酵母菌的分離純化試驗(yàn)方案-酵母菌的分離純化試驗(yàn)

1、酵母菌的分離純化實(shí)驗(yàn)?zāi)康? .了解培養(yǎng)基的配置與滅菌技術(shù)；2 .無(wú)菌操作技術(shù)；3 .工業(yè)微生物的分離與純化技術(shù)；4 .工業(yè)微生物的檢測(cè)及保藏?；驹?、 培養(yǎng)基是人工配置的用于培養(yǎng)、分離、鑒定和保存各種微生物的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。也適合微生物在生命活動(dòng)中積累各種代謝產(chǎn)物。由于微生物種類不同，營(yíng)養(yǎng)類型各異以及實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，因此培養(yǎng)基的種類也很多。不同微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求不同，在配置時(shí)根據(jù)微生物對(duì)PH的要求選擇合適的PH。由于本次實(shí)驗(yàn)主要是分離純化酵母菌，所以配置的培養(yǎng)基是適合酵母菌生長(zhǎng)麥芽汁平板培養(yǎng)基，同時(shí)添加抗生素抑制霉菌及其它菌的生長(zhǎng)。2、 接種和培養(yǎng)過(guò)程中必須保證不被其它微生物所污染，關(guān)鍵在于嚴(yán)格進(jìn)

2、行正確的無(wú)菌操作，但是絕對(duì)無(wú)菌是不可能的，只能人工創(chuàng)造相對(duì)無(wú)菌的環(huán)境。所以本次實(shí)驗(yàn)無(wú)菌操作是在超凈工作臺(tái)的酒精燈火焰旁進(jìn)行。3、 把特定微生物從混雜的微生物群體中分離出來(lái)而獲得某一種或某一株微生物的過(guò)程叫微生物的分離與純化。首先根據(jù)其生長(zhǎng)特性設(shè)計(jì)只利于此菌生長(zhǎng)的條件，再根據(jù)各種稀釋法使他們?cè)诠腆w培養(yǎng)基上單獨(dú)長(zhǎng)成菌落。分離純化的方法通常有：稀釋混合倒平板法、稀釋涂布平板法和平板劃線。此次實(shí)驗(yàn)采用梯度稀釋涂布平板法。4、 微生物檢測(cè)項(xiàng)目最常用的是細(xì)胞數(shù)的檢測(cè)，方法比較多，主要有顯微鏡直接計(jì)數(shù)法、平板菌落計(jì)數(shù)法（CFU、光電比濁計(jì)數(shù)法等。本次實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)酵母菌的數(shù)量檢測(cè)，選用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法和平板菌落計(jì)

3、數(shù)法。實(shí)驗(yàn)器材儀器設(shè)備恒溫水浴鍋、電熱干燥箱、蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、水浴鍋、電爐、銅鍋、酒精燈、接種環(huán)、電子天平、研缽、光學(xué)顯微鏡、血細(xì)胞計(jì)數(shù)器玻璃器皿燒杯、錐形瓶、大小試管、培養(yǎng)皿、漏斗、三角涂棒、吸管、試管架、玻璃涂棒、蓋玻片試劑與材料蘋果、大麥芽、瓊脂、蒸儲(chǔ)水、碘液、抗生素、染色液其它紗布、濾紙實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及操作步驟（一）、樣品的選擇酵母菌一般在果園的土壤中或者水果的表面含量較多，因此選擇蘋果為樣品。（二）、樣品的處理制備蘋果懸液1. 首先將1g蘋果在研缽中磨細(xì)，放入裝有10ml生理鹽水和玻璃珠的100ml三角瓶中去。2. 激烈震蕩約10min,使菌體分散并懸浮與液體

4、中。3. 用無(wú)菌吸管吸取1ml蘋果懸液注入盛有9ml生理鹽水的試管中，吸取三次并混勻。4. 再去一只無(wú)菌吸取管，從此試管中吸取1ml,注入另一盛有9ml生理鹽水的試管中，取三次并混勻。5. 同法類推制成10-3、10-4、IO-5、IO-6、10-7的各種稀釋度的蘋果懸液。（三）、培養(yǎng)基的制備與滅菌1、培養(yǎng)基的選擇：選擇麥芽汁為培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母菌2、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基的制備取新鮮麥芽汁200mL在65c水浴中糖化34小時(shí)，糖化程度可用碘滴定之。加水約400mL,調(diào)勻至生泡沫時(shí)為止，然后倒在糖化液中攪拌煮沸后再過(guò)濾。將糖化液用4-6層紗布過(guò)濾，濾液如混濁不清，可用雞蛋白澄清，方法是將一個(gè)雞蛋白加水約

5、20mL,調(diào)勻至生泡沫時(shí)為止，然后倒在糖化液中攪拌煮沸后再過(guò)濾。將濾液稀釋到5-6波美度，pH約6.4,加入2%瓊脂即成。121c滅菌30min。培養(yǎng)皿采用干熱滅菌（蒸汽滅菌鍋）生理鹽水稱取氯化鈉0.43g,加入50ml水，裝入100ml小錐形瓶中，滅菌備用。3、分裝已過(guò)濾滅菌的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行分裝。因要制作平板和斜面培養(yǎng)基，所以需將培養(yǎng)基分裝于培養(yǎng)皿和試管中。分裝時(shí)，一手捏松彈簧夾，使培養(yǎng)基流出，另一只手握住幾支試管或培養(yǎng)皿，依次接取培養(yǎng)基。分裝時(shí)，注意不要使培養(yǎng)基粘附管口或培養(yǎng)皿口，以免浸濕棉塞引起雜菌污染。裝入試管的培養(yǎng)基量，視試管和培養(yǎng)皿的大小及需要而定。一般制作斜面培養(yǎng)基時(shí)，每只15X1

6、50毫米的試管，約裝34毫升（1/41/3試管高度），如制作深層培養(yǎng)基，每只20X220毫米的試管約裝1215毫升。4、加棉塞分裝完畢后，需要用棉塞堵住管口或瓶口。堵棉塞的主要目的是過(guò)濾空氣，避免污染。棉塞應(yīng)采用普通新鮮、干燥的棉花制作，不要用脫脂棉，以免因脫脂棉吸水使棉塞無(wú)法使用。制作棉塞時(shí)，要根據(jù)棉塞大小將棉花鋪展成適當(dāng)厚度，揪取手掌心大小一塊，鋪在左手拇指與食指圈成的圓孔中，用右手食指插入棉花中部，同時(shí)左手食指與姆指稍稍緊握，就會(huì)形成1個(gè)長(zhǎng)棒形的棉塞。棉塞作成后，應(yīng)迅速塞入管口或瓶口中，棉塞應(yīng)緊貼內(nèi)壁不留縫隙，以防空氣中微生物沿皺折侵入。棉塞不要過(guò)緊過(guò)松，塞好后，以手提棉塞、管、瓶不下落

7、為合適。棉塞的2/3應(yīng)在管內(nèi)或瓶?jī)?nèi)，上端露出少許棉花便于拔取。塞好棉塞的試管和錐形瓶應(yīng)蓋上厚紙用繩捆札，準(zhǔn)備滅菌。5、制作斜面培養(yǎng)基和平板培養(yǎng)基培養(yǎng)基滅菌后，制作斜面培養(yǎng)基和平板培養(yǎng)基，須趁培養(yǎng)基未凝固時(shí)進(jìn)行。（1）制作斜面培養(yǎng)基。在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上放1支長(zhǎng)0.51米左右的木條，厚度為1厘米左右。將試管頭部枕在木條上，使管內(nèi)培養(yǎng)基自然傾斜，凝固后即成斜面培養(yǎng)基。（2）制作平板培養(yǎng)基。將剛剛滅過(guò)菌的盛有培養(yǎng)基的錐形瓶和培養(yǎng)皿放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，點(diǎn)燃酒精燈，右手托起錐形瓶瓶底，左手拔下棉塞，將瓶口在酒精燈上稍加灼燒，左手打開培養(yǎng)皿蓋，右手迅速將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，每皿約倒入10毫升，以鋪滿皿底為度。鋪放培養(yǎng)基后

8、放置15分鐘左右，待培養(yǎng)基凝固后，再5個(gè)培養(yǎng)皿一疊，倒置過(guò)來(lái)，平放在恒溫箱里，24小時(shí)后檢查，如培養(yǎng)基末長(zhǎng)雜菌，即可用來(lái)培養(yǎng)微生物。（四）、樣品的分離純化1、倒制平板將麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基加熱熔化，冷卻至55-60°Co加入抗生素1ml并混勻。在超凈工作臺(tái)的酒精燈火焰旁倒制平板。2、涂布平板將上述培養(yǎng)基的5個(gè)培養(yǎng)基的四個(gè)平板分別標(biāo)上10-3、10-4、10-5、10-6、10-7五種稀釋度。取5只無(wú)菌吸管，分別從四種蘋果懸液的稀釋液中各取0.1ml。對(duì)號(hào)放于已標(biāo)記好稀釋度的平板中，用無(wú)菌玻璃涂棒在培養(yǎng)基表面輕輕涂布均勻。重復(fù)以上4步驟。3、倒置培養(yǎng)將培養(yǎng)基平板倒置，與30-320C溫箱中

9、培養(yǎng)2天。4、觀察挑菌觀察培養(yǎng)后長(zhǎng)出的酵母菌的單個(gè)菌落，分別挑取并接種于斜面培養(yǎng)基上，再培養(yǎng)。待菌苔長(zhǎng)好后，檢查是否有雜菌，若有則需再一次進(jìn)行分離純化，直到獲得純菌株培養(yǎng)物。5、最大然數(shù)法計(jì)數(shù)原每毫升樣品中酵母數(shù)量漏釋彳音數(shù)*最大然數(shù)（五）、酵母菌的制片、染色及形態(tài)觀察以及計(jì)數(shù)酵母菌的個(gè)體形態(tài)一般可采用水浸片進(jìn)行活體觀察。1、觀察菌落和菌苔并記錄菌落形態(tài)特征制作酵母菌水浸片顯微標(biāo)本片1、在干凈的載玻片上滴上一滴蒸儲(chǔ)水，用接種環(huán)進(jìn)行無(wú)菌操作，挑取培養(yǎng)物少許，置載玻片的水滴中，與水混合做成懸液并涂成直徑約1厘米的薄層，為避免因菌數(shù)過(guò)多聚成集團(tuán)，不利觀察個(gè)體形態(tài)，可在載玻片之一側(cè)再加一滴水，從已涂布的菌液中再取一環(huán)于此水滴中進(jìn)行稀釋，涂布成薄層，若材料為液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物中洗下制備的菌液，則直接涂布于載玻片上即可。2、酵母菌美藍(lán)水浸片的制作：染色加蓋玻片觀察鑒別3、酵母菌碘液水