mg/ml （選用較低者）。（2）對于可溶性的有細胞毒性的受試物，應根據(jù)細胞毒性大小確定最高濃度。最高濃度所產生的細胞毒性應達到約50%但無需超過50%。對于哺乳動物細胞，可采用相對群體倍增數(shù)

51、（Relative population doubling，RPD）和相對細胞增長數(shù)（Relative increase in cell count，RICC）的減少來反映細胞毒性；對培養(yǎng)的人外周血淋巴細胞，可通過有絲分裂指數(shù)（Mitotic Index，MI）的降低來反映細胞毒性。 （3）對于難溶性的受試物，一般采用最小沉淀濃度為最高濃度。對最高濃度之下的其他濃度，對于細胞毒性小或無的受試物，一般濃度間距為23倍；對于有細胞毒性的受試物，所選擇的濃度應覆蓋產生細胞毒性的范圍，并且包括具有中度或少/無細胞毒性的濃度；在一些情況下，如具有較陡峭的濃度反應關系，則可適當縮小濃度間距或將檢測的濃度加

52、至3個以上。每一濃度一般平行2皿；若能獲得足夠細胞數(shù)，可用單皿，尤其當超過3個檢測濃度時。一般采用誘導劑，如Aroclor 1254或苯巴比妥和-萘黃酮聯(lián)合誘導處理后的哺乳動物肝臟微粒體酶（S9）進行體外代謝活化試驗，即在加S9和不加S9平行條件下測試。S9在試驗介質中的終濃度一般為1%10%（v/v）。代謝活化或非代謝活化條件下，均應設立平行陰性（空白對照和/或溶劑對照）和陽性對照組。陽性對照物應為已知的陽性誘變劑。處理及細胞收獲時間：在代謝活化或非代謝活化條件下，受試物和細胞作用36小時，在1.5個正常細胞周期時收獲細胞；在非代謝活化條件下，受試物和細胞還應持續(xù)作用至1.5個正常細胞周期時

53、收獲細胞。對于某些受試物，與細胞接觸時間/收獲細胞時間可能要大于1.5個正常細胞周期。讀片分析：一般油鏡下每種濃度至少觀察300個分散良好的分裂中期相細胞，若觀察到大量染色體畸變細胞，分析細胞數(shù)可相應減少。應分別記錄各組含有結構畸變染色體的細胞數(shù)和畸變類型，染色單體型與染色體型畸變應分別記錄并記錄亞型（斷裂、交換）。裂隙應單獨記錄，但不計入畸變率中。同時應單獨記錄多倍體和內復制等數(shù)目畸變，但不計入畸變率中。結果中應描述各濃度組細胞毒性大小和沉淀情況；結果表示為染色體結構畸變細胞的百分率。受試物在任一處理條件下至少一個濃度時染色體畸變率顯著升高，升高具有濃度依賴性，且畸變率在陰性對照歷史范圍之外

54、，可判定為陽性結果。結果判定時應首先考慮試驗結果的生物學意義，統(tǒng)計學分析有助于結果的評價。如果結果不是明確的陽性或陰性結果，或者為了幫助確定結果的生物學意義，應對數(shù)據(jù)進行專家同行評議和/或進一步研究。分析更多的細胞（當可行時），或者通過改變試驗條件進行重復試驗（如改變試驗濃度間距、改變代謝活化條件等）可能是有用的。應單獨記錄多倍體和內復制的發(fā)生率。多倍體數(shù)目的增加提示受試物可能會抑制有絲分裂或誘導染色體數(shù)目畸變。出現(xiàn)染色體內復制的細胞數(shù)增多提示受試物可能會影響細胞周期。（三）體外小鼠淋巴瘤細胞Tk基因突變試驗（In vitro mouse lymphoma cell Tk gene mutat

55、ion assay，MLA）通常采用小鼠淋巴瘤L5178Y tk+/- -3.7.2 C細胞（注釋16）。細胞系需定期檢查核型或有無支原體污染等，必要時進行自發(fā)突變細胞的清除。-80或液氮凍存?zhèn)溆?。至少應包?個可用于結果分析的濃度。最高濃度主要取決于受試物的細胞毒性和/或溶解度：（1）對于可溶性的無細胞毒性的受試物，推薦的最高濃度一般為1mM或0.5mg/ml （選用較低者）。（2）對于可溶性的有細胞毒性的受試物，應根據(jù)細胞毒性大小確定最高濃度，最高濃度應能產生80%90%的細胞毒性。通過相對總生長率（Relative total growth，RTG）來反映細胞毒性。（3）對于難溶性的受試

56、物，若無細胞毒性，一般采用最小沉淀濃度作為最高濃度；即使細胞毒性出現(xiàn)在最小沉淀濃度以上，一般建議只檢測1個沉淀濃度，因為沉淀可能產生干擾。對最高濃度之下的其他濃度，對于細胞毒性小或無的受試物，一般濃度間距為23倍；對于有細胞毒性的受試物，所選擇的濃度應覆蓋產生細胞毒性的范圍，并且包括具有中度或少/無細胞毒性的濃度；在一些情況下，如受試物具有較陡峭的濃度反應關系，可適當縮小濃度間距或將檢測的濃度增加至4個以上。一般采用誘導劑，如Aroclor 1254或苯巴比妥和-萘黃酮聯(lián)合誘導處理后的哺乳動物肝臟微粒體酶（S9）進行體外代謝活化試驗，即在加S9和不加S9平行條件下測試。S9在試驗介質中的終濃度

57、一般為1%10%（v/v）。代謝活化或非代謝活化條件下，均應設立平行陰性（空白對照和/或溶劑對照）和陽性對照組。陽性對照物應為已知的陽性誘變劑。一般采用微孔法或軟瓊脂法進行試驗。以微孔法為例：處理時間：在代謝活化或非代謝活化條件下，一般受試物與細胞作用34小時。如果作用34小時后結果為陰性，還需進行在非代謝活化條件下作用24小時的附加試驗。突變表達期：受試物與細胞作用結束后，去除受試物，將細胞重懸于培養(yǎng)液中，一般L5178Y細胞的突變表達期為2天。分別在處理結束后及表達期結束后測定平板接種效率以評價細胞毒性。突變率測定：表達期結束后，將細胞接種于含有突變選擇劑三氟胸苷（TFT）的96孔板中進行

58、TFT抗性突變集落的測定。如果受試物出現(xiàn)陽性結果，需要對至少一個受試物濃度組（一般為最高濃度）和陰性、陽性對照組分別記錄含有大、小集落的孔數(shù)；如果為陰性結果，僅需要對陰性和陽性對照組分別記錄含有大、小集落的孔數(shù)。結果中應描述各濃度組細胞毒性大小和沉淀情況；結果表示為各濃度組的突變率（Mutant frequency，MF）。MLA試驗中陰性對照組和陽性對照組必須符合以下標準才可判定MLA試驗成立。陽性對照組的突變率、突變選擇時的克隆率、懸液增長應滿足以下條件：表1 MLA成立的陰性對照組標準參數(shù)軟瓊脂法微孔法突變率（MF）（35140）×10-6（50170）×10-6克隆率65%120%65%120%懸液增長832倍（34小時處理）32180倍（24小時處理）832倍（34小時處理