課題2　土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)

1、尿素分子的立體結構尿素分子的立體結構（一）篩選菌株（一）篩選菌株水生耐熱細菌水生耐熱細菌Taq ( Thermus aquaticus )耐高溫的耐高溫的Taq DNA聚合酶聚合酶美國微生物學科布魯克美國微生物學科布魯克1966年發(fā)現(xiàn)耐熱細菌年發(fā)現(xiàn)耐熱細菌1、實驗室微生物的篩選原理（、實驗室微生物的篩選原理（P21） 人為提供有利于目的菌株生長的條件（包人為提供有利于目的菌株生長的條件（包括營養(yǎng)、溫度、括營養(yǎng)、溫度、pHpH等），同時抑制或阻止其他等），同時抑制或阻止其他微生物生長。微生物生長。（一）篩選菌株（一）篩選菌株2 2、選擇培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基 在微生物學中，將允許特定種類的微生在微生

2、物學中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，稱做長的培養(yǎng)基，稱做選擇培養(yǎng)基。選擇培養(yǎng)基。（一）篩選菌株（一）篩選菌株 加入青霉素的培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基 細菌不生長，細菌不生長，酵母菌、霉菌等真菌能生長酵母菌、霉菌等真菌能生長 不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基 分離分離自養(yǎng)型微生物自養(yǎng)型微生物 1.在培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長提供碳源在培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮源的分別是是什么物質？和氮源的分別是是什么物質？碳源是葡萄糖，氮源是尿素碳源是葡萄糖，氮源是尿素2.分析該配方的培養(yǎng)基對微

3、生物是否具有選擇作分析該配方的培養(yǎng)基對微生物是否具有選擇作用？如果有，又是如何進行選擇的？用？如果有，又是如何進行選擇的？有篩選作用。尿素是培養(yǎng)基中的唯一氮源，因此，有篩選作用。尿素是培養(yǎng)基中的唯一氮源，因此，原則上只有能夠利用尿素的微生物才能夠生長。原則上只有能夠利用尿素的微生物才能夠生長。閱讀閱讀22頁本課題使用的培養(yǎng)基配方頁本課題使用的培養(yǎng)基配方（二）微生物計數(shù)（二）微生物計數(shù)1 1、顯微鏡直接計數(shù)法、顯微鏡直接計數(shù)法1mm每一個大方格邊長為每一個大方格邊長為 1mm ，則每一大方格的面積為，則每一大方格的面積為1mm2，蓋上蓋玻片后，載玻片與蓋玻片之間的高度為蓋上蓋玻片后，載玻片與蓋玻

4、片之間的高度為0.1mm，所，所以計數(shù)室的容積為以計數(shù)室的容積為0.1mm3。1mm下面以一個大方格有下面以一個大方格有25個中方格的計數(shù)板為例進行計算：設個中方格的計數(shù)板為例進行計算：設五個中方格中總菌數(shù)為五個中方格中總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為，菌液稀釋倍數(shù)為B，那么，一個，那么，一個大方格中的總菌數(shù)是多少大方格中的總菌數(shù)是多少?1ml菌液中的總菌數(shù)菌液中的總菌數(shù)?(1ml=1cm3=1000mm3）5AB1045A缺點：缺點：不能區(qū)分死菌與活菌不能區(qū)分死菌與活菌2、統(tǒng)計菌落數(shù)目統(tǒng)計菌落數(shù)目稀釋涂布平板法稀釋涂布平板法（二）微生物計數(shù)（二）微生物計數(shù)平板菌落數(shù)統(tǒng)計注意事項1、幾個菌落粘連一起

5、，只要肉眼能區(qū)分，就算幾個；、幾個菌落粘連一起，只要肉眼能區(qū)分，就算幾個；2、不管菌落大小，只要肉眼看得見，就應該計數(shù)；、不管菌落大小，只要肉眼看得見，就應該計數(shù)；3、菌落數(shù)目過多時，可以合理采用樣方法。、菌落數(shù)目過多時，可以合理采用樣方法。某班級菌落數(shù)統(tǒng)計表格某班級菌落數(shù)統(tǒng)計表格第第1組組第第2組組第第3組組第第4組組151216519095256820717716235721781881024平均平均每每mL樣品樣品中活菌數(shù)中活菌數(shù)平板平板組別組別恰當?shù)南♂尪取⒄_的涂布操作恰當?shù)南♂尪?、正確的涂布操作是是成功地統(tǒng)計菌落數(shù)目的關鍵。成功地統(tǒng)計菌落數(shù)目的關鍵。（取樣（取樣0.1mL,稀釋倍數(shù)

6、稀釋倍數(shù)106）思考思考1 1：如何根據(jù)平板上的菌落數(shù)推測：如何根據(jù)平板上的菌落數(shù)推測出每出每mLmL樣品中的菌株數(shù)？樣品中的菌株數(shù)？ 統(tǒng)計某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，計算出平統(tǒng)計某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，計算出平板上的菌落數(shù)的平均值，然后按公式板上的菌落數(shù)的平均值，然后按公式每每mL樣品中樣品中的菌株數(shù)的菌株數(shù)=（CV）M進行計算。進行計算。思考思考2 2：統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的：統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目高還是低，為什么？實際數(shù)目高還是低，為什么？ 低。因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板低。因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。因此，上觀察到的只是一個菌落

7、。因此，統(tǒng)計結果一般用統(tǒng)計結果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)來表示菌落數(shù)而不是活菌數(shù)來表示。思考思考3 3：為了增強實驗結果的說服力和準確性，：為了增強實驗結果的說服力和準確性，我們在實驗設計時應該怎么做更合理？我們在實驗設計時應該怎么做更合理？ 實例分析實例分析1 1 第一位同學只涂布了一個平板，沒有設置重復第一位同學只涂布了一個平板，沒有設置重復組，因此結果不具有說服力。組，因此結果不具有說服力。 第二位同學考慮到設置重復組的問題，涂布了第二位同學考慮到設置重復組的問題，涂布了三個平板，但是其中三個平板，但是其中1個平板的計數(shù)結果與另外個平板的計數(shù)結果與另外2個個相差太遠，說明在操作過程中可能出

8、現(xiàn)了錯誤，因相差太遠，說明在操作過程中可能出現(xiàn)了錯誤，因此，不能簡單地將此，不能簡單地將3個平板的計數(shù)值用來求平均值。個平板的計數(shù)值用來求平均值。想一想：哪位同學的結果更接近真實值？你認為這兩想一想：哪位同學的結果更接近真實值？你認為這兩位同學的實驗需要改進嗎？如果需要，如何改進？位同學的實驗需要改進嗎？如果需要，如何改進？（三）實驗基本原則（三）實驗基本原則1、平行重復原則、平行重復原則實例分析實例分析2 2想一想：想一想：A同學和其他同學所得實驗結果差異同學和其他同學所得實驗結果差異 如此之大，請分析原因可能有哪些？如此之大，請分析原因可能有哪些？實例分析實例分析2 2想一想：你能通過設置

9、對照，幫助想一想：你能通過設置對照，幫助A同學排除同學排除 上述兩個可能影響實驗結果的因素嗎？上述兩個可能影響實驗結果的因素嗎？一種方案：一種方案： 可以由其他同學用與可以由其他同學用與A同學一樣的土樣進行實驗。同學一樣的土樣進行實驗。如果結果與如果結果與A同學一致，則證明同學一致，則證明A無誤；無誤；如果結果不同，則證明如果結果不同，則證明A同學存在操作失誤或培養(yǎng)同學存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題?；呐渲朴袉栴}。實例分析實例分析想一想：你能通過設置對照，幫助想一想：你能通過設置對照，幫助A同學排除同學排除 上述兩個可能影響實驗結果的因素嗎？上述兩個可能影響實驗結果的因素嗎？另一種方案：另

10、一種方案： 將將A同學配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進行同學配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。 實驗結果要有說服力，對照的設置實驗結果要有說服力，對照的設置是必不可少的！是必不可少的！ 實例啟示實例啟示設置對照實驗的目的是什么？ 排除實驗操作、培養(yǎng)條件等無關變量對實驗排除實驗操作、培養(yǎng)條件等無關變量對實驗結果的影響，提高實驗結果的可信度。結果的影響，提高實驗結果的可信度。（三）實驗基本原則（三）實驗基本原則1、平行重復原則、平行重復原則2、對照原則、對照原則3、單一變量原則、單一變量原則實驗名稱：實驗名

11、稱：土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)實驗原理：實驗原理：實驗目的：實驗目的：材料用具：材料用具：方法步驟：方法步驟：1、分組編號、分組編號 2、處理（遵循實驗設計的基本原則）、處理（遵循實驗設計的基本原則） 對照原則、單一變量原則（等量原則）對照原則、單一變量原則（等量原則） 科學性原則、平行重復原則科學性原則、平行重復原則 可行性原則可行性原則 3、觀察記錄（設計觀察記錄表）、觀察記錄（設計觀察記錄表）實驗預期：實驗預期：實驗結果的分析與評價：實驗結果的分析與評價：實驗結論：實驗結論：設計時請利用設計時請利用P23-P24的三個資料的三個資料（對照原則、單一變

12、量原則、平行（對照原則、單一變量原則、平行重復原則）重復原則）資料資料一一. .土壤取樣土壤取樣 從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準備好的左右，再取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中。信封中。資料二資料二. .樣品的稀釋樣品的稀釋 將樣品液稀釋，選用一定稀釋范圍的樣品液將樣品液稀釋，選用一定稀釋范圍的樣品液進行培養(yǎng)，以保證獲得進行培養(yǎng)，以保證獲得菌落數(shù)在菌落數(shù)在30-30030-300之間，之間，適于計數(shù)的平板。適于計數(shù)的平板。 分離不同的微生物能采用相同的稀釋度嗎？分離不同的微生物能采用相同的稀釋度嗎？測定土壤

13、中細菌的總量和測定土壤中能分解尿測定土壤中細菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？素的細菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？ 答：不能。這是因為土壤中各類微生物的數(shù)量答：不能。這是因為土壤中各類微生物的數(shù)量是不同的，例如在干旱土壤中的上層樣本中：是不同的，例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧好氧及兼性厭氧細菌及兼性厭氧細菌數(shù)約為數(shù)約為2 1852 185萬，萬，放線菌數(shù)放線菌數(shù)約為約為477477萬，萬，霉菌數(shù)霉菌數(shù)約為約為23.123.1萬。因此，為獲得不同類萬。因此，為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進行分離，同型的微生物，就需要按不同的稀釋度進行分離，同時

14、還應當有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。時還應當有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。資料二資料二. .樣品的稀釋樣品的稀釋 由于初次實驗，對于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇由于初次實驗，對于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個較為寬泛的范圍：了一個較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為稀釋倍數(shù)為10103 310107 7。 將樣品液稀釋，選用一定稀釋范圍的樣品液將樣品液稀釋，選用一定稀釋范圍的樣品液進行培養(yǎng)，以保證獲得進行培養(yǎng)，以保證獲得菌落數(shù)在菌落數(shù)在30-30030-300之間，之間，適于計數(shù)的平板。適于計數(shù)的平板。 將涂布好的培養(yǎng)皿放在將涂布好的培養(yǎng)皿放在30 30 溫度下培養(yǎng)。隨著溫度下培養(yǎng)。隨著培養(yǎng)時間的延

15、長，會有不同的菌落產(chǎn)生。培養(yǎng)時間的延長，會有不同的菌落產(chǎn)生。 以表格的形式記錄選擇培養(yǎng)基中不同菌落的特征。以表格的形式記錄選擇培養(yǎng)基中不同菌落的特征。 資料三資料三. .微生物的培養(yǎng)與觀察微生物的培養(yǎng)與觀察 1 1、取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都、取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。需要滅菌。2 2、應在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的、應在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。3 3、在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火、在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作。焰旁操作。注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期、平板培養(yǎng)樣品

16、的注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期、平板培養(yǎng)樣品的稀釋度等。稀釋度等。 1 1、結合對照，分析培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以、結合對照，分析培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出一些菌落。及選擇培養(yǎng)基是否篩選出一些菌落。2 2、是否獲得了某一稀釋度下，菌落數(shù)目在、是否獲得了某一稀釋度下，菌落數(shù)目在3030300300的平板。在這稀釋度下，是否至少有兩個的平板。在這稀釋度下，是否至少有兩個平板的菌落數(shù)相近？平板的菌落數(shù)相近？3 3、你統(tǒng)計的每克土壤中含有能分解尿素的細菌、你統(tǒng)計的每克土壤中含有能分解尿素的細菌的菌落數(shù)是多少？與其他同學的結果接近嗎？的菌落數(shù)是多少？與其他同學的結果接近嗎？如果差異很大，可能是什么原因引起的？如果差異很大，可能是什么原因引起的？方法：在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基方法：在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，培養(yǎng)某種細菌后，中加入酚紅指示劑，培養(yǎng)某種細菌后，如果如果pHpH升高，指示劑將變紅。升高，指示劑將變紅。濾膜法濾膜法 以測定飲用水中大腸桿菌的數(shù)目為例。將已知以測定飲用水中大腸桿菌的數(shù)目為例。將已知體積的水過濾后，將濾膜放在伊紅美