防己黃芪湯加減對急性脊髓損傷大鼠的組織形態(tài)學(xué)影響

1、防己黃芪湯加減對急性脊髓損傷大鼠的組織形態(tài)學(xué)影響               作者：高益斌 楊米雄 葉紅明【摘要】  目的研究活血利水中藥對脊髓急性損傷的治療效果及其對脊髓組織病理改變的影響，探討其作用機(jī)制 方法隨機(jī)將120只脊髓損傷造模后的大鼠隨機(jī)分為復(fù)方組、方組、方組和激素組。前三者和激素組術(shù)后分別給予中藥治療和甲基強(qiáng)地松龍，于術(shù)后24h、7d、14d、21d、28d觀察各組大鼠脊髓運(yùn)動功能恢復(fù)、脊髓局部鈣離子濃度變化及脊髓組織學(xué)改變。結(jié)果復(fù)方組脊髓運(yùn)

2、動功能評分、及抑制鈣離子濃度優(yōu)于激素組；復(fù)方組的病變與方、方組相比，有縮小病灶的表現(xiàn)。結(jié)論中藥與激素在抑制脊髓損傷的進(jìn)程中，能保護(hù)神經(jīng)組織免受損傷、抑制BNDF增生及鈣離子濃度上發(fā)揮有益作用。從功能和形態(tài)上證實(shí)中藥較激素在近期治療的類似性及遠(yuǎn)期療效的有效性。 【關(guān)鍵詞】  脊髓損傷 中醫(yī)藥治療 腦源性神經(jīng)生長因子 大鼠Abstract: Objective To evaluate the efficacy of Chinese medicine of stimulating blood circulation and reducing edema on treating acute

3、spinal cord injury, and discuss its functions mechanism by observing the dynamic pathological changes of spinal cord. Methods120 SD rats were divided into four groups:fufang group, fanggroup, fanggroup and methylprednisolone treated group. The modified method was adopted to make the models of spinal

4、 cord injury. The functional recovery of spinal cord, Ca2+ density and the pathological changes were observed dynamically in each group.Result The functional recovery of spinal cord was promoted, the damage and Ca2+ density were reduced. The vacuole area was diminished in spinal cord in the fufang g

5、roup. It also inhabited the secondary inflammation.Conclusion The benefited effects, inhibiting the pathological process of the damage, were preserving the neuron and promoting the proliferation of mesenchymal cell, resisting BDNF proliferation and Ca2+ density were observed in the fufang group. The

6、 efficacy of TCM and MP was proved by the functional evaluation and the morphologic observation not only in actual period but in long term.Key words: spinal injury; traditional Chinese medicine therapy; BDNF; rat   急性脊髓損傷(ASCI)在臨床上多見，致癱率高，其有兩種創(chuàng)傷機(jī)制作用于脊髓，既原發(fā)性損傷及在其基礎(chǔ)上發(fā)展起來的繼發(fā)性損傷，如何防止繼發(fā)性損傷的發(fā)生、發(fā)

7、展是目前研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過相關(guān)指標(biāo)來評定防己黃芪湯加減對急性脊髓損傷的治療效果，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1  材料與方法11  藥物與試劑111  藥物  防己黃芪湯加減(方)：(防己12g，黃芪15g，三七6g，白術(shù)9g，丹參15g，人參6g，甘草6g，生姜5g，大棗6g。八珍湯加減(方)：(當(dāng)歸9g，川芎9g，白芍9g，熟地9g，人參9g，茯苓9g，甘草9g，續(xù)斷9g，丹參15g。藥材購自浙江省中醫(yī)院。將上藥加水500ml用中火反復(fù)煎煮成濃縮溶液，使每1ml水溶液相當(dāng)于10g生藥。甲基強(qiáng)地松龍，注射劑量30mg/kg。112  試劑&#

8、160; A：第一抗體GFAP(Glial Fibrillary Acidic Protein)Ab4，美國Neomarkers公司；B：即用型ENVISION試劑盒：DAKO（丹麥）；C：DAB顯色劑：SIGMA（美國）；D：緩沖液：PBS PH74 0。1M；枸櫞酸鹽緩沖液（A液：枸櫞酸2101G，DW1000ml；B液：枸櫞酸鈉2941G，DW1000ml，枸櫞酸鹽緩沖液由A液及B液和DW按要求配合成PH值為6.0）。         12  動物及造模  120只SD大鼠，雌雄不拘，體重

9、240300g, 由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。采用胥少汀脊髓半橫切模型法1制作脊髓損傷模型。室溫控制于1925。大鼠用2%戊巴比妥鈉按45mg/kg腹腔麻醉達(dá)成后，俯臥位固定，以T9為中心，顯露T9T11椎板和棘突，切除椎板和棘突，保護(hù)硬脊膜。注意術(shù)中無菌及細(xì)致性操作。術(shù)中用改良針刀統(tǒng)一行T11左脊髓半橫切，可見大鼠下肢強(qiáng)烈抽搐及尾巴甩動，強(qiáng)調(diào)以術(shù)后損傷側(cè)下肢出現(xiàn)完全癱瘓作為造模成功的標(biāo)志。術(shù)野切口常規(guī)用稀PVP碘水及慶大霉素沖洗三遍。徹底止血后依次縫合肌肉、皮膚，關(guān)閉切口，切口表面涂以青霉素液，用無菌創(chuàng)可貼保護(hù)。術(shù)后肌注青霉素8萬U/只，共3d。每日擠壓膀胱2次，直到710后膀胱功能恢

10、復(fù)為止。術(shù)后注意籠內(nèi)及時(shí)更換干燥消毒木屑墊料以保持干燥清潔，觀察切口有無血腫、有無尿潴留、血尿、腹腔內(nèi)出血、感染等并發(fā)癥。13  分組與處理  120只大鼠在脊髓損傷造模術(shù)后按隨機(jī)數(shù)字表分為復(fù)方組、方組、方組、激素組，每組動物30只。每日用藥量按成人劑量的1/50，由胃管灌入。麻醉蘇醒后30min灌藥1次，每次灌服15ml，每日用藥3次，術(shù)后第8天開始改為每日2次，劑量不變。復(fù)方組大鼠于術(shù)后1h開始注射方，分別于術(shù)后24h、7d各隨機(jī)處死6只。第8天開始改灌方，再分別于術(shù)后14d、21d、28d再各隨機(jī)處死6只；方組同復(fù)方組，但于第8天開始改為灌服生理鹽水；方組術(shù)后1h開始

11、灌生理鹽水，第8天開始改為灌方；激素組于術(shù)后開始肌注甲強(qiáng)龍(30mg/kg)。2  結(jié)果21  光鏡觀察211  復(fù)方組  傷后24h見灰質(zhì)中央管附近白質(zhì)出血，組織水腫，損傷部分神經(jīng)細(xì)胞固縮壞死（圖1）；傷后7d間質(zhì)出血灶周圍纖維間可見中性粒細(xì)胞，近中央管灰質(zhì)部分水腫、壞死，存留大部分灰質(zhì)內(nèi)可見正常神經(jīng)細(xì)胞，HE染色呈均勻淺紅色，可見廣泛分布的缺血性改變的神經(jīng)細(xì)胞，尼氏體減少，胞核固縮，核仁部分固縮，少數(shù)核溶解，BDNF數(shù)量增加（圖2）；傷后14d病損處出現(xiàn)軟化灶，水腫較前減輕明顯，能見少量的神經(jīng)纖維，間質(zhì)中有少許淋巴與單核細(xì)胞，BDNF增生明顯；傷后2

12、1d可見大部神經(jīng)細(xì)胞存在，脊髓結(jié)構(gòu)清晰可辯，白質(zhì)區(qū)可見少許膠質(zhì)瘢痕，BDNF增生減慢（圖3、4）。圖1、2  神經(jīng)細(xì)胞固縮壞死(略)圖3、4  白質(zhì)區(qū)可見少許膠質(zhì)瘢痕(略)212  方、方組與復(fù)方組相比，方、方組的改變不大。方組大鼠脊髓損傷術(shù)后24h組織出血明顯，細(xì)胞空泡變性，部分細(xì)胞核固縮消失、纖維絲斷裂；術(shù)后714d，水腫程度減輕不明顯，出血灶及神經(jīng)元數(shù)目減少，BDNF增生明顯，與同時(shí)期復(fù)方組相比組織壞死及空泡樣變程度較重(圖5)；14d以后所示神經(jīng)因子細(xì)胞分布均勻，排列較規(guī)則，組織空泡壞死變較輕(圖6)。圖5、6  組織壞死、空泡祥變 (略)圖7、

13、8  僅見少許BDNF增生(略)213  激素組  與復(fù)方組比較，大鼠損傷24h后出血灶散在，組織水腫、細(xì)胞空泡變性同復(fù)方組相似，大部分神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)基本正常，呈多角形，脊髓后角損傷嚴(yán)重(圖7 HE免疫組化×100)；術(shù)后714d組織輕度疏松水腫，細(xì)胞核無明顯固縮，神經(jīng)因子結(jié)構(gòu)基本完整，神經(jīng)纖維極性完整，可見節(jié)細(xì)胞與神經(jīng)纖維連接，僅見少許BDNF增生 (圖8 免疫組化×100)；2周以后，脊髓組織結(jié)構(gòu)清晰，后角部分恢復(fù)，灰質(zhì)中空腔面積較小，BDNF增生不明顯(圖9  免疫組化×100)22  電鏡觀察  正

14、常大鼠的脊髓神經(jīng)元胞體的超微結(jié)構(gòu)保存良好，胞內(nèi)有清楚的線粒體、成團(tuán)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、分散的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基復(fù)合體等細(xì)胞器。復(fù)方組術(shù)后24h電鏡可觀察到脊髓白質(zhì)脫髓鞘區(qū)神經(jīng)軸突變性，不規(guī)則斷裂，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，BDNF細(xì)胞核內(nèi)染色邊聚，(圖9、10)7d后可見損傷區(qū)及其鄰近區(qū)的核周體呈暗、亮變性及壞死，多數(shù)神經(jīng)細(xì)胞增生聚集，后纖維瘢痕化（圖11、12）。圖912  BDNF細(xì)胞核邊聚、后纖維瘢痕化(略)3  討論神經(jīng)生長因子(Nervegrowthfactor,NGF)家族成員是主要的靶源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，由靶組織產(chǎn)生，通過軸突末端受體介導(dǎo)，經(jīng)神經(jīng)細(xì)胞軸突逆行運(yùn)輸?shù)桨w，對神

15、經(jīng)細(xì)胞的存活、分化和功能表達(dá)起著重要的作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)作為神經(jīng)營養(yǎng)因子效應(yīng)細(xì)胞的神經(jīng)細(xì)胞，其本身亦具有產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)因子的能力，即神經(jīng)營養(yǎng)因子的自分泌作用。BDNF是廣譜的神經(jīng)營養(yǎng)因子,對脊髓運(yùn)動神經(jīng)元具有神經(jīng)營養(yǎng)作用，能促進(jìn)其存活、分化及功能表達(dá)，也能挽救損傷的脊髓運(yùn)動神經(jīng)元和感覺神經(jīng)元。   脊髓損傷后組織壞死與修復(fù)具有不一致性,既破壞與修復(fù)過程各有其獨(dú)立系統(tǒng)。換句話說，盡管組織壞死對修復(fù)產(chǎn)生不利影響，但一旦組織壞死過程停止后，不意味著肯定能產(chǎn)生有效的組織修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在術(shù)后2周觀察過程中，除了單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞減少外，少見有益的神經(jīng)元和神經(jīng)纖維的生長。提示早期治療的關(guān)鍵在于減輕神經(jīng)元及其纖維的損傷程度、減少其損傷數(shù)量，盡量降低腦源性神經(jīng)生長因子的增生。本實(shí)驗(yàn)顯示，早期的抗炎治療能減輕脊髓的進(jìn)行性壞死，降低其繼發(fā)性損傷程度。術(shù)后不久運(yùn)動功能的提高可能只是反映了殘存組織的功能代償而不是有組織再生。因?yàn)檠芯匡@示，術(shù)后如殘留515的脊髓組織即可促使運(yùn)動功能恢復(fù)，況且大鼠的代償能力很強(qiáng)，更能早期恢復(fù)運(yùn)動功能。從本實(shí)驗(yàn)的病理學(xué)研究可知，相比于方、方組，復(fù)方組與激素組大鼠脊髓在損傷后炎性細(xì)胞浸潤的范圍較小、損傷程度較輕。提示防己黃芪湯與甲基強(qiáng)的松龍可明顯抑制脊髓橫斷損傷后