葉綠素熒光及分析技術

1、葉綠素熒光與分析技術葉綠素熒光與分析技術 鄭彩霞鄭彩霞光合作用與葉綠素熒光光合作用與葉綠素熒光在光合膜上，有在光合膜上，有2到到10%的吸收光能以的吸收光能以PSII熒光的形式釋熒光的形式釋放出來。而放出來。而PSI發(fā)射的熒光量很小并且是恒定的，這里沒有發(fā)射的熒光量很小并且是恒定的，這里沒有進行考慮。進行考慮。 活體狀態(tài)下，葉綠素熒光幾乎全部來源于活體狀態(tài)下，葉綠素熒光幾乎全部來源于PS II的的Chla（包括天線（包括天線Chl a），活體葉綠素熒光提供），活體葉綠素熒光提供的快速信息僅僅反映了的快速信息僅僅反映了PS II對激發(fā)能的利用和耗散對激發(fā)能的利用和耗散情況情況. 光合作用過程的各

2、個步驟密切偶聯(lián)，因此任何光合作用過程的各個步驟密切偶聯(lián)，因此任何一步的變化都會影響到一步的變化都會影響到PS II從而引起熒光變化，也從而引起熒光變化，也就是說通過葉綠素熒光幾乎可以探測所有光合作用就是說通過葉綠素熒光幾乎可以探測所有光合作用過程的變化過程的變化.JUNIOR PAM（Pulse Amplitude Modulated Pulse Amplitude Modulated FluorescenceFluorescence，PAMPAM）JUNIOR PAM的主要操作過程的主要操作過程暗適應葉夾暗適應葉夾光適應葉夾光適應葉夾調制葉綠素熒光技術作為測定植物光合作用調制葉綠素熒光技術作

3、為測定植物光合作用最簡便有效的技術，在國際生物學界多個領最簡便有效的技術，在國際生物學界多個領域得到了非常廣泛的應用，如研究植物脅迫、域得到了非常廣泛的應用，如研究植物脅迫、衰老、篩選突變體等。衰老、篩選突變體等。PAMPAM技術與熒光淬滅的飽和脈沖分析結合是技術與熒光淬滅的飽和脈沖分析結合是目前測定植物光合作用的標準技術目前測定植物光合作用的標準技術葉綠素熒光儀工作原理葉綠素熒光儀工作原理 用于激發(fā)熒光的測量光具有一定的調制用于激發(fā)熒光的測量光具有一定的調制（開（開/關）頻率，檢測器只記錄與測量光同頻的熒光，關）頻率，檢測器只記錄與測量光同頻的熒光，因此調制熒光儀允許測量所有生理狀態(tài)下的熒光

4、，包因此調制熒光儀允許測量所有生理狀態(tài)下的熒光，包括背景光很強時。括背景光很強時。，打開一個持續(xù)時間很短（一般小于，打開一個持續(xù)時間很短（一般小于1 s）的強光關閉所有的電子門（光合作用被暫時抑制），的強光關閉所有的電子門（光合作用被暫時抑制），從而使葉綠素熒光達到最大。飽和脈沖（從而使葉綠素熒光達到最大。飽和脈沖（Saturation Pulse, SP）可被看作是光化光的一個特例。）可被看作是光化光的一個特例。光化光越強，光化光越強，PS II釋放的電子越多，釋放的電子越多，PQ處累積的電子處累積的電子越多，也就是說關閉態(tài)的電子門越多，越多，也就是說關閉態(tài)的電子門越多，F(xiàn)越高。當光化越高。

5、當光化光達到使所有的電子門都關閉（不能進行光合作用）光達到使所有的電子門都關閉（不能進行光合作用）的強度時，就稱之為飽和脈沖。的強度時，就稱之為飽和脈沖。Saturation Pulse Method of Quenching AnalysisJUNIOR PAM技術參數(shù)技術參數(shù) 藍色藍色LEDLED，標準強度，標準強度0.1 mol m-2 s-1 PAR0.1 mol m-2 s-1 PAR。：藍色：藍色LEDLED，光強范圍，光強范圍0 01500 mol m-2 s-1PAR1500 mol m-2 s-1PAR（光纖與樣品間的距離為光纖與樣品間的距離為1 mm1 mm時）。時）。藍色

6、藍色LEDLED，最大飽和閃光強度，最大飽和閃光強度30003000 mol m-mol m-2 s-1PAR2 s-1PAR。LEDLED，730 nm730 nm。長長40cm40cm，直徑，直徑1.5 mm1.5 mm。FoFo、FmFm、Fv/FmFv/Fm、FtFt、FmFm、FoFo、qPqP、qNqN、NPQNPQ和和rETRrETR等等由暗適應和光適應下葉片光化學淬滅由最大到最小引起的（Fm-Fo和Fm-Fo）。由不產(chǎn)生光化學淬滅和達到最大光化學淬滅（Fm-Fm和Fo-Fo）的光淬滅引起的。在飽和脈沖光發(fā)射之前，在Fm和Fo之間的區(qū)域內，誘導曲線上，它表示PS反應中心的關閉程度

7、。 JUNIOR PAM測量參數(shù)測量參數(shù) （Relative Fluorescence Yields）Fm：關閉所有關閉所有PSPS反應中心的高光強脈沖激發(fā)的最大熒光值。反應中心的高光強脈沖激發(fā)的最大熒光值。Fm= Fo + Fv。Fo ：固定熒光或初始熒光產(chǎn)量，也稱基礎熒光。代表不參與固定熒光或初始熒光產(chǎn)量，也稱基礎熒光。代表不參與PS 光化學反應的光能輻射部分，是光化學反應的光能輻射部分，是PS 反應中心處于完反應中心處于完全開放時的熒光產(chǎn)量，它與葉綠素濃度有關。全開放時的熒光產(chǎn)量，它與葉綠素濃度有關。 Fv ：可變熒光產(chǎn)量，代表可參與可變熒光產(chǎn)量，代表可參與PS 光化學反應的光能輻射光化

8、學反應的光能輻射部分，反映了部分，反映了PS 原初電子受體原初電子受體QA 的還原情況。的還原情況。Fo Fo 維持維持PSPS反應中心打開的低光強激發(fā)的最小熒光值。反應中心打開的低光強激發(fā)的最小熒光值。Fo：光處理中的最小熒光值：在光處理中的最小熒光值：在Fo-Mode中，中，F(xiàn)oFo熒光在飽和脈沖之后發(fā)出，暗適應是熒光在飽和脈沖之后發(fā)出，暗適應是PSPS受受到遠紅光激發(fā)快速轉運光系統(tǒng)間的電子，因此開到遠紅光激發(fā)快速轉運光系統(tǒng)間的電子，因此開啟啟PSPS反應中心。反應中心。 Fo Fo=1/(1/Fo-1/Fm+1/Fm=1/(1/Fo-1/Fm+1/Fm) )FmFm：飽和光脈沖誘導期：飽

9、和光脈沖誘導期PSPS反應中心暫時關閉時反應中心暫時關閉時的最大熒光值。的最大熒光值。F F：F F值是光處理期間打飽和脈沖光之前熒光曲線值是光處理期間打飽和脈沖光之前熒光曲線上的點的取值。上的點的取值。JUNIOR PAM測量參數(shù)測量參數(shù)continued （Fluorescence Quenching Coefficients） PS最大光化學消耗和有效光化學消耗Y()衡量激發(fā)能用于光化學的量。 這兩個參數(shù)都是衡量PS反應中心那部分能量的。qp建立在單個的PS天線分子的概念上，而qL假設天線分子之間彼此聯(lián)系，更接近于葉片內真實情況。這兩個參數(shù)的測定不需要使用暗適應樣品進行熒光測定，F(xiàn)o按照

10、Oxborough和Baker(1997)方法經(jīng)過計算得到。這兩個參數(shù)都與類囊體基質中依賴pH和玉米黃素產(chǎn)生過程的激發(fā)能的非光化學淬滅相關。與以前的熒光系數(shù)比較，qN和NPQ的計算總要測定樣品暗適應和光適應條件下的熒光。對于集合光合天線分子，Y（NPQ）可以定量激發(fā)能通過光保護機制散失的能量：其他非光化學能量稱為Y(NO)。最后，光化學和非光化學耗能之和為1：Y()+Y(NPQ)+Y(NO)=1 根據(jù)ETR=PARETR-FactorPPS2/PPPSY()計算。為計算ETR，WinControl-3使用JUNIOR PAM內部脈沖激發(fā)輻射裝置得到PAR值。在其他光照條件下，不使用PAR帶入E

11、TR計算。測量程序指暴露在光強持續(xù)增加的活化光下的測定程序。通常，每個光強的時間間隔對于光合反應完全達到平衡太短。因此，將這中光曲線稱為“快速光曲線”（Rapid Light Curves， RLC），它說明當前光合的狀態(tài)，不能和經(jīng)典光合光相應曲線相混。JUNIOR PAM測量參數(shù)測量參數(shù)continued JUNIOR PAM測量參數(shù)測量參數(shù)continued 藍色LED，標準強度0.1 mol m-2 s-1 PAR。：藍色LED，光強范圍01500 mol m-2 s-1PAR（光纖與樣品間的距離為1 mm時）。藍色LED，最大飽和閃光強度3000 mol m-2 s-1PAR。LED，730 nm。PIN