重組質粒的原核表達

1、實驗九表達質粒的構建與誘導表達第一節(jié)原核表達概述基因工程的研究一方面是獲得基因的表達產物，另一方面是研究基因結構與功能的關系，最終都涉及目的基因的表達問題。表達載體(expressvector)是指本身攜帶有宿主細胞基因表達所需的調控序列，能使克隆的基因在宿主細胞內進行轉錄與翻譯的載體。也就是說，克隆載體只是攜帶外源基因，使其在宿主細胞內擴增；表達載體不僅使外源基因擴增，還使其表達。表達載體在基因工程中具有十分重要的作用。外源基因在宿主(受體)細胞內是否表達以及表達水平受到許多因素(調控元件)的制約：1.正確的閱讀框架為了獲得正確編碼的外源蛋白，外源基因編碼區(qū)在插入表達質粒中原核基因編碼區(qū)時，

2、閱讀框架應保持一致。閱讀框架是由每三個核甘酸為一組連接起來的編碼序列，外源基因只有在它與載體DNA的起始密碼相吻合時，才算處于正確的閱讀框架之中，從而表達融合蛋白，使外源蛋白與宿主蛋白相融合。2.目的基因有效轉錄的啟動子啟動子(promoter)是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結合并能起始mRNA合成的序列，它是基因表達不可缺少的重要調控序列。原核啟動子是由兩段彼此分開且又高度保守的核甘酸序列組成的，分別稱為一35區(qū)和一10區(qū)。一35區(qū)的序列為TTGACA,一10區(qū)序列為TATAAT。此兩序列之間的最佳間距為17bp?？膳cRNA聚合酶結合，并指導該酶在正確的轉錄部位開始合成mRNA。由于細菌R

3、NA聚合酶不能識別真核基因的啟動子，因此原核表達載體必須用原核啟動子帶動真核基因在原核生物中轉錄。原核表達載體啟動子的轉錄常常是可以控制的，即一般情況下不轉錄，而受誘導劑誘導時就能轉錄，帶動外源基因的高效表達。目前常用的啟動子：如大腸桿菌的lac啟動子是乳糖操縱子的啟動子，受lacI編碼的阻遏蛋白調節(jié)控制；trp等啟動子是色氨酸操縱子啟動子，受trpR編碼的阻遏蛋白調節(jié)控制；tac啟動子，由lac啟動子的一10區(qū)和trp啟動子的一35區(qū)融合而成，匯合了lac和trp兩者優(yōu)點，是一個很強的啟動子，受lacI編碼的阻遏蛋白調節(jié)；lacUV5啟動子是經紫外線誘變改造后的lac啟動子，該啟動子失去CA

4、P和cAMP的正調控，只要有乳糖或IPTG存在時就能夠啟動轉錄；噬菌體的入PLR啟動子是入噬菌體左、右向啟動子，是一個溫度敏感的阻遏蛋白受溫度調控的很強的啟動子；T7噬菌體啟動子，比大腸桿菌啟動子強得多，并且十分專一，只被T7RNA聚合酶所識別；SV40啟動子、多角蛋白啟動子以及花椰菜花葉病毒(CaMV)啟動子。3 .轉錄終止子構建表達載體時，為了穩(wěn)定載體系統(tǒng)，防止克隆的外源基因干擾表達載體的穩(wěn)定性，一般要在多克隆位點的下游插入一段很強的核糖體RNA轉錄終止子(terminator)o否則合成的mRNA過長，不僅消耗細胞內的底物和能量，而且容易使mRNA形成妨礙翻譯的二級結構。原核基因的轉錄終

5、止序列包括依賴Rho蛋白和不依賴Rho蛋白兩種。不依賴Rho的終止信號序列都含發(fā)夾結構，末端為一連串T及YRTCTG。4 .mRNA有效翻譯的SD序列在原核生物中，mRNA分子上有兩個核糖體結合位點(ribosomebindingsite,RBS)也調節(jié)著mRNA的翻譯，一個是起始密碼(AUG或GUG),另一個是位于起始密碼上游311個核甘酸處的由39個核甘酸組成的一段保守序列AGGAGGU,這段序列富含喋吟核甘酸，稱為SD序列。而核糖體和mRNA的結合是由SD序列以及與起始密碼子AUG之間的距離決定的。因此，SD序列和它的起始密碼子AUG之間的距離是影響外源基因在原核生物中表達量高低的重要因

6、素。SD序列與AUG間隔9個堿基最為合適，其間距離過長或過短都會影響目的基因的表達，有時由于這種距離的影響，蛋白質合成水平會相差2000倍以上。且SD序列與AUG之間的堿基最好是A或U,一3位最好是A。5 .轉錄、翻譯后的適當修飾和加工真核生物基因表達的產物往往需要進行適當?shù)男揎椉庸?，但由于大腸桿菌本身的蛋白質翻譯后修飾加工系統(tǒng)相當不完善，表達的真核蛋白質不能形成適當?shù)恼郫B或糖基化修飾。并且不同宿主其修飾系統(tǒng)也不一樣，所以選擇宿主時應注意。6 .信號序歹U(signalsequence)在原核細胞中，合成的蛋白能否分泌到細胞外與mRNA編碼區(qū)上游的一段信號序列有關。這段編碼序列翻譯的1530個

7、氨基酸為蛋白質N端的信號肽，它能攜帶蛋白質跨膜并分泌到細胞外。脂雙層和負電荷的質膜通過和信號肽的疏水相互作用以及電荷的吸引是信號肽能跨膜分泌的主要原因。當信號肽攜帶后面的蛋白質跨膜分泌后，信號肽即被質膜上的信號肽酶切除得到有功能的成熟蛋白質。因此根據(jù)不同的需要，人們構建了不同的在原核細胞中高效表達的載體，這些載體通常具有以下幾個特點：有一個強的原核啟動子及兩側的調控序列；位于讀碼框上游的SD序列與起始密碼子AUG之間有合適的距離；在外源基因和啟動子之間有正確的閱讀框架；外源基因下游應加入不依賴p因子的轉錄終止區(qū)。一般表達載體都具有多克隆位點，對表達載體和外源基因用相同的兩種酶雙酶切后，再用T4

8、DNA連接酶把外源片段連入表達載體中，通過酶切、PCR鑒定，如果插入的片段大小和方向與外源基因一致，則成功構建了重組子。將克隆的基因插入合適載體后導入大腸桿菌用于表達大量蛋白質的方法一般稱為原核表達。這種方法在蛋白純化、定位及功能分析等方面都有應用。大腸桿菌用于表達重組蛋白有以下特點：易于生長和控制；用于細菌培養(yǎng)的材料不及哺乳動物細胞系統(tǒng)的材料昂貴；有各種各樣的大腸桿菌菌株及與之匹配的具各種特性的質?？晒┻x擇。但是，在大腸桿菌中表達的蛋白由于缺少修飾和糖基化、磷酸化等翻譯后加工，常形成包涵體而影響表達蛋白的生物學活性及構象。原核表達載體通常為質粒，典型的原核表達載體應具有以下幾種元件：（1）選

9、擇標記的編碼序列；（2）可控轉錄的啟動子；（3）轉錄調控序列（轉錄終止子，核糖體結合位點）；（4） 一個多種單一限制性內切酶位點序列；（5）宿主體內自主復制的序列原核表達的一般程序：1獲得目的基因2準備表達載體3將目的基因插入表達載體中（測序驗證）一一表達質粒的構建4表達質粒轉化相應的宿主菌5外源基因的誘導表達（誘導靶蛋白的表達）6表達蛋白的分析原核表達的基本操作步驟舉例：一、試劑準備1、LB養(yǎng)基。2、100mMIPTG（異丙基硫代-3-D-半乳糖昔）：2.38gIPTG溶于100mlddHzO中，0.22m濾膜抽濾，-20C保存。二、操作步驟（一）獲得目的基因1、通過PCR方法：以含目的基因

10、的克隆質粒為模板，按基因序列設計一對引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點），PCR循環(huán)獲得所需基因片段。2、通過RT-PCR方法：用TRIzol法從細胞或組織中提取總RNA,以mRNA為模板，逆轉錄形成cDNA第一鏈，以逆轉錄產物為模板進行PCR循環(huán)獲得產物。（二）構建重組表達質粒1、載體酶切：將表達質粒用限制性內切酶（同引物的酶切位點）進行雙酶切，酶切產物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。2、PCR產物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體。（三）獲得含重組表達質粒的表達菌種1、將連接產物轉化大腸桿菌DH5a,根據(jù)重組載體的標志（抗Amp或藍白斑）作篩選

11、，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質粒，雙酶切初步鑒定。2、測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確，進入下步操作。否則應篩選更多克隆，重復亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。3、以此重組質粒DNA轉化表達宿主菌的感受態(tài)細胞。（四）誘導表達1、挑取含重組質粒的菌體單斑至2mlLB（含Amp50科g/ml）中37c過夜培養(yǎng)。2、按1：50比例稀釋過夜菌，一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中，37c震蕩培養(yǎng)至OD60000.4-1.0（最好0.6,大約需3h）。3、取部分液體作為未誘導的對照組，余下的加入IPTG誘導劑至終濃度0.4mM作為實驗組，兩組繼續(xù)37c震蕩培養(yǎng)3hr。4、分

12、別取菌體1ml,離心12000gX30S收獲沉淀，用100dL1%SDS重懸，混勻，70C10min。5、離心12000gX1min,取上清作為樣品，可做SDS-PAGE等分析。三、注意事項1、選擇表達載體時，要根據(jù)所表達蛋白的最終應用考慮。如為方便純化，可選擇融合表達；如為獲得天然蛋白，可選擇非融合表達。2、在構建表達質粒時，要注意使外源基因與載體DNA的起始密碼相吻合時，使其處于正確的閱讀框架之中。3、融合表達時在選擇外源DNA同載體分子連接反應時，對轉錄和轉譯過程中密碼結構的閱讀不能發(fā)生干擾。四、評議1 .表達質粒的構建的實驗操作基本上與擴增質粒的構建相同，只是構建表達質粒時為了高效表達

13、外源基因，一般目的基因應與載體的相關DNA片段相融合。融合蛋白在大腸桿菌中的表達的優(yōu)點如下：融合蛋白N端由正常的大腸桿菌本身序列所控制。容易獲得高效表達；融合蛋白往往不被大腸桿菌視為異己蛋白，更為穩(wěn)定。2 .表達載體與目標基因在體外重組完成后，必須導人特定的受體細胞如：BL21（DE3）,使之無性繁殖，直接改變其遺傳性狀。3 .在外源基因克隆到表達載體時，應注意其序列的ORF的正確與否，它直接決定其編碼的氨基酸序列，并且直接影響蛋白質的功能。如果ORF內堿基對發(fā)生缺失突變或插入突變，即插入或缺失非3的倍數(shù)的堿基對，那么ORF就可能發(fā)生改變，而得到一個截然不同的蛋白質產物，這種變化就是移碼突變。

14、如果發(fā)生突變形成了終止密碼子，就會產生提前終止的、不完整的蛋白質，即無意義突變。其可分三種情況：琥珀突變（amber）,原來的密碼子突變?yōu)閁AG;赭石突變（ochre）,原來的密碼子突變?yōu)閁AA;乳白石突變（opal）,原來的密碼子突變?yōu)閁GA。4 .為了使外源基因在原核細胞中高效表達應利用蛋白酶缺陷型的宿主，如用10n營養(yǎng)缺陷型減少外源蛋白的降解。因為黃喋吟核甘（1on）是大腸桿菌合成蛋白酶的主要底物。10n營養(yǎng)缺陷型宿主不能合成黃喋吟核甘，從而不能合成蛋白酶。第二節(jié)外源基因的誘導表達一、實驗目的了解誘導外源基因表達的基本原理，學習和掌握誘導外源基因表達的常用的方法，為SDS-PAGE分析做

15、準備。二、實驗原理外源基因在原核生物中高效表達除了有適合的載體外，還必須有適合的宿主菌以及一定的誘導因素。宿主菌的選擇對外源基因的表達是至關重要的，因為外源基因（特別是真核基因）在細菌中的表達往往不夠穩(wěn)定，常常被細菌中的蛋白酶降解。因此有必要對細菌菌株進行改造，使其蛋白酶的合成受阻，從而使表達的蛋白得到保護。實驗中常用的宿主菌是經過改造的JMl09、BL21等大腸桿菌菌株。通常表達質粒不應使外源基因始終處于轉錄和翻譯之中,因為某些有價值的外源蛋白可能對宿主細胞是有毒的，外源蛋白的過量表達必將影響細菌的生長。為此，宿主細胞的生長和外源基因的表達是分成兩個階段進行的,第一階段使含有外源基因的宿主細

16、胞迅速生長.以獲得足夠量的細胞；第二階段是啟動調節(jié)開關，使所有細胞的外源基因同時高效表達，產生大量有價值的基因表達產物。在原核基因表達調控中，阻遏蛋白與操縱基因系統(tǒng)起著重要的開關調節(jié)作用,當阻遏蛋白與操縱基因結合時,阻止基因的轉錄。加入誘導物后；使其與阻遏蛋白結合，解除阻遏，從而啟動基因轉錄。根據(jù)表達載體的不同，外源基因表達常采用化學誘導與溫度誘導兩種方法。pET及pBV系列表達載體是近年來被廣泛應用的兩種誘導方式的代表性原核表達系統(tǒng)。1.化學誘導對于pET系列表達載體，當目的基因被克隆在T7轉錄和翻譯信號控制的正確相位后,加入IPTG進行誘導,使宿主菌表達T7RNA聚合酶，進而誘導目的基因以

17、融合蛋白的形式進行表達,該系統(tǒng)以其獨特的優(yōu)勢，在基因表達中應用較為廣泛。pET±*J*f2l4-i呢n:欣1(I5HJ碗地蜘&噫I*而時*01門丁&Safi(|791r(LKJ5Et»RW叫所411>|州¥與eMW網swtlHiiwi(加避丁(J"!)E11440)1AsMriw)CW伊|力WAmI41123)碗1川附B對I信口酊!虧1122051Al伊，MH駕用府口睜陽口麻lj-M息I(441RwHUlIf現(xiàn)fcaft廿Ur?”駟LC陶野£11111111(3224)卻愉船HIMI3W5|DA1川那制rr早回收即淵嗎hT

18、T吊函于兩京花即EACTCACT園33&因從燈150冉網口GATAHAEVECTrTMiAAATMWTKiEMVFTAjMkAMiG/G*342g.T0/.WSaH_"吼一婀1_JHmHr；T1二布看1tme灰定而五訐而訴求cE武公點市節(jié)就況E5fcWF而嬴仁AMSnrfiET-lMdIMietGtyAmGlySvtGinMwQbnL«wArt心|OlaAltC”口中ArtThr*r|AllPro%HrFraFroLeuAtjSer<ilyCysLnd.口JTCMCii«Tm因尉rKnMKTHGmiACAAWnuOGOCcGCAjCTGiAlJCAC

19、CAJCCACCATCMXMTO用G島TOCGGCTOCT兒MYAMCOC1GLyAivA弱Pro-AfaSffSet融rVilAbpLyLcmA.iaAEiAllUtu6加HitHuiHiiMiuH”HbEnd1GGTCGeMCraAArTOa急2rcmTCOA£*AflCTTOC(MXtl3C*E©ACICAL3X*口CMt舄(X內仃0依抽加七仃£父11過了4匕5川寅(1：GtyArgmAqplieArf.AllPro5urI>rSerLmProHAThrThrThrThtThrGlHeArjLmJLeuThrLyiPro載體pET由于帶有來自大腸桿菌的

20、乳糖操縱子，它由啟動基因、分解產物基因活化蛋白(CAP)結合位點、操縱基因及部分半乳糖酶結構基因組成，受分解代謝系統(tǒng)的正調控和阻遏物的負調控。正調CAP(catabolitegeneactivationprotein)因子和cAMP來激活啟動子，促使轉錄；負調控則是由調節(jié)基因(lacI)產生Iac阻遏蛋白與操縱子結合，阻遏外源基因的轉錄和表達,此時細胞大量生長繁殖。乳糖的存在和CtXkT山UiCMT兒*CTAtKHAACCCCTTgGCiC：CmAAA0GGCirrCTTOaCXiGCiI1111TlCi仃餅止于于曲曬招31可解除這種阻遏,另外IPTG是3半乳糖昔酶底物類關于表達質粒pET系列

21、的詳細資料與圖表可在httpa/www.erndbiosciencecom/html/似物，具有很強的誘導能力，能與阻遏蛋白結合，使操縱子游離，誘導lacZ啟動子轉錄，于是外源基因被誘導而局效轉錄和表達。所以可以通過在培養(yǎng)基中添加IPTG誘導基因的表達。2.溫度誘導pBV系列表達載體，重組插入PL、R啟動子下游的目的基因直接表達受溫度變化調控，以非融合蛋白的形式進行表達，該系統(tǒng)尤其適合表達對細胞有毒害的蛋白。當用P-R啟動子構建表達質粒時，Pl、r啟動子受入噬菌體CI基因的負調控，CI基因廣生的阻遏蛋白結合在操縱基因上，阻止轉錄白進行。目前利用CI的溫度敏感突變基因（cits857）調節(jié)這種阻

22、遏。當在2830c培養(yǎng)時，該突變體產生有活性的阻遏蛋白，阻遏P-r轉錄，細菌大量生長。在獲得足夠量菌體后，使溫度上升至42C.造成阻遏蛋白失活，Pl、r解除阻遏，啟動外源基因的高效轉錄和表達，從而合成大量有價值的外源蛋白。三、注意事項1 .在進行誘導實驗中要注意應以含有空載體的宿主菌株以及IPTG誘導前的含有重組子的宿主菌株做對照。t2 .IPTG誘導的最終濃度為0.31mmol/L。；3 .誘導后的培養(yǎng)時間一般不超過3hoi4 .有些工程菌，在IPTG誘導后，其發(fā)酵溫度降低為30C,則可產生誘導蛋白。！四、評議！1 .在配制SDS上樣緩沖液中，可用8%的3一疏基乙醇替代其中的400mmol/

23、LDTT。；2 .異源基因融合表達后面臨著蛋白質降解問題。在大腸桿菌細胞中有兩個結構影響蛋白質的穩(wěn)定性：大腸桿菌細胞中，凡蛋白質N端為精氨酸（Arg）、賴氨酸（Lys）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）和色氨酸（Trp）等殘基的穩(wěn)定性差，半衰期約2min,而N端如果不是這些氨基酸殘基，半衰期可長達10h。蛋白質N端內部附近如含有賴氨酸殘基，其是泛素蛋白的受體，易被依賴于泛素蛋白的蛋白酶降解。3 .分析被檢測基因在細胞中轉錄和翻譯的情況有以下方法：Northern雜交，檢查細胞中是否含有特定的mRNA;SDS-PAGE分析誘導前后細胞中目的蛋白質的表達水平；在Western

24、雜交中用特異性抗體分析目的蛋白質的存在及含量；利用ELISA等免疫學方法，檢測基因表達的強度；直接測定目的蛋白的生物活性，根據(jù)活性的大小估計蛋白質的表達量也可將報告基因（如lacZ）克隆在目的基因的下游，根據(jù)報告基因的轉錄或翻譯情況，估計目的蛋白的表達量。4 .從目的基因的堿基數(shù)目推算其表達的蛋白質的相對分子質量。；計算方法一：Mr115Xn+3（其中n是基因的堿基數(shù)）。如表達的基因為1.7kb,其表達蛋白質的相對分子質量大約為：Mr：115Xn+3=115X1700+3=64833P65X10。計算方法二：1.0kbDNA相當于333氨基酸，即相對分子質量大約為37X103的蛋白質。如表達的

25、基因為1.7kb,其表達蛋白質的相對分子質量大約為：Mr=1.7X37-63X103。5 .誘導表達蛋白時應注意凋整誘導培養(yǎng)的溫度，不同的蛋白可能有不同的要求。第三節(jié)表達蛋白的SDS-PAGE分析一、實驗目的利用SDS-PAGE檢測表達蛋白，確定蛋白質的相對分子質量，并掌握其原理與方法。二、實驗原理電泳是帶電顆粒在電場作用下，向著與其電荷相反的電極移動的現(xiàn)象，影響泳動速度的因素主要有顆粒的性質、電場強度和溶液的性質等。顆粒直徑、形狀以及所帶的靜電荷量對泳動速度都有較大影響。一般來說，顆粒帶凈電荷量越大，或其直徑越小，或其形狀越接近球形，在電場中的泳動速度就越快。反之則越慢。電場強度對電泳速度起

26、著十分重要的作用。電場強度越高，帶電顆粒的泳動速度就越快，反之則越慢。溶液性質主要是指電極溶液和蛋白質樣品溶液的pH、離子強度和黏度等。溶液的pH決定帶電顆粒的解離程度，也即決定其凈電荷的量。對蛋白質而言，溶液的pH離其等電點愈遠，則其帶凈電荷量就愈大，從而泳動速度就愈快。反之則愈慢。一般溶液的離子強度在0.020.2之間時。電泳較合適。若離子強度過高，則會降低顆粒的泳動度。其原因是，帶電顆粒能把溶液中與其電荷相反的離子吸引在自己周圍形成離子擴散層，這種靜電引力作用的結果，導致顆粒泳動度降低，若離子強度過低，則緩沖能力差，往往會因溶液pH變化而影響泳動度的速率。溶液黏度與泳動度成反比例關系。溶

27、液的性質還通過影響帶電顆粒的空間構象而影響其電泳行為。聚丙烯酰胺凝膠（PAG）是由單體丙烯酰胺（acrylamide）和交聯(lián)共聚單位（雙體）N'N-甲叉雙丙烯酰胺（N,N-methylene-bis-acrylaimide）為材料，在引發(fā)劑過硫酸鏤（APS）和增速劑N,N,N',N'一四甲基乙二胺TEMED（N,N,N',N-tetramethylenediamine）的作用下聚合交聯(lián)形成含酰胺基側鏈的脂肪族長鏈，在相鄰長鏈之間通過甲叉橋連接而形成的三維網狀結構物質。聚丙烯酰胺凝膠孔徑的大小與鏈長度和交聯(lián)度有關，無論丙烯酰胺的量的多少，當N,N-甲又雙丙烯酰胺的

28、量為總丙烯酰胺的5%時，其平均孔徑最小，因此一般將N,N'-甲又雙丙烯酰胺的含量固定于總量的5%,然后通過改變丙烯酰胺的總量來調節(jié)孔徑的大小，即有效孔徑隨著丙烯酰胺的總量的增加而減少。聚丙烯酰胺凝膠的強度好，有彈性、透明化學性質穩(wěn)定，在不同pH和溫度下變化較小，在很多溶劑中不溶，為非離子型。沒有吸附和電滲作用，是一種極好的電泳介質。聚丙烯酰胺凝膠電泳具有分辨率高、上樣量大、回收的樣品較純等特點，但它操作麻煩，且不能分離較大的分子。通常用它分析蛋白質以及分析和制備小于1kb的DNA或RNA片段。主要用于分離蛋白質和測定蛋白質亞基相對分子質量。但應注意丙烯酰胺是一種潛在的神經毒素，其作用效

29、應能積累，操作時應戴手套。SDSPAGE（sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis,十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳），主要用于分離蛋白質和測定蛋白質亞基相對分子質量。SDS是一種陰離子去污劑，作為變性劑和助溶劑，它能斷裂分子內和分子間的氫鍵和疏水鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質分子的二級和三級結構；強還原劑，如疏基乙醇和二硫蘇糖醇則能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入SDS和還原劑后，蛋白質分子被解聚成單個亞基。解聚后的氨基酸側鏈與SDS充分結合形成帶有負電荷的蛋白質-SDS膠束。所帶的負電荷大大超過了蛋白分子原有

30、的電荷量，這就消除了不同分子之間原有的電荷差異。使蛋白質分子的電泳遷移率不再受蛋白質原有電荷和形狀的影響，而主要取決于蛋白質或亞基相對分子質量的大小。SDS電泳成功的關鍵之一是電泳過程中，特別是樣品制備過程中蛋白質和SDS的結合程度。影響它們結合的因素主要有三個：溶液中SDS單體的濃度。SDS在水溶液中是以單體和SDS多肽膠束（SDSpolypeptidemicelles）混合形式存在的，能與蛋白質分子結合的是單體。單體的濃度與SDS總濃度、溫度、和離子強度有關。由于SDS與蛋白質結合是按重量成比例的，即在一定溫度和離子強度下，當SDS總濃度增加到某一定值時，溶液中的SDS濃度不再隨SDS總濃

31、度的增加而升高。當SDS單體濃度大于1mmol/L時，大多數(shù)蛋白質與SDS結合的重量比為1:1.4,如果SDS單體濃度降到0.5mmol/L以下時，二者的結合比僅為1:0.4。這樣就不能消除蛋白質原有的電荷差別，也就不能進行相對分子質量測定。為了保證蛋白質與SDS的充分結合，它們的重量比應為1:4或1:3。高溫有利于SDS與蛋白質的結合，樣品處理時常在沸水浴中保溫。樣品緩沖液的離子強度。因為SDS結合到蛋白質分子上的量僅決定于平衡時SDS的單體濃度。不是總濃度，而只在低離子強度的溶液中，SDS單體才具有較高的平衡濃度。所以SDS電泳的樣品緩沖液離子強度較低，常為10100mmol/L。二硫鍵是

32、否完全被還原。只有二硫鍵被徹底還原后，蛋白質分子才能被解聚，SDS才能定量地結合到亞基上而給出相對遷移率和相對分子質量對數(shù)的線性關系。因此電泳時蛋白質分子的遷移速度僅取決于分子的大小，可根據(jù)大小蛋白質分子在聚丙烯酰胺凝膠中電泳速度不同即可分離蛋白質，并測出它們的相對分子質量。當?shù)鞍踪|相對分子質量在（12165）X103之間，蛋白質分子的遷移率與相對分子質量的對數(shù)呈直線關系，符合logMr=Kbx。（Mr為相對分子質量，x為遷移率，K、b均為常數(shù)）。SDS-PAGE還有以下特征：1）濃縮效應：在不連續(xù)緩沖系統(tǒng)中，樣品在進入分離膠以前，先經過大孔徑濃縮膠的遷移作用而被濃縮至一極窄的區(qū)帶。其作用原理

33、是在緩沖系統(tǒng)中的弱酸，如甘氨酸，在接近其pKa的pH時，任何時候都只有一部分分子帶負電。如樣品和濃縮膠均用pH6.7的TrisHCl緩沖液，電極液用Tris-甘氨酸緩沖液。此時，甘氨酸很少解離，其有效泳動率很低，而氯離子卻有很高的泳動率，蛋白質分子的泳動率介于氯離子和甘氨酸之間。一旦加上電壓，作為先導離子的氯離子和作為尾隨離子的甘氨酸離子分離開來，并在其后面留下一個導電性較低的區(qū)帶。由于導電性和電場強度成反比，這一區(qū)帶便獲得較高的電壓梯度，并加速甘氨酸的泳動，使其趕上氯離子，建立起甘氨酸和氯離子的電壓梯度和泳動率乘積的相等的穩(wěn)定態(tài)，使這些帶電顆粒以相同速度泳動，兩種離子之間具有明顯的邊界。當甘

34、氨酸、氯離子界面通過樣品進人濃縮膠時，在移動界面前有一低電壓梯度，在界面后有一高電壓梯度。由于在移動界面前的蛋白質泳動速度比氯離子低，因此氯離子能迅速通過。移動界面后的蛋白質處于較高的電壓梯度中，其泳動速度比甘氨酸快。因此，移動的界面將蛋白質分子堆積到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。蛋白質在移動界面中的濃縮作用進取決于樣品和濃縮膠中的Tris-Hcl濃度，而與樣品中的蛋白質的最初濃度無關。由于濃縮膠為大孔凝膠，故對樣品沒有分子篩作用。2）分子篩效應：當夾在快離子和慢離子中間的蛋白質由濃縮膠進入分離膠時，pH和凝膠孔徑突然改變。分離膠選用pH8.9的Tris-HCl緩沖液，與甘氨酸的pKa接近，導致甘

35、氨酸的大量解離。此時甘氨酸的有效泳動率增加，使它越過蛋白質并直接在氯離子后移動。隨之高電場強度消失。同時由于凝膠孔徑變小，使蛋白質分子的遷移率減小。于是，蛋白質樣品就在均一的電場強度和pH條件下通過一定孔徑的分離膠。當?shù)鞍踪|的相對分子質量或構型不同時，通過分離膠所受到的摩擦力和阻滯程度就不同，最終表現(xiàn)出的泳動率也不相同，也就是分子篩效應。即使蛋白質的凈電荷相似，也會因分子篩效應在分離膠中被分開。3）電荷效應：由于每種蛋白質分子所帶的有效電荷不同，故泳動率不同，所以樣品經過分離膠電泳后，就以帶狀按電荷順序排列起來。緩沖系統(tǒng)的選擇：由于SDS對蛋白質的溶解性能以及負電荷白包裹作用，所以在選擇SDS

36、電流緩沖系統(tǒng)時要比常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳簡單得多。一般來說，在被分析的蛋白質穩(wěn)定的pH范圍，凡不與SDS發(fā)生相互作用的緩沖液都可以使用，但緩沖液的選擇對蛋白質的和7-1再OO度與破熊雷白質翻分子質聯(lián)系丙簫酰肪'I"55-1010-1520-30蛋白質相拗子質量.I>5WI100-500I4010010M0<10L1：-分離和電泳的速度是非常關鍵的。含有SDS的不連續(xù)緩沖系統(tǒng)現(xiàn)在被廣泛地用于蛋白質亞基相對分子質量以及純度的測定。其中目前使用最多的緩沖系統(tǒng)是Tris一甘氨酸系統(tǒng)。在SDS不連續(xù)電泳中，樣品緩沖液和凝膠緩沖液常采用同一種系統(tǒng)，只是pH和離子強度不同。凝膠

37、濃度的選擇：由于SDS電泳分離并不取決于蛋白質的電荷密度，只取決于分子解聚后SDS一蛋白質膠束的大小，因此凝膠濃度的正確選擇尤為重要。如果凝膠濃度太大，孔徑太小，電泳時樣品分子不能進入凝膠。如果凝膠濃度太小，孔徑太大，則樣品中各種蛋白質分子均隨著緩沖液流向前推而不能得以很好地分離。不同相對分子質量范圍的蛋白質應選用不同的凝膠濃度。三、注意事項1 .3-疏基乙醇吞服可致命，吸入或通過皮膚吸收可致傷。高濃度時對黏膜、上呼吸道、皮膚和眼睛有破壞作用。操作時應注意防護措施。2 .兩種丙烯酰胺單體及溶液是中樞神經毒物并容易吸附于皮膚，作用有累積性，操作時要小心并戴手套。如果皮膚接觸了丙烯酰胺的粉末或溶液

38、，立即用肥皂水沖洗。未聚合的丙烯酰胺應用過量催化劑以固體廢物形式處理。3 .制備濃縮膠中，添加10%APS和TEMED前，應均勻地混合，一旦加入APS和TEMED后應快速地旋轉混合加入制膠層，因為濃縮膠很快就會聚合凝固。4 .將凝膠灌入制備好的平板內，留出灌注濃縮膠所需空間（梳齒的齒長再加1cm）。且制備濃縮膠前，應先準備好梳子。5 .上槽中應加入新鮮的電極緩沖液，而下槽中則可用舊的電極緩沖液。6 .如果沒有數(shù)目足夠的樣品，應在加樣孔中加上樣緩沖液，不要留有空孔，以防止電泳時鄰近帶的擴散。在加入不同的樣品之前，一定要用電泳緩沖液或蒸儲水沖洗注射器。7 .在凝膠與玻璃板之間插入一根長注射針頭將水

39、緩緩注入，在注入水的過程中，針頭逐漸向前伸入，使凝膠與玻璃板分離，注意不要損傷膠面。8 .10%APS盡量使用時現(xiàn)配現(xiàn)用，4c保存兩周內用完，最多不能超過一個月。-20C可保存兩個月，但一旦解凍后盡快用完。四、評議1 .根據(jù)SDS電泳的原理，樣品緩沖液中必須含有34倍于蛋白的SDS和足以斷裂二硫鍵的還原試劑（2%二硫蘇糖醇或5%3-疏基乙醇）。2 .電泳中出現(xiàn)不規(guī)則的蛋白質遷移帶是因為電泳不穩(wěn)定，其他原因還包括樣品加量太多、樣品中的鹽濃度太高、邊緣效應。如果在凝膠邊緣電泳條帶出現(xiàn)“微笑”狀的樣品（運動速度減慢），可能是因為凝膠的中間比兩側更熱，應降低電壓。3 .電泳結束后，在進行染色前可用固定

40、液處理對凝膠進行20min處理，其SDSPAGE的分析效果會更好。固定液：454ml的50%甲醇水溶液，46ml的冰醋酸。4 .除了用考馬斯亮藍染色（其靈敏度較差，最低含量為100ng蛋白質，但操作容易），還可用銀染色，其靈敏度高，可比考馬斯亮藍染色法提高100倍，可檢測2ng的蛋白質。銀染的機制是將蛋白帶上的AgNO3（Ag+）還原成金屬銀，以使銀顆粒沉積在蛋白帶上。用銀染蛋白的吸光度對濃度作圖呈現(xiàn)不同的斜率，表明染色的程度是與蛋白中的一些特殊基團有關。在銀染過程中，蛋白質首先需要被固定。固定有兩個作用，第一是把蛋白固定在凝膠中或至少是阻滯它們在凝膠中的擴散，第二是為了去除干擾染色過程的物質

41、，如去污劑，還原試劑和緩沖液的成分（如甘氨酸）。常用的固定劑有戊二醛，乙醇，甲醛、醋酸以及三氯醋酸，然后將凝膠放在銀染溶液中染色。銀染色法：1）將從制膠板上剝下的凝膠放入50mL甲醛中固定液，旋轉搖床中緩慢搖動10min以上。2）倒去固定液，用水洗兩次，每次5min,緩慢搖動5min。3）倒去水，凝膠浸泡在0.2g/LNa2s203溶液中1min緩慢移動。4）倒去Na2s203溶液，用水洗膠2次，每次20s。5）倒去水，將凝膠浸泡在50mL0.1%的AgNO3中10min,緩慢移動。6）倒去AgNO3,用水洗膠，然后用小量體積的硫代硫酸鹽顯影液洗。7）將凝膠浸泡在50mL新配制的硫代硫酸鹽顯影

42、液中，緩慢搖動，直至獲得足夠的條帶現(xiàn)色強度（約1min）。試齊I：1%硝酸銀、0.2g/L的Na2s203。甲醛固定液：40%甲醇、0.5mL37%甲醛。硫代硫酸鹽顯影液：3%Na2CO3、0,0004%Na2s203、0.5mL37%的福爾馬林（臨用前加入）,不加福爾馬林的溶液可于室溫中長期保存。第四節(jié)原核表達蛋白的分離與純化大腸桿菌表達蛋白以可溶和不溶兩種形式存在，需要不同的純化策略?，F(xiàn)在，許多蛋白質正在被發(fā)現(xiàn)而事先并不知道它們的功能，這些自然需要將蛋白質分離出來后，進行進一步的研究來獲得。分析蛋白質的方法學現(xiàn)已極大的簡化和改進。必須承認，蛋白質純化比起DNA克隆和操作來是更具有藝術性的，

43、盡管DNA序列具有異乎尋常的多樣性（因而它是唯一適合遺傳物質的），但它卻有標準的物理化學性質，而每一種蛋白質則有它自己的由氨基酸序列決定的物理化學性質（因而它具有執(zhí)行眾多生物學功能的用途）。正是蛋白質間的這些物理性質上的差異使它們得以能進行純化但這也意味著需要對每一種待純化的蛋白質研發(fā)一套新的方法。所幸的是，盡管存在這種固有的困難，但現(xiàn)已有多種方法可以利用，蛋白質純化策略也已實際可行。目前，待研究蛋白或酶的基因的獲得已是相當普遍的事。可誘導表達系統(tǒng)特別是Studier等發(fā)展的以噬菌體T7RNA聚合酶為基礎的表達系統(tǒng)的出現(xiàn)使人們能近乎常規(guī)地獲得超表達（overexpression）,表達水平可達

44、細胞蛋白2%以上，有些甚至高達50%。一、可溶性產物的純化（融合T7Tag的表達蛋白）操作舉例（一）試劑準備采用T7-TagAffinityPurificationKit1 .T7-Tag抗體瓊脂。2 .B/W緩沖4.29mMNa2HPO4,1.47mMKH2PO4,2.7mMKCl,3.0.137mMNaCl,1%吐溫-20,pH7.3。4 .洗脫緩沖液：0.1M檸檬酸，pH2.2o5 .中和緩沖液：2MTris,pH10.4。1.PEG20000。(二)操作步驟1 .100ml含重組表達質粒的菌體誘導后，離心5000gx5min,棄上清，收獲菌體，用10ml預冷的B/W緩沖液重懸。2 .重

45、懸液于冰上超聲處理，直至樣品不再粘稠，4c離心14000gx30min,取上清液，0.45科m膜抽濾后作為樣品液。3 .將結合T7Tag抗體的瓊脂充分懸起，平衡至室溫，裝入層析柱中。4 .B/W緩沖液平衡后樣品液過柱。5 .10mlB/W緩沖液過柱，洗去未結合蛋白。6 .用5ml洗脫緩沖液過柱，每次1ml,洗脫液用含150dl中和緩沖液的離心管收集，混勻后置于冰上，直接SDS-PAGE分析。7 .將洗脫下來的蛋白放入透析袋中，雙蒸水透析24hr,中間換液數(shù)次。8 .用PEG20000濃縮蛋白。(三)注意事項蛋白在過層析柱前，要0.45m膜抽濾，否則幾次純化后，柱子中會有不溶物。二、包涵體的純化

46、包涵體是外源基因在原核細胞中表達時，尤其在大腸桿菌中高效表達時，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白質顆粒，在顯微鏡下觀察時為高折射區(qū)，與胞質中其他成分有明顯區(qū)別。包涵體形成是比較復雜的，與胞質內蛋白質生成速率有關，新生成的多肽濃度較高，無充足的時間進行折疊，從而形成非結晶、無定形的蛋白質的聚集體；此外，包涵體的形成還被認為與宿主菌的培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)基成分、溫度、pH值、離子強度等因素有關。細胞中的生物學活性蛋白質常以可融性或分子復合物的形式存在，功能性的蛋白質總是折疊成特定的三維結構型。包涵體內的蛋白是非折疊狀態(tài)的聚集體，不具有生物學活性，因此要獲得具有生物學活性的蛋白質必須將包涵體溶解，釋放

47、出其中的蛋白質，并進行蛋白質的復性。包涵體的主要成分就是表達產物，其可占據(jù)集體蛋白的40%95%,此外，還含有宿主菌的外膜蛋白、RNA聚合酶、RNA、DNA、脂類及糖類物質，所以分離包涵體后，還要采用適當?shù)姆椒?如色譜法)進行重組蛋白質的純化。(一)試劑配制1 ,緩沖液A:50mMTris-HCl(pH8.0),2mMEDTA,100mMNaCl。2 .緩沖液B:50mMTris-HCl(pH8.0),1mMEDTA,100mMNaCl,1%NP-40。3 .緩沖液I:50mMTris-HCl(pH8.0),2mMEDTA,100mMNaCl,0.5%TritonX-100(V/V),4M月尿

48、素。4 .緩沖液n：50MTris-HCl(pH8.0),2mMEDTA,100mMNaCl,3%TritonX-100。1.緩沖液出：50mMTris-HCl(pH8.0),2mMEDTA,100mMNaCl,0.5%TritonX-100,2M鹽酸月瓜。5.緩沖液C:8M月尿素，10mM3-疏基乙醇，100mMTris-HCl(pH8.0),2mMEDTA及脫氧膽酸鈉。(二)操作步驟1 .用緩沖液A漂洗菌體細胞(10ml/g),離心6000gM5min,收集菌體細胞，重復此步驟，將菌體細胞再在緩沖液A中洗滌一次。2 .將漂洗過的菌體細胞懸浮于緩沖液B中，超聲破碎，鏡檢，破碎率高于95%,離

49、心1500g>30min,收集包涵體沉淀。3 .將包涵體沉淀用緩沖液I、緩沖液n、緩沖液出分別超聲洗滌一次，1500g離心收集包涵體沉淀。4 .包涵體的溶解：用含高濃度月尿素的緩沖液室溫放置30min,然后離心1500g>30min,留上清。將溶解后的蛋白質適當稀釋，磁力攪拌，透析過夜。5 .溶解后的包涵體蛋白可通過親和層析進一步純化。第五節(jié)水稻瘤矮病毒（RGDV）S10組分的原核表達、原理細菌體中含有大量蛋白質，具有不同的電荷和分子量。強陰離子去污劑SDS與某一還原劑并用，通過加熱使蛋白質解離，大量的SDS結合蛋白質，使其帶相同密度的負電荷，在聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）上，不

50、同蛋白質的遷移率僅取決于分子量。采用考馬斯亮蘭快速染色，可及時觀察電泳分離效果。因而根據(jù)預計表達蛋白的分子量，可篩選陽性表達的重組體。二、材料和試劑1、重組質粒：將RGDV的S10組分，共1198bp構建到原核表達載體pET-28b（+）上，得到原核表達質粒pET-S10o2、將pET-S10轉化到BL21（DE3）宿主菌中，進行誘導表達。3、30%儲備膠溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g,亞甲雙丙烯酰胺（Bis）1.0g,混勻后加ddH2。，37OC溶解，定容至100ml,棕色瓶存于室溫。4、1.5MTris-HCl（pH8.8）:Tris18.17g力口ddH2。溶解,濃鹽酸調pH至8.0,定容至