第三章植物組織與器官培養(yǎng)

1、細(xì)胞工程細(xì)胞工程細(xì) 胞 工 程 大理大學(xué)農(nóng)生學(xué)院細(xì)胞與分子生物學(xué)教研室 E-mail:2016.10.2016.10.2 25 5細(xì)胞工程細(xì)胞工程第三章 植物組織和器官培養(yǎng)一、一、 植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)二、二、 植物胚胎培養(yǎng)植物胚胎培養(yǎng)三、三、 毛狀根培養(yǎng)毛狀根培養(yǎng)細(xì)胞工程細(xì)胞工程植物組織培養(yǎng)指對(duì)植物組織（分生組織、表皮組織、薄壁組織）及愈傷組織進(jìn)行離體培養(yǎng)并誘導(dǎo)長(zhǎng)成完整植株的技術(shù)。植物組織培養(yǎng)再生的植物稱之為試管植物，植物組織培養(yǎng)再生植物的理論基礎(chǔ)是細(xì)胞全能性。第一節(jié)第一節(jié) 植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)細(xì)胞工程細(xì)胞工程植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ) 1. 1. 細(xì)胞全能性的定義

2、細(xì)胞全能性的定義 細(xì)胞全能性是指植物體的每一個(gè)細(xì)胞都攜帶有一套完整的基因組，并具有發(fā)育成為完整植株的潛在能力。2. 2. 細(xì)胞全能性的相對(duì)性細(xì)胞全能性的相對(duì)性 受精卵生殖細(xì)胞體細(xì)胞 不同種類植物或同種植物的不同基因型個(gè)體之間因遺傳性的差異，細(xì)胞全能性的表達(dá)程度大不相同。細(xì)胞工程細(xì)胞工程 植物組織培養(yǎng)技術(shù)的整個(gè)歷史可以追溯到19世紀(jì)末和20世紀(jì)初。它的發(fā)展過(guò)程大致可以分為三個(gè)階段：1. 探索階段 1839年：Schleidon和Schwann提出細(xì)胞學(xué)說(shuō) 1902年：Haberlandt提出植物細(xì)胞全能學(xué)說(shuō) 1904年：Hanning進(jìn)行胚離體培養(yǎng)獲得成功 1922年：Kotte和Robbins

3、進(jìn)行根尖和莖尖培養(yǎng)形成了缺綠的葉和根 植物組培發(fā)展簡(jiǎn)史植物組培發(fā)展簡(jiǎn)史細(xì)胞工程細(xì)胞工程2. 奠基階段奠基階段 1934年：White進(jìn)行番茄根培養(yǎng)建立了第一個(gè)活躍生長(zhǎng)的無(wú)性繁殖系 1937年：White建立了第一個(gè)由已知化合物組成的綜合培養(yǎng)基 1943年：White出版了植物組織培養(yǎng)手冊(cè) 1948年：Skoog和崔徵（zhng）發(fā)現(xiàn)腺嘌呤或腺苷可以解除IAA對(duì)芽形成的抑制細(xì)胞工程細(xì)胞工程 1952年：Morel和Miller通過(guò)莖尖培養(yǎng)獲得脫毒大麗花植株 1953年：Muir使單細(xì)胞培養(yǎng)獲得成功 1956年：Miller等人發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞分裂素-激動(dòng)素 1957年：Skoog和Miller提出植物

4、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑控制器官形成的概念。 1958年：Steward等將胡蘿卜根韌皮部的一些細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞分化而最終發(fā)育成完整的新植株，證實(shí)了Haberlandt的細(xì)胞全能性。細(xì)胞工程細(xì)胞工程3. 迅速發(fā)展階段迅速發(fā)展階段 1960年：Cocking等人用真菌纖維素酶分離植物原生質(zhì)體獲得成功。 1960年：Morel利用莖尖培養(yǎng)獲得脫毒蘭花,形成了”蘭花產(chǎn)業(yè)” 1962年：Murashibe和Skoog發(fā)表了MS培養(yǎng)基 1964年：Guha等在葉曼陀羅上由花粉誘導(dǎo)得到單倍體植株。 1971年：Takebe等在煙草上首次由原生質(zhì)體獲得了再生植株。細(xì)胞工程細(xì)胞工程 1972年：Carlson等在煙草上獲

5、得了第一個(gè)體細(xì)胞種間雜種。 1974年：Kao等人建立原生質(zhì)體的高鈣高pH的PEG融合法。 1978年：Melchers獲得了第一個(gè)屬間雜種植株-馬鈴薯番茄。 1983年：Zambryski等采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)獲得首例轉(zhuǎn)基因植物。細(xì)胞工程細(xì)胞工程植物組織培養(yǎng)再生植株的兩大途徑：植物組織培養(yǎng)再生植株的兩大途徑： 器官發(fā)生途徑；體細(xì)胞胚發(fā)生途徑細(xì)胞工程細(xì)胞工程器官發(fā)生途徑：離體培養(yǎng)條件下的組織或細(xì)胞團(tuán)（愈傷組織）分化形成不定根、不定芽等器官的過(guò)程。在自然界中，許多植物的無(wú)性繁殖（如插條，嫁接等）都屬于器官發(fā)生途徑。細(xì)胞工程細(xì)胞工程 愈傷組織：脫分化后的細(xì)胞經(jīng)過(guò)細(xì)胞分裂產(chǎn)生無(wú)特定組織結(jié)構(gòu)、無(wú)明顯極性的松

6、散的細(xì)胞團(tuán)。愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程實(shí)質(zhì)是分化細(xì)胞進(jìn)行脫分化的過(guò)程。 外植體：從植物體上取下來(lái)用以培養(yǎng)的部分組織或器官。細(xì)胞工程細(xì)胞工程小麥胚的愈傷組織細(xì)胞工程細(xì)胞工程 由外植體或單個(gè)細(xì)胞經(jīng)愈傷組織再生植株需要以下四個(gè)步驟1 啟動(dòng)期-主要是誘導(dǎo)外植體細(xì)胞脫分化和分裂2 愈傷組織誘導(dǎo)3 擬分生組織的形成4 器官原基和器官的形成細(xì)胞工程細(xì)胞工程Three ways of organogenesis 細(xì)胞工程細(xì)胞工程體細(xì)胞胚發(fā)生途徑 離體培養(yǎng)條件下沒(méi)有經(jīng)過(guò)受精過(guò)程，但經(jīng)過(guò)了胚胎發(fā)育過(guò)程中所形成胚的類似物，統(tǒng)稱為體細(xì)胞胚或胚狀體。細(xì)胞工程細(xì)胞工程體細(xì)胞胚的發(fā)生途徑1.從器官外植體直接發(fā)生2.懸浮培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生（

7、成簇成團(tuán)的體積小而細(xì)胞質(zhì)致密的細(xì)胞，這類細(xì)胞具有成胚能力，因而，把這類細(xì)胞團(tuán)又稱為胚性細(xì)胞團(tuán)）3.經(jīng)胚性愈傷組織發(fā)生4.單細(xì)胞發(fā)生途徑5.原生質(zhì)體發(fā)生途徑細(xì)胞工程細(xì)胞工程植物組織的培養(yǎng)基及其配制植物組織的培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基的成分培養(yǎng)基的成分 一一配制培養(yǎng)基母液配制培養(yǎng)基母液二二三三 常用培養(yǎng)基的種類及其特點(diǎn)常用培養(yǎng)基的種類及其特點(diǎn)四四配制培養(yǎng)基并滅菌配制培養(yǎng)基并滅菌細(xì)胞工程細(xì)胞工程 大量元素1. 無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)： 微量元素 鐵鹽 氨基酸 有機(jī)附加物 維生素2. 有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分： 肌醇 糖類 生長(zhǎng)素3. 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)： 細(xì)胞分裂素 赤霉素等 一、培養(yǎng)基成分一、培養(yǎng)基成分細(xì)胞工程細(xì)胞工程4. 瓊脂5

8、. 活性炭6. pH7. 水 酵母提取物（YE）8. 天然物質(zhì)： 麥芽提取物（ME）細(xì)胞工程細(xì)胞工程1. 1. 無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)元素?zé)o機(jī)營(yíng)養(yǎng)元素（1）大量元素：指濃度大于0.5mmolL的元素C、H、O、N、P、K、Mg、S和Ca，大量元素占植物體干重的百分之幾十至萬(wàn)分之幾的分量。N分硝態(tài)氮（NO3-）和銨態(tài)氮（NH4+），不同離體組織所需的含量不一致，單獨(dú)使用易導(dǎo)致培養(yǎng)基酸堿性漂移，兩者要保持適當(dāng)比例。細(xì)胞工程細(xì)胞工程（2）微量元素：指小于0.5mmolL的元素。鐵（Fe）、銅（Cu）、鋅（Zn）、錳（Mn）、鉬（Mo）、硼（B）、碘（I）、鈷（Co）、氯（Cl）、鈉（Na）等 Fe：易形成絮狀沉淀

9、，常以FeEDTA 的形式提供。FeSO47H2ONa2EDTA兩類元素雖然在培養(yǎng)基中含量差距很大，但都是不可少的營(yíng)養(yǎng)成份。含量不足就造成缺素癥。 細(xì)胞工程細(xì)胞工程（1）碳水化合物最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是較好的碳源，麥芽糖、半乳糖、甘露糖也有所應(yīng)用。使用濃度在1%5%，常用3%在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，可用食用的白糖代替。 糖類作用：在組織培養(yǎng)中用作離體組織生長(zhǎng)的碳源，維持培養(yǎng)基一定的滲透壓。培養(yǎng)效果有差異：葡萄糖果糖=蔗糖麥芽糖2. 2. 有機(jī)化合物有機(jī)化合物細(xì)胞工程細(xì)胞工程 在細(xì)胞里主要是以各種輔酶的形式參與多種代謝活動(dòng)對(duì)離體組織的生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用，主要為B族維生素 。 種類：種類

10、： VBl(鹽酸硫胺素)、VB3(泛酸)、VB6(鹽酸吡哆醇)、 Vpp(煙酸)、Vc(抗壞血酸）、 VH(生物素)、 VB11(葉酸)、 VB12(鈷胺素)等。 使用濃度：使用濃度： 一般用量為0.1-1.0mgL。Vc具有很強(qiáng)的還原能力，常用于防止組織褐變。（2 2）維生素）維生素(vitamin) (vitamin) 細(xì)胞工程細(xì)胞工程 又叫環(huán)己六醇，在糖類的相互轉(zhuǎn)化中起重要作用。 使用濃度：一般為lOOmgL。 作用：適當(dāng)使用肌醇，能促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)以及胚狀體和芽的形成。對(duì)組織和細(xì)胞的繁殖、分化有促進(jìn)作用，對(duì)細(xì)胞壁的形成也有作用。 （3 3）肌醇）肌醇細(xì)胞工程細(xì)胞工程 作用：作用：蛋白

11、質(zhì)的組成部分，也是一種有機(jī)氮化合物，是很好的有機(jī)氮源，可直接被細(xì)胞吸收利用。 種類：種類：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等半胱氨酸及多種氨基酸的混合物（水解酪蛋白、水解乳蛋白）等。 使用濃度：使用濃度：為10-200mgL。（4 4）氨基酸）氨基酸 細(xì)胞工程細(xì)胞工程 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)是一些對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育及生理活動(dòng)有特殊作用的生理活性物質(zhì)。 這類物質(zhì)極少量存在就對(duì)植物生命活動(dòng)起到調(diào)節(jié)作用，有些可以刺激植物生長(zhǎng)，而有些抑制植物生長(zhǎng)。 在組織培養(yǎng)中，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)、器官分化的植株再生具有重要的作用。4. 4. 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)植物生長(zhǎng)調(diào)

12、節(jié)物質(zhì) 細(xì)胞工程細(xì)胞工程植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)主要包括：植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)主要包括：細(xì)胞工程細(xì)胞工程 概念：概念：指能引起完整組織中的細(xì)胞擴(kuò)展的化合物，主要生理作用是促進(jìn)細(xì)胞的縱向伸長(zhǎng)，生長(zhǎng)素包括內(nèi)源的（存在于植物體內(nèi)的）和人工合成的。組培中的作用：組培中的作用：主要被用于誘導(dǎo)愈傷組織形成，促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)和促進(jìn)生根。用量：mg/L，mg/L=ppm用法：溶于95乙醇或0.1mol/L NaOH（1 1）生長(zhǎng)素類）生長(zhǎng)素類 細(xì)胞工程細(xì)胞工程 吲哚乙酸：IAA 萘乙酸：NAA 吲哚丁酸：IBA 2,4-二氯苯氧乙酸：2,4D 另外：吲哚丙酸(IPA)、萘氧乙酸(NOA)等 NAA、IBA生根培養(yǎng) 2,4

13、-D 愈傷組織誘導(dǎo)與增殖 生長(zhǎng)素種類：生長(zhǎng)素種類：細(xì)胞工程細(xì)胞工程IAA(吲哚乙酸)NAA(萘乙酸)IBA(吲哚丁酸)2,4D(2,4二氯苯氧乙酸)生長(zhǎng)素作用強(qiáng)弱順序：生長(zhǎng)素作用強(qiáng)弱順序：強(qiáng)弱細(xì)胞工程細(xì)胞工程概念：概念：是一類具有促進(jìn)細(xì)胞分裂和其他生理功能的物質(zhì)總稱。都為腺嘌呤的衍生物。在高等植物中普遍存在，特別是莖尖、根尖、未成熟的種子和生長(zhǎng)著的果實(shí)等進(jìn)行著細(xì)胞分裂的器官。（2 2）細(xì)胞分裂素類）細(xì)胞分裂素類細(xì)胞工程細(xì)胞工程細(xì)胞分裂素常用種類： 6-BA(6-芐基腺嘌呤) Kt (kinetin 激動(dòng)素) Zt (zeatin 玉米素)細(xì)胞工程細(xì)胞工程Kt ( 激動(dòng)素)6-BA(6-芐基腺嘌

14、呤)Zt (玉米素)細(xì)胞分裂素作用強(qiáng)弱順序細(xì)胞分裂素作用強(qiáng)弱順序強(qiáng)弱細(xì)胞工程細(xì)胞工程 GA3GA3（赤霉素）：（赤霉素）：最初從赤霉菌中提取到，能夠引起水稻等植株徒長(zhǎng)。在組織培養(yǎng)中有時(shí)使用，如用于匍匐莖的誘導(dǎo)。 作用：作用：通過(guò)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素的含量實(shí)現(xiàn)促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)的。促進(jìn)幼芽伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，促進(jìn)不定胚發(fā)育成小植株打破休眠。多用GA3。 赤霉素和生長(zhǎng)素協(xié)同作用，對(duì)形成層的分化有影響：當(dāng)生長(zhǎng)素/赤霉素比值高時(shí)有利于木質(zhì)部分化，比值低時(shí)有利于韌皮部分化。 用量：用量：mg/L級(jí) 用法：用法：易溶于水、乙醇，多用95乙醇溶解儲(chǔ)存。（3 3）赤霉素）赤霉素細(xì)胞工程細(xì)胞工程脫落酸（ABA）因物種不同，能促進(jìn)或抑制愈

15、傷組織生長(zhǎng)；乙烯有催熟作用，大量積累易影響生長(zhǎng)、分化，導(dǎo)致培養(yǎng)物早衰、落葉和玻璃化苗，應(yīng)盡量排除之；5.5.另外：另外：細(xì)胞工程細(xì)胞工程6. 6. 抗生物質(zhì)抗生物質(zhì)種類：種類：青霉素、鏈霉素、慶大霉素等。濃度：濃度：5-20mg/L。作用：作用：可防止菌類污染，主要。多數(shù)需過(guò)濾滅菌細(xì)胞工程細(xì)胞工程7. 7. 活性炭活性炭 目的：目的：利用其吸附能力，減少一些有毒物質(zhì)的影響。 如：用于防止酚類物質(zhì)污染引起組織褐化死亡。也能使培養(yǎng)基變黑，有利于某些植物生根。 使用濃度：使用濃度：1- 5g/L。 它的顆粒大小決定著吸附能力：它的顆粒大小決定著吸附能力：粒度越小，吸附能力越大；溫度低吸附力強(qiáng)，溫度高

16、吸附力減弱，甚至不吸附。細(xì)胞工程細(xì)胞工程8. 8. 水水 作用：作用：是植物原生質(zhì)體的組成成分，也是一切代謝過(guò)程的介質(zhì)和溶媒。 ：用蒸餾水，最好是重蒸餾水；以保持培養(yǎng)基成分的精確性。 配制培養(yǎng)基母液時(shí)要用蒸餾水，大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)可用自來(lái)水。但在少量研究上盡量用蒸餾水，以防成分的變化引起不良果。細(xì)胞工程細(xì)胞工程 母液的定義母液的定義將所用培養(yǎng)基配方的化學(xué)成分按一定的比例配成濃縮液。 2. 2. 母液的種類母液的種類（1）大量元素母液 （2）微量元素母液 （3）有機(jī)物母液（4）鐵鹽母液 （5）激素母液 二、配制培養(yǎng)基母液二、配制培養(yǎng)基母液細(xì)胞工程細(xì)胞工程（1 1）大量元素）大量元素 原則上可以混在一起

17、，但硫酸鎂與氯化鈣要單獨(dú)配制硫酸鎂與氯化鈣要單獨(dú)配制，因?yàn)楦邼舛鹊腃a2+與Mg2+與磷酸鹽混合，會(huì)產(chǎn)生不溶性沉淀。 3. 3. 母液的配制母液的配制 配制方法：用天平稱取藥品，分別加入600-700ml蒸餾水中，再用磁力攪拌器攪拌，待第一種藥品溶解，加入第二種藥品，最后定容?；蛎恳环N藥品分別溶解，然后混合，最后定溶。細(xì)胞工程細(xì)胞工程（2 2）微量元素）微量元素 用分析天平準(zhǔn)確稱取藥品，分別溶解，依次混合，最后定容。有時(shí)KI單獨(dú)配制。（3 3）鐵鹽母液）鐵鹽母液易沉淀，需單獨(dú)配制，一般配成硫酸亞鐵（FeSO47H2O）與乙二胺四乙酸二鈉(Na2-EDTA)的鐵鹽螯合劑。用少量蒸餾水將Na2-E

18、DTA加熱溶解后，再緩緩倒入FeSO4溶液充分?jǐn)嚢璨⒓訜?分鐘，使其充分螯合。細(xì)胞工程細(xì)胞工程(4)(4)有機(jī)物母液有機(jī)物母液 分別稱取藥品，溶解，混合后加水定容。(5)(5)激素母液激素母液 必需單獨(dú)配制，儲(chǔ)存于冰箱。一般濃度為0.5-1mg/ml。IAA、NAA、IBA、2，4-D等，可先用0.1mol/L的NaOH或95%的酒精溶解，然后定容。KT、BA等細(xì)胞分裂素應(yīng)先溶于少量0.1mol/L的HCl，然后定容。細(xì)胞工程細(xì)胞工程配制倍數(shù)不宜過(guò)高，可避免浪費(fèi)；也可避免倍數(shù)過(guò)高，吸取量相對(duì)少而影響準(zhǔn)確性。母液配制好后應(yīng)放在24冰箱內(nèi)保存。母液貯備時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。過(guò)長(zhǎng)時(shí)宜出現(xiàn)沉淀和微生物污染配制

19、母液注意幾點(diǎn)：配制母液注意幾點(diǎn)：細(xì)胞工程細(xì)胞工程1. 1. 培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的配制（1）將母液按順序擺放（2）取適量的蒸餾水(所需培養(yǎng)基量的2/3)入容器（3）按需要量依次取母液（吸取量按需要量依次取母液（吸取量= =配制濃度配制濃度 體積體積 / / 母液濃度）及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)母液濃度）及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)（4）加入蔗糖(30-70g/L)溶解（5）加瓊脂(6-10g/L)，煮沸，2-3min（6）定容 （7）調(diào)PH值(pH=5.8)（8）分裝培養(yǎng)瓶，封口 （9）高壓滅菌三、配制培養(yǎng)基并滅菌三、配制培養(yǎng)基并滅菌細(xì)胞工程細(xì)胞工程2. 2. 培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基的滅菌濕熱滅菌法濕熱滅菌法 培養(yǎng)基在制備后

20、的24h內(nèi)完成滅菌工序。 高壓滅菌的原理：高壓滅菌的原理： 在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸氣不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點(diǎn)不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在108kPa108kPa的的壓力壓力下，鍋內(nèi)溫度達(dá)溫度達(dá)121121。在此蒸氣溫度下，可以很快殺死各種細(xì)菌及其高度耐熱的芽孢。細(xì)胞工程細(xì)胞工程過(guò)濾滅（除）菌（不耐熱的物質(zhì)過(guò)濾滅（除）菌（不耐熱的物質(zhì) ） 一些生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(赤霉素、玉米素)、某些維生素是不耐熱的，常用過(guò)濾滅菌過(guò)濾滅菌- -細(xì)菌過(guò)濾器細(xì)菌過(guò)濾器方法。 防細(xì)菌濾膜網(wǎng)孔的直徑為0.45m0.45m以下，可阻止細(xì)菌細(xì)胞和真菌的孢子通過(guò)。細(xì)胞工程細(xì)胞工程四、常用培養(yǎng)基的種類及其特點(diǎn)四、常

21、用培養(yǎng)基的種類及其特點(diǎn)MSMS培養(yǎng)基培養(yǎng)基 是Murashige和Skoog于1962年為煙草細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計(jì)的，無(wú)機(jī)鹽數(shù)量適宜，硝酸鹽、鉀和銨鹽的含量比其他培養(yǎng)高。應(yīng)用最廣泛。主要用于園藝植物、木本植物、花卉、蔬菜等的組織培養(yǎng)。2. B52. B5培養(yǎng)基培養(yǎng)基 銨的含量較低。在豆科植物上應(yīng)用最多。培養(yǎng)大豆細(xì)胞和組織培養(yǎng)設(shè)計(jì)。3. White3. White培養(yǎng)基培養(yǎng)基 成分比較簡(jiǎn)單，無(wú)機(jī)鹽和糖的用量低。適于生根培養(yǎng)。細(xì)胞工程細(xì)胞工程植物組織培養(yǎng)問(wèn)題分析植物組織培養(yǎng)問(wèn)題分析1.1.試管玻璃化現(xiàn)象試管玻璃化現(xiàn)象 玻璃苗是植物組織培養(yǎng)中出現(xiàn)的半透明狀、畸形的試管植物，不能移栽成活。 原因：可能是不適應(yīng)

22、培養(yǎng)基環(huán)境的一種生理變態(tài)。 控制和克服的措施 a適當(dāng)提高培養(yǎng)基中滲透壓。b適當(dāng)降低細(xì)胞分裂素和赤霉素的濃度。c增加自然光照。d改善氣體交換狀況，e在培養(yǎng)基中添加間苯三酚、根皮苷、聚乙烯醇、活性炭、青霉素G鉀等添加物，可有效地減輕或防治試管苗玻璃化。 細(xì)胞工程細(xì)胞工程細(xì)胞工程細(xì)胞工程2. 2. 褐變問(wèn)題褐變問(wèn)題(browning)(browning) 原因：完整植物體細(xì)胞中，酚類化合物與多酚氧化酶分隔存在，當(dāng)切取外植體后，多酚氧化酶氧化酚類化合物成為褐色的醌類物質(zhì)和水；醌類又被酪氨酸酶等作用使蛋白質(zhì)聚合，外植體生長(zhǎng)停頓，導(dǎo)致死亡。 防止措施：a選擇適宜的外植體和培養(yǎng)條件。選擇最適宜的細(xì)胞脫分化和

23、再分化培養(yǎng)條件、強(qiáng)分生能力的外植體、適宜的溫度、全黑暗條件，使外植體處于旺盛的生長(zhǎng)狀態(tài)，便可大大減輕褐變。b加入抗氧化劑減輕醌類物質(zhì)的毒害。Vc、血清白蛋白、檸檬酸、硫代硫酸鈉等。c使用吸附劑。細(xì)胞工程細(xì)胞工程細(xì)胞工程細(xì)胞工程3.3.微生物污染問(wèn)題微生物污染問(wèn)題外植體帶菌污染與外植體的種類，取材季節(jié)，部位，預(yù)處理及消毒方法密切相關(guān)。防治措施：1改進(jìn)外植體消毒方法。2反復(fù)檢查培養(yǎng)物。3使用適當(dāng)種類和濃度的抗生素。細(xì)胞工程細(xì)胞工程第二節(jié)第二節(jié) 植物胚胎培養(yǎng)植物胚胎培養(yǎng) 主要內(nèi)容：主要內(nèi)容： 胚培養(yǎng) 胚乳培養(yǎng) 胚珠和子房培養(yǎng)細(xì)胞工程細(xì)胞工程植物胚胎培養(yǎng)植物胚胎培養(yǎng) 植物胚胎培養(yǎng)（Embryo Cul

24、ture）概念: 指對(duì)植物的胚、子房、胚珠和胚乳進(jìn)行離體培養(yǎng)，使其發(fā)育成完整植物的技術(shù)。包括胚培養(yǎng)(embryo culture)（成熟胚培養(yǎng)、幼胚培養(yǎng)）、胚珠培養(yǎng)(ovule culture)、子房培養(yǎng)(ovary culture)、胚乳培養(yǎng)(endosperm culture)等類型。細(xì)胞工程細(xì)胞工程細(xì)胞工程細(xì)胞工程細(xì)胞工程細(xì)胞工程細(xì)胞工程細(xì)胞工程一、胚培養(yǎng)一、胚培養(yǎng) 胚培養(yǎng)：指在無(wú)菌條件下將胚從胚珠或種子中分離出來(lái)，置于培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)。 胚的發(fā)育過(guò)程包括從合子分裂到幼胚形成直至發(fā)育為成熟胚的過(guò)程。細(xì)胞工程細(xì)胞工程 植物胚胎發(fā)生過(guò)程： 原胚球形胚心形胚魚(yú)雷胚子葉胚球形胚前期球形胚前

25、期心心形形胚胚前前期期魚(yú)雷胚魚(yú)雷胚球形胚球形胚細(xì)胞工程細(xì)胞工程魚(yú)雷胚細(xì)胞工程細(xì)胞工程1.胚培養(yǎng)的意義胚培養(yǎng)的意義 促使發(fā)育不良或中途敗育的胚發(fā)育成熟 縮短育種周期 獲得單倍體植株 打破休眠期促進(jìn)胚萌發(fā) 建立高頻再生體系 可作為轉(zhuǎn)基因受體材料細(xì)胞工程細(xì)胞工程2.胚培養(yǎng)技術(shù)胚培養(yǎng)技術(shù) 胚的發(fā)育對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求有2個(gè)階段，即： v 異養(yǎng)期：這一時(shí)期的幼小胚完全依賴胚乳和周圍的母體組織提供營(yíng)養(yǎng)。 v 自養(yǎng)期：這一時(shí)期胚能吸收培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽和糖，經(jīng)過(guò)自身的代謝作用合成其生長(zhǎng)必需的物質(zhì)，在營(yíng)養(yǎng)上已可以完全獨(dú)立。細(xì)胞工程細(xì)胞工程胚培養(yǎng)技術(shù)胚培養(yǎng)技術(shù) 依據(jù)所剝離胚的發(fā)育時(shí)期不同：依據(jù)所剝離胚的發(fā)育時(shí)期不同：培養(yǎng)

26、類型培養(yǎng)類型幼胚培養(yǎng)幼胚培養(yǎng)(immature embryo)成熟胚培養(yǎng)成熟胚培養(yǎng)(mature embryo)子葉形成之前子葉形成之前子葉形成之后子葉形成之后細(xì)胞工程細(xì)胞工程胚培養(yǎng)技術(shù)胚培養(yǎng)技術(shù) 成熟胚培養(yǎng)成熟胚培養(yǎng)成熟胚珠成熟胚珠合點(diǎn)合點(diǎn)珠心珠心珠被珠被珠柄珠柄珠孔珠孔胚囊胚囊細(xì)胞工程細(xì)胞工程胚培養(yǎng)技術(shù)胚培養(yǎng)技術(shù) 成熟胚培養(yǎng)：指子葉期至發(fā)育成熟的胚培養(yǎng)。成熟胚是自養(yǎng)的，培養(yǎng)基需要簡(jiǎn)單。僅提供一定的溫度、濕度就可以發(fā)芽生成植物體。如種子的發(fā)育。 培養(yǎng)過(guò)程： 種子95%酒精消毒選取完好種子70%酒精浸數(shù)秒0.1%升汞或10%次氯酸鈉浸泡無(wú)菌水沖洗種子培養(yǎng)幾天剝離種胚接種在培養(yǎng)基上。 成熟胚培養(yǎng)

27、一般較易獲得成功。成熟胚培養(yǎng)一般較易獲得成功。細(xì)胞工程細(xì)胞工程胚培養(yǎng)技術(shù)胚培養(yǎng)技術(shù)-成熟胚培養(yǎng)成熟胚培養(yǎng)細(xì)胞工程細(xì)胞工程牡丹成熟胚的離體培養(yǎng)與快速繁殖牡丹成熟胚的離體培養(yǎng)與快速繁殖細(xì)胞工程細(xì)胞工程胚培養(yǎng)技術(shù)胚培養(yǎng)技術(shù)-幼胚培養(yǎng)：是指處于原胚期、球形期、心形期、魚(yú)雷期的胚培養(yǎng)；幼胚完全是異養(yǎng)的，離體條件下培養(yǎng)要求培養(yǎng)基成分復(fù)雜，培養(yǎng)不易成功。 幼胚培養(yǎng)的基本程序取子房常規(guī)表面消毒解剖鏡下，取胚珠、去珠被、取出完整幼胚固體培養(yǎng)細(xì)胞工程細(xì)胞工程黃瓜幼胚培養(yǎng)細(xì)胞工程細(xì)胞工程 影響幼胚培養(yǎng)成功的因素影響幼胚培養(yǎng)成功的因素 培養(yǎng)基：無(wú)機(jī)鹽、碳水化合物、激素等 環(huán)境條件(溫度：多數(shù)為25-30，因植物種類有

28、所差別。光照：一般認(rèn)為黑暗或弱光條件較為合適。) 提高幼胚的成活率，可采用胚乳看護(hù)培養(yǎng)。細(xì)胞工程細(xì)胞工程 胚齡與胚性發(fā)育的關(guān)系胚齡與胚性發(fā)育的關(guān)系 胚齡越小，離體培養(yǎng)越困難； 胚的發(fā)育分為自養(yǎng)期和異養(yǎng)期；細(xì)胞工程細(xì)胞工程胚乳培養(yǎng)胚乳培養(yǎng) 胚乳培養(yǎng)（Endosperm culture）：是指將胚乳組織從母體上分離出來(lái)，通過(guò)離體培養(yǎng)，使其發(fā)育成完整植株的技術(shù)。 被子植物胚乳是由2個(gè)單倍的極核和1個(gè)單倍的精子結(jié)合而成的3倍體組織。由它可獲得無(wú)子結(jié)實(shí)的3倍體植株，進(jìn)而可將它加倍成6倍體植株。細(xì)胞工程細(xì)胞工程 1.胚乳離體培養(yǎng)的意義胚乳離體培養(yǎng)的意義v胚乳培養(yǎng)再生植株證明了全能性理論；v研究胚和胚乳的關(guān)

29、系及胚乳組織的功能；v再生植株多為三倍體，產(chǎn)生無(wú)籽果實(shí)；v可以從胚乳愈傷中分離和篩選各種類型的非整倍體植株。v胚乳細(xì)胞是研究淀粉、蛋白質(zhì)和脂類天然產(chǎn)物代謝途徑的理想系統(tǒng)。細(xì)胞工程細(xì)胞工程2.胚乳培養(yǎng)技術(shù)胚乳培養(yǎng)技術(shù)胚乳培養(yǎng)過(guò)程胚乳培養(yǎng)過(guò)程 含胚乳的果實(shí)或種子表面消毒無(wú)菌條件下胚乳的剝離接種培養(yǎng)基培養(yǎng) 培養(yǎng)室溫度25-27，黑暗或弱光下細(xì)胞工程細(xì)胞工程 影響植物胚乳培養(yǎng)的主要因素影響植物胚乳培養(yǎng)的主要因素 基因型：基因型： 胚乳是一種獨(dú)特的組織，在被子植物中它是雙受精的產(chǎn)物，在倍性上屬于三倍體，事實(shí)上我們培養(yǎng)胚乳的首要目的也是為了直接獲得三倍體植株。 胚乳的發(fā)生類型和發(fā)育程度：胚乳的發(fā)生類型和發(fā)

30、育程度：胚乳處于細(xì)胞形成期并仍保持旺盛分生能力。（游離胚乳核時(shí)期和成熟胚乳時(shí)期均不適合）。 培養(yǎng)基培養(yǎng)基細(xì)胞工程細(xì)胞工程胚乳培養(yǎng)技術(shù)胚乳培養(yǎng)技術(shù) 胚乳培養(yǎng)的器官發(fā)生胚乳培養(yǎng)的器官發(fā)生 愈傷組織形成、器官發(fā)生 （1）愈傷組織的誘導(dǎo) （2）愈傷組織的再分化 （3）胚乳苗的生根培養(yǎng)細(xì)胞工程細(xì)胞工程胚珠和子房培養(yǎng)胚珠和子房培養(yǎng)柱頭柱頭花柱花柱子房子房花?；ü；ㄍ谢ㄍ谢ńM成花組成胚囊胚囊卵細(xì)胞卵細(xì)胞株心株心珠珠 孔孔反足細(xì)胞反足細(xì)胞珠珠 被被胚珠胚珠極核極核 株柄株柄細(xì)胞工程細(xì)胞工程細(xì)胞工程細(xì)胞工程1.胚珠培養(yǎng)和子房培養(yǎng)的意義胚珠培養(yǎng)和子房培養(yǎng)的意義 胚珠培養(yǎng)的意義:u防止雜種胚早期敗育，獲得雜種植株；

31、u受精前胚珠培養(yǎng)，可作為試管受精的基礎(chǔ)；u未受精胚珠培養(yǎng)，能培養(yǎng)獲得單倍體植株，用于單倍體育種 子房培養(yǎng)的意義:u獲得雜種植株；u未授精子房培養(yǎng)為試管受精提供技術(shù)基礎(chǔ)；u未受精子房培養(yǎng)能獲得獲得單倍體植株，用于單倍體育種細(xì)胞工程細(xì)胞工程2.胚珠培養(yǎng)和子房培養(yǎng)的技術(shù)胚珠培養(yǎng)和子房培養(yǎng)的技術(shù) 胚珠培養(yǎng)：將胚珠從母株中分離出來(lái)，放在無(wú)菌的人工環(huán)境條件下，讓其進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育，以致形成幼苗的過(guò)程。 根據(jù)胚珠是否受精分為兩類： 受精胚珠的培養(yǎng) 未受精胚珠的培養(yǎng)細(xì)胞工程細(xì)胞工程胚珠培養(yǎng)胚珠培養(yǎng)胚珠培養(yǎng)的方法胚珠培養(yǎng)的方法 培養(yǎng)受精胚珠，摘取授粉時(shí)間合適的子房，如培養(yǎng)未受精胚珠，則在授粉前摘取子房表面滅菌剖開(kāi)

32、子房壁，取出胚珠或帶胚珠的胎座接種培養(yǎng)。影響胚珠培養(yǎng)成功的因素影響胚珠培養(yǎng)成功的因素 材料的選擇 發(fā)育時(shí)期 胎座組織 培養(yǎng)基 細(xì)胞工程細(xì)胞工程 子房培養(yǎng)：將子房從母株上摘下，放在無(wú)菌的人工環(huán)境條件下，讓其進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育，以至形成幼苗的過(guò)程。包括授粉子房和未授粉子房培養(yǎng)。 受精后的子房仍需進(jìn)行表面消毒后再接種。而未受精子房可將花被表面消毒后，在無(wú)菌條件下直接剝?nèi)∽臃拷臃N。 子房培養(yǎng)只需較簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基即可形成果實(shí)，并含成熟種子。 授粉或授粉后的子房授粉或授粉后的子房表面消毒表面消毒接種培養(yǎng)接種培養(yǎng)細(xì)胞工程細(xì)胞工程 子房培養(yǎng)子房培養(yǎng) 影響子房培養(yǎng)的因素影響子房培養(yǎng)的因素v材料的選擇：品種間的差異、胚囊發(fā)育時(shí)期v培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基、激素、蔗糖（3-10%）v接種方式：要注意極性；營(yíng)養(yǎng)吸收 單倍體來(lái)源和發(fā)育途徑v由助細(xì)胞或胚囊的無(wú)配子生殖產(chǎn)生單倍體v卵細(xì)胞、助細(xì)胞、反助