錦鯉腐皮病滅活疫苗制備及使用

1、錦鯉腐皮病滅活疫苗制備及使用摘要：從患有腐皮病的錦鯉(Cryprinuscarpio)肝、腎、脾、血液里分離到1株優(yōu)勢菌，對該菌進行純化培養(yǎng)并經人工感染試驗，確定該菌為病原菌。經16srRNA序列分析,鑒定該病原菌為蠟樣芽抱桿菌(Bacilluscereus用不同濃度福爾馬林和不同溫度滅活蠟樣芽抱桿菌，篩選其滅活效果并制得滅活疫苗。將滅活疫苗免疫健康鋪鯉后測定其抗體效價變化及免疫保護率。結果表明，0.2%的福爾馬林溶液在28°C下滅活24h及4。(2滅活36h為蠟樣芽胞桿菌的適宜滅活條件。首次免疫后第20天，免疫I組、n組、m組、IV組血清抗蠟樣芽抱桿菌的抗體效價達到高峰，分別為1：

2、128、1:64、1:64.1:32;第30天同樣劑量加強免疫后，各免疫組血清抗體效價達到更高水平，分別為1:256、1:256、1:128、1:64;免疫后第50天時攻毒，I組、II組、m組、IV組免疫保護率分別為66%、66%、55%、44%。關鍵詞:蠟樣芽抱桿菌(Bacilluscereus);錦鯉(Cryprinuscarpio);滅活疫苗;抗體效價；免疫保護力中圖分類號：S942.5文獻標識碼：A文章編號：0439-8114(2016)20-5320-04D0I:10.14088/jki.issn0439-8114.2016.20.038Abstract:Adominantbacte

3、riastrainwasisolatedfromtheliver,kidney,spleenandbloodofdiseasedCryprinuscarpioandconfirmedaspathogenicbacteriastrainbypurifiedcultureandartificialinfection.ItwasidentifiedasBacilluscereusrby16SrRNAsequenceanalysis.TheoptimalinactivatedconditionforpreparingtheinactivatedvaccineofBacilluscereusrwasde

4、terminedthroughtreatedwithdifferentconcentrationsofformalinandtemperatureonbacteria.Theantibodytitersofserumandrelativepercentageofsurvival(RPS)weredeterminedafterimmunehealthyCryprinuscarpi.TheresultsshowedthattheoptimalinactivationconditionsofBacilluscereusrwere28for24hor4for36hwiththeconcentratio

5、nof0.2%formalin.Onthe20thdayafterthefirstimmunizationtheserumantibodytiterofCryprinuscarpiagainstBacilluscereusreachedthepeakandthatofimmunizedgroupI,11rinandIVwere1:128rl:64：64and1:32,respectively.Theantibodytitersofallimmunizedgroupsreachedahigherlevelwhengotsecondimmunizationwiththesamedoseasthef

6、irstimmunizationandthatofgroupI,H,DIandIVwere1:256,1:256,1:128and1:64onthe30thdayafterthefirstimmunization,respectively.TheRPSofimmunizedgroupI,n,HIandIVwere66%,66%z55%and44%onthe50thdayafterthefirstimmunization,respectively.KeywordsBacilluscereus;Cryprinuscarpio;inactivatedvaccine;antibodytitres;re

7、lativepercentsurvival(RPS)錦鯉(Cyprinuscarpio康屬于鯉形目(Cypriniformes浦里科(Cyprinid建屬Cryprinus),為大型觀賞魚類。近年來錦鯉養(yǎng)殖空度越來越大，加上水質不易調控，導致錦鯉腐皮病發(fā)病率居高不下1,不僅影響了錦鯉的觀賞價值，還易引起鋪鯉大量死亡。目前從魚類腐皮病上已分離到的致病菌有點狀產氣單胞菌(AeromonaspunctataSub.punctata殺鞋氣單胞菌(A.salmonicida嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)和維氏氣單胞菌(A.veronii)2-5,對這些病原菌的抑制或殺滅多是采用抗生素類藥物6,

8、7,但長期使用抗生素類藥物導致病原菌的耐藥性問題日趨嚴重，同時對養(yǎng)殖水體也造成一定的污染。已有研究表明水產疫苗對魚類具有良好的免疫保護效果，同時可增強魚體抗應激能力，且符合友好環(huán)境的要求8。目前水產動物疫苗研制集中于大規(guī)模養(yǎng)殖的食用魚疾病2-5,多采用注射免疫途徑,給苗不便成為制約水產疫苗推廣應用的關鍵因素8。而錦鯉養(yǎng)殖具有養(yǎng)殖水體小、養(yǎng)殖數(shù)量少、易于操作和經濟價值高等特點，這些特點為疫苗的實施提供了可行性。本試驗旨在通過研制錦鯉腐皮病安全有效的滅活疫苗并用于臨床預防,為鋪鯉腐皮病防控提供技術參考。1材料與方法1.1 病原菌的分離與鑒定1.1.1 病原菌分離患病鋪鯉取自北京市某錦鯉養(yǎng)殖場，體長

9、15.218.5cm,體重105.71.1.1 g。臨床癥狀主要表現(xiàn)為病魚I區(qū)干部和鰭基部等部位伴有充血、出血、縷片脫落、肌肉外露等潰瘍灶。在超凈工作臺解剖有典型病癥的患病錦鯉，取病魚的肝、脾、腎、血液組織劃線接種于普通固體培養(yǎng)基上，28于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h0方微單個優(yōu)勢菌落重復劃線于普通固體培養(yǎng)基上，獲得的純化菌株保存于4冰箱備用。1.1.2 人工感染將分離到的細菌接種于普通固體培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)24h,用0.8%無菌生理鹽水洗脫平板菌苔，制成濃度為1x108CFU/mL的菌懸液備用。試驗魚由天津市鯉魚良種場提供，養(yǎng)殖于圓形水泥池（直徑為1.2m、高1.0m）,池水預消毒

10、曝氣5d。將20尾健康錦鯉（體重101.3122.1g，體長13.516.7cm）分兩組，每組10尾，暫養(yǎng)5d后一組腹腔注射0.2mL/尾菌懸液（1x108CFU/mL）,另一組腹腔注射無菌生理鹽水（0.2mL/尾1飼養(yǎng)過程中24h氣泵增氧，三日換水量為1/3,正常投喂配合詞料，記錄魚體發(fā)病及死亡情況。取感染致死的錦鯉內臟組織和血液進行細菌再分離。1.1.3 病原菌鑒定16SrRNA序列分析：使用DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取細菌DNA作為PCR反應模板備用。引物為27R5,-AGAGTTTGATCCTGG-3,1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3

11、')(北京生工物工程有限公司合成將引物稀釋至5pmol/L,-20存儲備用。PCR反應體系25pL:正反引物各1同，模板2“L,MgCl22pL,dNTP0.5pL,PCRbuffer2.5pL,Taq聚合酶0.3pL,用ddH2O補足。PCR反應條件:94預變性5min;94變性50s;50°C退火50s;72延伸2min,35個循環(huán)；72延伸10min。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測并送生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定，將序列與GenBank中序列進行比對分析，用Mega4.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。1.2疫苗的制備1.2.1 疫苗制備及條件的確定用無菌蒸福水將

12、福爾馬林配制成梯度濃度0.2%、0.4%、1.0%x2.0%、3.0%,分別與濃度為2x109CFU/mL的菌懸液等體積混合，每梯度設3個平行。將混合液置于28°C恒溫搖床(80r/min)滅活48h;用同樣方法配制福爾馬林和細菌混合液置于4°C滅活。以上滅活過程中每12h取0.2mL菌液均勻涂布于普通固體培養(yǎng)基上28°C培養(yǎng)3d,觀察并記錄是否有菌長出。將濃度為1x109CFU/mL的菌懸液分別置于60°C與72°C恒溫水浴鍋熱滅活12h,每隔2h取樣檢測細菌滅活情況。將最佳滅活條件滅活的菌液4°C、5000r/min離心10min

13、收集菌體，生理鹽水洗滌3次，并重懸菌體，使?jié)舛燃s為1x109CFU/mL與4x109CFU/mL,4。(2儲存待用。1.2.2 疫苗的安全性檢測將待用疫苗涂布于普通固體培養(yǎng)基上，每組3個平行,28培養(yǎng)3d,觀察有無菌長出。用待用疫苗腹腔注射10尾健康鋪鯉，每尾0.2mL,持續(xù)10d觀察魚的攝食情況、發(fā)病癥狀及死亡情況并記錄。13錦鯉的免疫試驗錦鯉來自天津市鯉魚良種培育場，魚體體長12.817.7cm,體重100.5123.3g,試驗在該場水泥池中進行，正常飼喂配合飼料，24h氣泵增氧，三日換水量為1/3。試驗分為免疫組與對照組，免疫組設四個處理水平，記為I組（28°C條件下濃度為4x

14、109CFU/mL滅活疫苗組X11組（28條件下濃度為1x109CFU/mL滅活疫苗組111組（4條件下濃度為4x109CFU/mL滅活疫苗組IV組（4條件下濃度為1x109CFU/mL滅活疫苗組），每處理水平設3個平行，每平行各10尾鋪鯉。每尾錦鯉腹腔注射0.2mL疫苗。對照組注射0.8%無菌生理鹽水，每尾0.2mL。第一次免疫30d后，采用相同的方法與劑量加強免疫。1.4 抗體效價測定采用96孔血凝板法測定血清抗體效價。首次免疫后每隔5d從免疫組各處理水平與對照組中隨機取5尾魚,尾部靜脈取血；加強免疫后每隔10d采用相同方法采血。血樣室溫靜置2h,然后放置于4冰箱5h,4條件下5000r/

15、min離心10min,收集上層血清。以濃度為4x109CFU/mL的蠟樣芽抱桿菌菌懸液卷抗原檢測血清抗體效價。1.5 免疫保護率測定首次免疫60d后，隨機從免疫組與對照組中各取10尾試驗魚，分別向腹腔注射0.2mL的1x108CFU/mL蠟樣芽泡桿菌活菌，連續(xù)觀察10d,記錄各組死亡情況,解剖檢查并記錄死亡魚體表及各組織器官病變情況。按下列公式計算免疫保護率（RPS）:免疫保護率=（對照組死亡率-試驗組死亡率）/對照組死亡率x100%2結果與分析2.1 病原菌鑒定從患病錦鯉體表病灶處及實質器官中分離我得一株疑似致病菌，命名為J1。普通固體培養(yǎng)基上菌落為圓形、中央隆起、邊緣波狀、白色。細菌革蘭氏

16、染色呈陽性,長桿狀，有芽抱。通過對分離菌株J1的16SrDNA進行PCR擴增得到大小約為1500bp的片段，測序后得到長度為1300bp16SrRNA基因序列（圖11將獲得的J1測序序列在NCBI上進行同源性比較使用Mega4.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹轉果表明J1菌株與蠟樣芽胞桿菌:Bacilluscereus）聚為一類（圖212.2 人工感染試驗攻毒錦鯉10尾，9尾發(fā)病，主要癥狀為體表黏液減少、局部充血、潰爛，發(fā)病癥狀與自然死亡錦鯉相同,第九天死亡率達90%,對照組沒有出現(xiàn)臨床病癥及死亡，由此判斷蠟樣芽抱桿菌為錦鯉腐皮病的致病菌。2.3 細菌滅活及疫苗制備在4°C條件下，當福爾馬林終濃

17、度為0.1%時，需48h完全滅活，其他濃度組在36h內完全滅活；在28°C條件下，病原菌在各濃度梯度福爾馬林溶液里36h內即完全滅活，福爾馬林終濃度越高，滅活所需時間越短（表11而在60°C與72°C條件下，滅活24h后均有細菌存活。綜合考慮福爾馬林濃度和滅活時間，選擇終濃度0.2%的福爾馬林4°C滅活36h和28°C滅活24h為蠟樣芽抱桿菌疫苗制備條件。2.4 滅活疫苗安全性檢測將試驗疫苗涂布于普通固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)3d后平板上無菌落生長，即判斷為病原菌完全滅活。將疫苗腹腔注射健康錦鯉（0.2mL/尾）,10d后所有魚均存活

18、，攝食良好，表明疫苗安全。2.5 抗體效價與免疫保護率以蠟樣芽抱桿菌為抗原檢測免疫鋪鯉的血清抗體效價。結果（圖3）表明，錦鯉經免疫后抗體效價水平有上升趨勢。在首次免疫5d后可以檢測到抗體產生，20d后達到高峰，I組、n組、m組、IV組抗體效價分別為1:128、1:64.1:64.1:32,之后各免疫組抗體效價水平開始緩慢下降，免疫后第30天時，各免疫組抗體效價水平回落至1:16;第30天加強免疫后免疫組血清抗體效價水平快速提升，于50d后達到最高值，分別為1:256、1：256、1:128、1:64,60d時抗體效價水平仍維持在較高水平，對照組均不超過1:4。首次免疫后第60天腹腔注射1x10

19、8CFU/mL蠟樣芽泡桿菌懸液攻毒錦鯉，對照組在攻毒第三天部分魚體表出現(xiàn)黏液減少、部分組織充血、出血；第六天時出現(xiàn)死亡，第九天時死亡率達到90%。而免疫組在攻毒后第八天開始死亡，10d后形迷續(xù)死亡。I組、n組、HI組、IV組免疫保護率分別為66%、66%、55%、44%(表2I3小結與討論蠟樣芽抱桿菌廣泛存在于各種環(huán)境中，是一種具有發(fā)展前景的益生菌，并在水產養(yǎng)殖中廣泛應用9,10o本試驗發(fā)現(xiàn)蠟樣芽抱桿菌可引起錦鯉腐皮病，駱藝文等11也從患有腐皮病綜合征的刺參上分離到該菌，通過人工回感試驗證明其具有致病性。因此,蠟樣芽抱桿菌作為益生菌在水產養(yǎng)殖中使用的安全性有待進一步論證。一般認為，較溫和的滅活

20、條件，如較低的溫度與較低的福爾馬林濃度或較短的福爾馬林作用時間，有利于抗原得到保護12-14。但在本試驗中，4°C條件下使用終濃度為0.2%的福爾馬林滅活36h,抗體效價水平明顯低于28°C條件下滅活的疫苗，這與楊先樂等13的報道相近。血清抗體效價和相對免疫保護力是評價疫苗免疫效果的重要參數(shù)。本試驗結果表明,在適合條件下完全滅活的蠟樣芽抱桿菌疫苗免疫健康錦鯉后，血清抗體效價最高達1:256,并能持續(xù)較長時間，同時受免魚用蠟樣芽胞桿菌攻毒后，免疫保護率最高達66%,表明錦鯉對蠟樣芽泡桿菌滅活疫苗能產生較強的免疫應答反應，并可有效抵擋蠟樣芽泡桿菌的感染。該疫苗制備操作簡單，滅活時間短，所需滅活劑濃度低，且在錦鯉上注射免疫易操作，筆者認為該滅活疫苗對錦鯉腐皮病防控具有較好的應用價值。參考文獻：1羅琳馬志宏，李鐵梁.錦鯉體表潰爛病的實用防治方法J.科學養(yǎng)魚,2009(11)53-54.2溫海深劉振琦.鯽腐皮病病原菌的初步研究J.大連海洋大學學報,1995,10(1)：49-55.3曹紅梅，劉力，沙莎