人源葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT的晶體結(jié)構(gòu)

1、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT1的晶體結(jié)構(gòu)宏觀評(píng)述一、背景介紹：葡萄糖（D-glucose）是地球上包括從細(xì)菌到人類各種生物已知最重要、最基本的能量來源，也是人腦和神經(jīng)系統(tǒng)最主要的供能物質(zhì)；大腦平均每天消耗約120克葡萄糖，占人體葡萄糖總消耗量的一半以上。葡萄糖代謝的第一步就是進(jìn)入細(xì)胞：親水的葡萄糖作為一種有機(jī)大分子不能自由穿透疏水的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，其進(jìn)出細(xì)胞需要通過鑲嵌于細(xì)胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（glucosetransporters）簡(jiǎn)稱葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（GLUT）轉(zhuǎn)運(yùn)功能才能得以實(shí)現(xiàn)。其中一類屬于主要協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族（Major Facilitator Superfamily，簡(jiǎn)稱MF

2、S）的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是大腦、神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉、紅細(xì)胞等組織器官中最重要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（glucose transporters，簡(jiǎn)稱GLUTs）。在人體的14個(gè)GLUTs中，GLUT1、2、3、4這四種蛋白生理功能最重要，研究最廣泛，GLUT1幾乎存在于人體每一個(gè)細(xì)胞中，是紅細(xì)胞和血腦屏障等上皮細(xì)胞的主要葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，對(duì)于維持血糖濃度的穩(wěn)定和大腦供能起關(guān)鍵作用。在已知的人類遺傳疾病中，G L U T 1 功能完全缺失將致死，功能部分缺失會(huì)使細(xì)胞對(duì)葡萄糖吸收不足而導(dǎo)致大腦萎縮、智力低下、發(fā)育遲緩、癲癇等一系列疾病（GLUT1 Deficiency syndrome,又稱De Vivo syndrom

3、e）同時(shí)也會(huì)因葡萄糖不能及時(shí)為人體利用消耗而導(dǎo)致血糖濃度的異常升高。另一方面，當(dāng)發(fā)生癌變時(shí)，葡萄糖是腫瘤細(xì)胞最主要的能量來源，但是腫瘤細(xì)胞由于缺乏氧氣供應(yīng)而只能對(duì)葡萄糖進(jìn)行無氧代謝，同質(zhì)量葡萄糖所提供的能量不到正常細(xì)胞的10%，因而對(duì)葡萄糖的需求劇增（這是被稱為Warburg Effect的腫瘤細(xì)胞代謝現(xiàn)象），在很多種類的腫瘤細(xì)胞中都觀察到GLUT1的超量表達(dá)，以大量攝入葡萄糖維持腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)擴(kuò)增，這使得GLUT1的表達(dá)量可能作為檢測(cè)癌變的一個(gè)指標(biāo)。GLUT14是一種類胰島素敏感型葡萄糖運(yùn)輸載體，它與2型糖尿病密切相關(guān)，細(xì)胞中GLUT14表達(dá)的減少以及其轉(zhuǎn)位的障礙都是引發(fā)糖尿病的重要因素。&

4、#160; 二、研究介紹：他們首先獲得了GLUT1-4在大腸桿菌中的同源蛋白，XylE的結(jié)構(gòu)。XylE在腸桿菌中負(fù)責(zé)將D-木糖以質(zhì)子依賴的方式同向轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞。它與人的GLUT1-4蛋白有著高達(dá)50%的序列相似性，進(jìn)化上高度保守。細(xì)菌GLUT14同源物XylE分別與D-木糖、D-葡萄糖和6-溴-6-脫氧-d-葡萄糖構(gòu)成的三種復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，分辨率分別為2.8、2.9 和 2.6埃。其三維晶體結(jié)構(gòu)中包含一個(gè)典型的由12個(gè)跨膜片段和一個(gè)獨(dú)特的四螺旋結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的主要協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族(Major Facilitator Superfamily，MFS)折疊。XylE被

5、捕獲在一個(gè)面向外（outward-facing）、部分閉合的構(gòu)象中。XylE蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出典型的MFS家族折疊方式由12個(gè)跨膜螺旋組成N端和C端兩個(gè)以假兩次軸對(duì)稱的結(jié)構(gòu)域。與已知結(jié)構(gòu)的MFS超家族其它成員不同，XylE呈現(xiàn)出一種向細(xì)胞外側(cè)開放、部分封閉的全新構(gòu)象，并且具有一個(gè)獨(dú)特的由4個(gè)螺旋組成的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。顏寧研究組獲得了XylE與底物D-木糖，抑制劑D-葡萄糖，以及一種葡萄糖衍生物的3個(gè)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，找到了與底物結(jié)合的重要氨基酸殘基，并通過生化實(shí)驗(yàn)分析，驗(yàn)證了這些殘基在底物識(shí)別與轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起到的作用。尤為重要的是，序列比對(duì)顯示這些殘基在GLUT1-4中完全保守，從而第一次揭示出G

6、LUT1-4識(shí)別底物的分子基礎(chǔ)。在研究這些同家族糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)與機(jī)理過程中，她們對(duì)于MFS家族的工作機(jī)理有了深入了解，分析出GLUT1結(jié)晶的瓶頸在于高度動(dòng)態(tài)、結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。針對(duì)這一問題，她們尋找可以將GLUT1鎖定于某一構(gòu)象的致病突變體，同時(shí)利用低溫結(jié)晶進(jìn)一步穩(wěn)定蛋白構(gòu)象，終于克服了GLUT1重組表達(dá)、純化結(jié)晶的一系列技術(shù)障礙，獲得了GLUT1的晶體結(jié)構(gòu)。三、價(jià)值意義：1、提供的結(jié)構(gòu)和生物化學(xué)信息可為了解葡糖糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能和機(jī)制提供重要的框架。2、這一結(jié)構(gòu)模型由于是以具有高度同源的XylE蛋白的晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，比以往研究報(bào)道的結(jié)果更為準(zhǔn)確。利用GLUT1的晶體結(jié)構(gòu)可以精確地定位與

7、疾病相關(guān)的突變氨基酸，揭示其致病機(jī)理。分析顯示，三十余個(gè)突變氨基酸基本集中于三個(gè)區(qū)域：底物結(jié)合區(qū)域、胞外門控區(qū)、胞內(nèi)門控區(qū)，它們的突變或者影響了底物識(shí)別，或者影響轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的構(gòu)象變化。晶體結(jié)構(gòu)使得理解這些致病突變的機(jī)理一目了然。與之前獲得的向胞外半開口的XylE晶體結(jié)構(gòu)比較揭示出ICH在GLUT1的構(gòu)象變化中起關(guān)鍵作用。鑒于ICH在糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞家族的保守性，這一發(fā)現(xiàn)可能適用于該亞家族所有成員。3、在人類攻克癌癥、糖尿病等重大疾病的探索道路上邁出了極為重要的一步。如果我們能研究清楚GLUT1 的組成結(jié)構(gòu)和工作機(jī)理，就有可能通過調(diào)控它實(shí)現(xiàn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的人工干預(yù)。這樣既可以增加正常細(xì)胞的葡萄糖供應(yīng)，達(dá)到

8、治療相關(guān)疾病的目的，也可以通過阻斷葡萄糖供應(yīng)“餓死”癌細(xì)胞。重點(diǎn)分析一、結(jié)構(gòu)特征MFS 超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)特征MFS超家族的成員蛋白大多由400600個(gè)氨基酸殘基組成, N和C端都位于胞內(nèi). 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)提示其大多具有12次a-螺旋跨膜結(jié)構(gòu)域, 其他一些具有14或者24次a-螺旋的則可能是進(jìn)化過程中以12次跨膜a-螺旋為基礎(chǔ)產(chǎn)生的. 這種獨(dú)特的折疊方式也被命名為“MFS fold”. 在“MFS fold”中, 12次a螺旋可以分為2個(gè)結(jié)構(gòu)域: N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域. 每個(gè)結(jié)構(gòu)域都由6個(gè)a-螺旋組成, 雖然2個(gè)結(jié)構(gòu)域中氨基酸序列只有很低的序列同源性, 但從結(jié)構(gòu)上觀察2個(gè)結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn)二次贗

9、對(duì)稱(two-fold psudosymmetry).同時(shí)MFS超家族蛋白的結(jié)構(gòu)和序列分析提示可能存在3次跨膜重復(fù)構(gòu)成的特性, 結(jié)構(gòu)和功能分析都支持MFS蛋白每個(gè)結(jié)構(gòu)域都是以3+3反轉(zhuǎn)重復(fù)(inverted 3+3 repeats)的組成. 更有意思的是, 研究發(fā)現(xiàn)一類只有3次跨膜結(jié)MFS 超家族蛋白結(jié)構(gòu)特征. 圖中顯示的是屬于MFS 蛋白家族的XylE 的結(jié)構(gòu). XlyE 具有經(jīng)典的12 跨膜螺旋的MFS fold. 其中跨膜螺旋TM1-3 和TM4-6 形成“3+3”反轉(zhuǎn)重復(fù), 構(gòu)成了XylE 的N 端結(jié)構(gòu)域; 跨膜螺旋TM7-9 和TM10-12 也具有類似反轉(zhuǎn)重復(fù)特性, 它們構(gòu)成了Xy

10、lE 的C 端結(jié)構(gòu)域; 部分MFS 家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白像XylE 一樣還存在胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域構(gòu)域的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SemiSWEET, 它們?cè)诩?xì)胞膜上可能形成多聚體行使功能. 可能從進(jìn)化上來講, MFS超家族蛋白是由3次跨膜蛋白融合形成.除了跨膜結(jié)構(gòu)域外, 部分MFS超家族蛋白還具有胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域. 以XylE和GLUT1為例, 在胞內(nèi)區(qū)域還存在幾個(gè)由-螺旋組成的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域.螺旋中的多個(gè)帶電荷氨基酸殘基會(huì)與跨膜結(jié)構(gòu)域上的氨基酸殘基產(chǎn)生相互作用, 底物轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)也已經(jīng)證實(shí)這些位置上的突變會(huì)影響轉(zhuǎn)運(yùn). 進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn), 這些氨基酸殘基在所有的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中都十分保守, 說明這個(gè)結(jié)構(gòu)域在該家族中保守, 并發(fā)揮重要功能GLU

11、T1的三維晶體結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)經(jīng)典的MFS家族折疊方式-12個(gè)跨膜螺旋組成N端和C端兩個(gè)結(jié)構(gòu)域。兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的腔孔朝向胞內(nèi)區(qū)，即該結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)向內(nèi)開放構(gòu)象。而在結(jié)晶中用到的去污劑頭部恰好是葡萄糖苷，其結(jié)合位點(diǎn)與此前XylE中觀測(cè)到的葡萄糖結(jié)合位點(diǎn)基本重合，證實(shí)了MFS家族具有單一結(jié)合位點(diǎn)。有趣的是，GLUT1在胞內(nèi)可溶區(qū)還具有一個(gè)由4個(gè)螺旋組成的結(jié)構(gòu)域（簡(jiǎn)稱ICH），這一序列只在MFS中的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞家族中(Sugar Porter subfamily)觀察到，因此ICH是屬于該家族蛋白的特有結(jié)構(gòu)特征。二、轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制MFS超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包含共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(co-transporter)和協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(faci

12、litator). 共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(co-transporter)在轉(zhuǎn)運(yùn)底物過程中需要借助其他物質(zhì)的參與, 其中質(zhì)子共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究較為透徹. 比如LacY, FucP, XylE都是共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白, 它們?cè)谵D(zhuǎn)運(yùn)乳糖、巖藻糖和木糖的過程中都需要利用膜兩側(cè)的質(zhì)子濃度梯度所提供的勢(shì)能驅(qū)動(dòng), 完成底物在胞內(nèi)的積累. 因此, 質(zhì)子在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起到了非常重要的作用.在對(duì)LacY進(jìn)行的大量生物化學(xué)研究中表明, 質(zhì)子的協(xié)同運(yùn)輸過程中, 一些重要的氨基酸殘基參與了質(zhì)子傳遞的過程. LacY中第269位的谷氨酸(Glu269)在LacY處在向胞外開放構(gòu)象下被質(zhì)子化, 然后乳糖分子會(huì)結(jié)合到蛋白上的底物結(jié)合位點(diǎn),

13、誘導(dǎo)Glu269上的質(zhì)子發(fā)生傳遞, 使其轉(zhuǎn)移到第325位谷氨酸(Glu325)上. 與此同時(shí), 這一過程驅(qū)動(dòng)蛋白發(fā)生構(gòu)像變化, 使蛋白呈現(xiàn)向胞內(nèi)開放狀態(tài), 底物釋放后Glu325上的質(zhì)子也隨之釋放, 蛋白在這種狀態(tài)下不穩(wěn)定, 隨即恢復(fù)到面向胞外狀態(tài), 完成一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)循環(huán).在對(duì)另一個(gè)質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白FucP的研究過程中發(fā)現(xiàn), 位于轉(zhuǎn)運(yùn)通道中兩個(gè)酸性氨基酸Asp46以及Glu135可能與LacY中的2個(gè)酸性氨基酸一樣, 在底物轉(zhuǎn)運(yùn)過程中可以被質(zhì)子化和去質(zhì)子化, 引起蛋白的構(gòu)象變化, 完成底物轉(zhuǎn)運(yùn).XylE蛋白需要質(zhì)子進(jìn)行共轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制則可能有所不同. 研究發(fā)現(xiàn), XylE 中第27 位的天冬氨酸(As

14、p27)與質(zhì)子協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān). 將Asp27突變成天冬酰胺Asn或者丙氨酸Ala后, 并不會(huì)對(duì)底物的逆流轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)(counterflow assay)產(chǎn)生影響, 但在活細(xì)胞中突變體蛋白不能完成底物轉(zhuǎn)運(yùn). 有意思的是在XylE的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)中, Asp27與第133位精氨酸(Arg133)形成靜電相互作用, 如果將Arg133突變成組氨酸His、亮氨酸Leu、色氨酸Trp都會(huì)影響XylE的轉(zhuǎn)運(yùn)活性. 而Asp27側(cè)鏈的質(zhì)子化可能會(huì)造成其局部的構(gòu)象變化, 使其與Arg133不適合形成氫鍵除了共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白, MFS超家族還存在一類協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白. 我們近期完成結(jié)構(gòu)解析的人源葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT1正是

15、最重要的協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之一. 由于GLUT1與XylE具有較高的序列同源性, GLUT1的N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域與來自XylE的2個(gè)結(jié)構(gòu)域都十分相似. 2個(gè)結(jié)構(gòu)上相似的蛋白卻以2種不同的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn), 這對(duì)我們研究和認(rèn)識(shí)質(zhì)子共轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制有很大幫助. 在GLUT1的序列中與XylE序列中第27位的天冬氨酸(Asp27)對(duì)應(yīng)的第29位氨基酸被天冬酰胺取代, 這個(gè)突變剛好可以模擬天冬氨酸(Asp)質(zhì)子化的狀態(tài).Asn29沒有與Arg126(對(duì)應(yīng)XylE的Arg133)形成氫鍵. 這就釋放了Arg126, 其與來自C端結(jié)構(gòu)域的Try292形成陽離子-p鍵相互作用(cation-pinteraction)

16、.目前, 我們認(rèn)為XylE的轉(zhuǎn)運(yùn)過程是: 當(dāng)XylE處在向胞外開放時(shí), Asp27很容易被質(zhì)子化, 質(zhì)子化的天冬氨酸會(huì)引起與它相互作用的氨基酸殘基側(cè)鏈發(fā)生構(gòu)象變化, 與此同時(shí), 底物分子(木糖)可以進(jìn)入底物結(jié)合位點(diǎn); 與蛋白結(jié)合的底物分子可以誘導(dǎo)蛋白發(fā)生較大構(gòu)象變化, 使蛋白從向胞外開放變成向胞內(nèi)開放; 隨后底物從蛋白上結(jié)合位點(diǎn)脫離, Asp27也去質(zhì)子化, 此時(shí)構(gòu)象變得不穩(wěn)定, 蛋白恢復(fù)向胞外開放狀態(tài). 如果Asp27不能去質(zhì)子化, 即使底物從蛋白脫離也不能使蛋白完成空轉(zhuǎn), 將穩(wěn)定在向胞內(nèi)開放狀態(tài).而GLUT1是一個(gè)協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(uniporter/facilitator),它就像一直處于質(zhì)子化狀態(tài)下的質(zhì)子共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白. 底物結(jié)合和釋放已經(jīng)可以起到誘導(dǎo)蛋白構(gòu)象變化的作用, 不需要質(zhì)子參與. 這其中的原因可能是GLUT1各種不同構(gòu)象之間的能壘都較低, 自由熱運(yùn)動(dòng)就足以完成構(gòu)象變化, 即