分子標記輔助選擇在瘦肉型豬選育中應柳小春

1、 養(yǎng)豬業(yè)是我省傳統(tǒng)優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)，但長期來存在重數(shù)量、輕質(zhì)量、重引種、輕選育傾向，為了扭轉(zhuǎn)這種局面，我們主持實施了湖南省科技廳重大專項“優(yōu)質(zhì)瘦肉型豬選育及產(chǎn)業(yè)化關鍵技術(shù)”研究，采用分子育種與常規(guī)育種分子育種與常規(guī)育種相結(jié)合的技術(shù)路線，以市場為導向，以性能測定、遺傳評估、功能基因檢測為依托，實施大群選擇，開放核心群選育及標記輔助選擇，經(jīng)過幾年努力，培育成了湘虹豬湘虹豬配套系和湘益豬配套系配套系和湘益豬配套系。 l不受環(huán)境因素的影響 遺傳力1l可以早期測定l對所有個體，雌性和雄性都可測定l數(shù)量大，覆蓋整個基因組64625539383731213830251595420102030405060701234

2、5l雌激素受體基因（ESR）l促卵泡素亞基基因（FSH）l催乳素基因（PRL）、l催乳素受體基因（PRLR）l核受體輔激活蛋白1基因（NCOA1）一、繁殖性狀相關基因的篩選與效應分析大 白長 白胎數(shù)總產(chǎn)仔數(shù)產(chǎn)活仔數(shù)胎數(shù)總產(chǎn)仔數(shù)產(chǎn)活仔數(shù)AA13910.03a8.59a22610.629.52AB32010.12ab8.91ab10510.719.72BB9310.58b9.05b11010a0.280.23d0.190.09ESR基因型對大白和長白豬TNB和NBA的影響 BB BB AA AA AB AB ESR基因座多態(tài)性圖譜效應大的：陳克飛等在地方豬種中（N84） 頭胎TNB： BBAA3.

3、37 NBA： BBAA=3.58效應小的：本室劉志偉等在大白、長白豬中（N552） 各胎平均TNB： BBAA0.55 NBA： BBAA=0.46效應相反的：陳俊峰等在清平豬中（N75） TNB： AABB1.64 Van Rens等在大白梅山F2中（N275） TNB: ABBB1.20 NBA： ABBB1.22ESR基因?qū)ωi產(chǎn)仔數(shù)效應大小不一2. 卵泡刺激素亞基（FSH）基因 卵泡刺激素（Follicle stimulating hormone, FSH）是垂體前葉分泌的一種糖蛋白激素。由、兩個亞基構(gòu)成，亞基由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成，通過放射原位雜交，將其定位于2p1.31.6，

4、它與FSH、FSHR相互作用促使細胞分化與增殖，最終導致卵泡發(fā)育與成熟。 FSH基因座多態(tài)性圖譜M. PBR322 DNA/Msp Markers; 8-10.AA; 1,2,5,7,11,12,14,17.BB; 3,4,6,13,15,16.AB 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 M242/238bp 309 bp 404 bp 527 bp 622 bp 大 白長 白胎數(shù)總產(chǎn)仔數(shù)產(chǎn)活仔數(shù)胎數(shù)總產(chǎn)仔數(shù)產(chǎn)活仔數(shù)AA499.61c0.998.57b1.03109.60c0.808.50c0.79AB28510.19b0.188.87a0.181

5、0910.49b0.249.47b0.24BB21821810.4410.44a a0.220.228.948.94a a0.230.2320320310.7810.78a a0.170.179.709.70a a0.170.17a0.420.190.590.60d0.170.120.300.37FSH基因型對大白和長白豬產(chǎn)仔數(shù)的影響 趙要風趙要風等(1999）經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH基因5端側(cè)翼區(qū)有較大變異，存在品種間多態(tài)性，這種多態(tài)性是由一個292 bp的逆轉(zhuǎn)座子插入突變引起，李寧李寧等首次證明在大白豬、長白豬等商業(yè)豬種中，有利基因型（BB）比不利基因型（AA）頭胎產(chǎn)仔數(shù)相差2.532.53頭頭

6、，產(chǎn)活仔數(shù)相差2.122.12頭頭，以后胎次，有利基因型效應雖有下降，但仍能多產(chǎn)1.51.5頭頭仔豬（p0.01）。 我們的研究表明，大白豬中FSH的BB 型母豬總產(chǎn)仔數(shù)比AA 型高0.830.83頭頭（p0.05），產(chǎn)活仔數(shù)高0.370.37頭頭（p0.05），而在長白豬中，BB 型母豬比AA 型母豬相應地高1.181.18和1.201.20頭（p|T| 達100kg日齡（d）AA167.71167.71-5.07051.7737-2.290.0263*AB171.980.0035 -3.19991.7105-1.120.9075BB173.78001活體平均背膘厚(cm) AA0.990.

7、99-0.01480.0720-0.210.837AB1.000.8606 -0.01280.0694-0.180.8545BB1.02001活體校正背膘厚(cm) AA1.341.340.08160.09430.870.3913AB1.460.1869 -0.04120.0909-0.450.6526BB1.38001生長性能指數(shù) AA106.28106.283.01381.31442.220.0316*AB103.360.0010 0.72851.26750.570.5683BB102.64001MC4R基因?qū)Χ怕蹇素i部分生長性狀的效應估計基因?qū)Χ怕蹇素i部分生長性狀的效應估計 三、胴體性狀

8、相關基因的篩選及效應分析三、胴體性狀相關基因的篩選及效應分析l組蛋白脫乙?；?（HDAC 1）l垂體轉(zhuǎn)錄因子1（PIT-1）l胰島素樣生長因子II（IGF-II）性 狀基因型(樣本數(shù)) AA(28) AG(20) GG(5) 屠宰率（%）73.413.4875.682.4876.133.76胴體長（cm）79.683.6982.794.6581.674.27實測平均背膘厚（實測平均背膘厚（cm）2.290.92a2.180.67a1.970.53b平均皮厚（cm）0.280.090.260.050.250.07眼肌面積（cm2）48.736.5449.435.9751.878.64后腿比例（

9、%）31.061.95ab30.072.63a32.972.02b瘦肉率（瘦肉率（%）68.133.45a71.352.47ab73.143.26b脂肪率（%）13.943.68a12.854.16a10.973.446b骨率（%）9.371.088.660.978.580.75皮率（%）8.561.13a7.140.90b7.310.87b1、HDAC1基因基因?qū)Χ怕蹇素i胴體性狀的效應估計表 性 狀基因型(樣本數(shù)) CC(3) CD(12) DD(23) 屠宰率（%）75.893.5674.213.4673.912.67胴體長（cm）82.564.5881.734.1279.673.82實測

10、平均背膘厚實測平均背膘厚（cm）1.950.72a2.210.86b2.270.53b平均皮厚（cm）0.260.080.260.090.270.05眼肌面積（眼肌面積（cm2）52.795.85a50.356.97ab48.877.34b后腿比例（%）31.962.3531.211.6330.592.21瘦肉率（瘦肉率（%）73.192.45a71.633.17ab68.243.26b脂肪率（%）11.153.46a11.854.12a14.294.44b骨率（%）8.430.898.960.979.351.05 皮率（%）7.230.917.560.89 8.121.08 2、PIT-1基

11、因基因?qū)Χ怕蹇素i胴體性狀的效應估計基因型 AAABBB屠宰率（%）75.392.3974.813.7276.273.29胴體長（cm）80.864.6380.293.4483.503.79平均皮厚（cm）0.290.060.250.090.250.02眼肌面積（眼肌面積（cm2）48.324.47a47.438.72a53.939.93b后腿比例（%）30.631.9631.073.6331.272.29肉率（肉率（%）69.322.41a71.543.96b72.142.63b脂率（%）12.324.86a11.694.60a10.913.56b皮率（%）8.100.997.961.057.

12、190.59骨率（%）8.901.359.101.048.840.733、IGF-基因基因?qū)Χ怕蹇素i胴體性狀的效應估計對杜洛克豬胴體性狀的效應估計基因型 AAABBB屠宰率（%）76.462.5575.673.8776.483.64胴體長（cm）87.584.3687.133.5288.153.43平均皮厚（cm）0.270.050.260.080.250.03眼肌面積（眼肌面積（cm2）48.415.12a51.276.27b53.347.28b后腿比例（%）30.762.3330.982.7831.062.62肉率（%）68.572.36a70.853.58b71.362.59b脂率（%）

13、13.414.35A11.534.74B12.423.83ab皮率（%）9.541.07a8.490.98b8.350.61b骨率（%）8.481.569.131.348.770.67 IGF-基因?qū)驅(qū)﹂L白豬長白豬胴體性狀的效應估計胴體性狀的效應估計l氟烷基因（Hal）：系水力，肉色，pH值l心臟脂肪酸結(jié)合蛋白（H-FABP）：肌內(nèi)脂肪含量四、肉質(zhì)性狀相關基因的篩選與效應分析四、肉質(zhì)性狀相關基因的篩選與效應分析 心臟脂肪酸結(jié)合蛋白基因（心臟脂肪酸結(jié)合蛋白基因（H-FABPH-FABP）可有效提高肌內(nèi)）可有效提高肌內(nèi)脂肪含量、嫩度及口味，該基因存在于脂肪含量、嫩度及口味，該基因存在于6 6號

14、染色體，號染色體，由上游調(diào)控系列、4個外顯子和3個內(nèi)含子及0.2kb 3端非轉(zhuǎn)錄區(qū)組成。采用PCR- RFLP法發(fā)現(xiàn)在第2內(nèi)含子存在Hae、Msp I多態(tài)性酶切位點。其中杜長大商品豬Hae dddd型肌內(nèi)脂肪含型肌內(nèi)脂肪含量平均為量平均為2.579%2.579%，DdDd型平均為型平均為1.682%1.682%，模型效應極其顯著，因此H-FABP Hae dd型可以作為遺傳標記用于提高商品瘦肉豬的肌內(nèi)脂肪含量，改善肉質(zhì)和口味，具有很大的開發(fā)利用價值。分類變量水平LS Means 模型效應效應估計值Pr估計值標準誤T值Pr|T| dd2.579 0.0087* 0.89700.30492.940

15、.0087* Dd1.682001H-FABP Hae位點對肌內(nèi)脂肪含量的效應估計 H-FABP基因基因PCR-RFLPPCR-RFLP（HaeHae ）電泳圖譜）電泳圖譜D（683+117+16bp），d（405+278+117+16bp），1,2,8,9,14,16,17,19為Dd，11為DD，37,10,12,13,15,18,2022為ddP為PCR擴增產(chǎn)物，M為X174 DNA/ Hae Maker118bp194bp234bp271bp310bp603bp872bp1078bp1353bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 6 17 18

16、 19 20 21 22 P Ml氟烷基因：應激敏感性lETEC F18受體基因：仔豬斷奶后腹瀉lETEC F4（K88）受體基因：初生仔豬腹瀉健康健康遺傳遺傳遺傳遺傳改良改良 五、抗病性相關基因的篩選與效應五、抗病性相關基因的篩選與效應 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1819 20 21 22 23 24 25氟烷基因型檢測結(jié)果112，14，18，25為NN； 15，22為nn； 16，17，20，21，23，24為Nn； 13為pBR322 DNA/Msp標準分子量 由腸毒素大腸桿菌腸毒素大腸桿菌引起的發(fā)病率和死亡率約占56.2%56.

17、2%和和24.7%24.7%。危害最大的主要有引起1 1 2 2周齡仔豬黃、白痢周齡仔豬黃、白痢的E.coli K88（F4）和引起斷奶后仔豬腹瀉和水腫病仔豬腹瀉和水腫病的E.coli F18。 ETECETEC F18 F18找到（1）巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因（巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因（FUT1FUT1）可作）可作為為ETEC F18ETEC F18受體的候選基因受體的候選基因。該基因的Hinf IRFLP位點的M307處G突變?yōu)锳時，形成抗性型抗性型AAAA，而，而GGGG、AGAG為敏感型為敏感型。我們檢測中外豬種豬種867867頭頭樣品發(fā)現(xiàn)，總的來說抗性型個體（AA）較少，在大白、長白、杜洛克豬中平均

18、為6%6%，其余全部是敏敏感型（感型（GGGG、AGAG），），而本地豬種寧鄉(xiāng)豬、大圍子豬、沙子嶺豬全部屬敏感型，無抗性型。這一結(jié)果與這些豬種均易感染ETEC病的實際情況一致。但證明了ETEC是可以通過遺傳學方法控制的，只要及早對豬只采樣檢測分型，將AAAA型留種，淘型留種，淘汰或逐步淘汰汰或逐步淘汰GGGG型、型、AGAG型，久而久之，將可使型，久而久之，將可使AAAA型頻率升高，型頻率升高，GGGG、AGAG型頻率下降，達到抗病育種之目的。型頻率下降，達到抗病育種之目的。M 1 2 3 4 5 6 7圖1 外來豬種ECF18R基因PCR-RFLP 酶切圖譜 M為pBR322 DNA/Msp

19、標準分子量 1、4:AA; 2、7:AG; 3、5、6:GG 圖2 地方豬種ECF18R基因PCR- RFLP酶切圖譜 M為pBR322 DNA/Msp標準分子量; 18為GG型;P為PCR產(chǎn)物62252740424211090421 24193873282419387M 1 2 3 4 5 6 7 8 P62252740424211090 F4(導致初生仔豬瀉痢)能否結(jié)合到豬的小腸上皮細胞，決定于豬小腸粘膜有無受體有無受體。無受體無受體的豬在受到細菌感染時不發(fā)病，表現(xiàn)為抗性的豬在受到細菌感染時不發(fā)病，表現(xiàn)為抗性，因此，培育出抗性豬具有重要意義。而目前尚未克而目前尚未克隆出受體基因，對受體的各

20、種序列也未見報道隆出受體基因，對受體的各種序列也未見報道。尋找和篩選該受體的基因是ETEC抗病育種的重要途徑。l受體的定位受體的定位lEdfors-Lija等（1995）將F4ab和F4ac受體準確定位于13號染色體長臂3.1區(qū)，并且2個位點間緊密連鎖（=0.01，Z=41.06）。lPeelman等（1999）報道了4個涵蓋F4abR和F4acR的2Mbp區(qū)間的微衛(wèi)星標記，并證明F4adR不位于13號染色體。l我室采用差異顯示法篩選F4受體相關基因，首次提出ASIP、PMCA 1 和 GPI 1基因分別為F4ab, ac和ad受體的相關基因，并進一步篩選候選基因與受體相關的SNP。l同源比對

21、表明，由引物1擴增產(chǎn)物在485485堿基處，堿基處，所有黏附型個體的堿基均為所有黏附型個體的堿基均為G G，而所有不黏附，而所有不黏附型個體的堿基均為型個體的堿基均為A A，在第，在第619619堿基處，所有黏堿基處，所有黏附型個體的堿基均為附型個體的堿基均為A A，而所有不黏附型個體，而所有不黏附型個體的堿基均為的堿基均為T。可見這二個位點的SNP很可能是影響?zhàn)じ叫?，也就是影響F4ab受體有無的位點。l測序結(jié)果經(jīng)同源比對后發(fā)現(xiàn)，其中由引物2擴增產(chǎn)物在在142142堿基處，所有黏附型個體的堿基堿基處，所有黏附型個體的堿基均為均為A A，而所有不黏附型個體的堿基均為，而所有不黏附型個體的堿基均為

22、T T。可見這個位點的SNP很可能是影響?zhàn)じ叫?，也就是影響F4ac受體有無的位點。l 結(jié)果表明，結(jié)果表明，在第在第242242、243243堿基位置，所有堿基位置，所有F4 F4 adad黏附型個體均為黏附型個體均為ATAT，而所有不黏附型個體均，而所有不黏附型個體均為為TGTG。而在其它位置，如第19堿基位置、24堿基位置等雖然存在SNP，但這些SNP都與黏附性沒有相關性。1.繁殖性狀是低遺傳力性狀，常規(guī)選育方法很難提高產(chǎn)仔數(shù)，我們的試驗表明，ESRESR、FSHFSH、PRLRPRLR及NCOANCOA 1 1基因可用于標記輔助選擇，其中ESR及FSH基因的BB型與AA型相比，可提高大白和

23、長白豬總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)0.5-1.2頭，PRLR和NCOA 1基因的AA型與BB型相比，可提高大白和長白豬總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)2-3頭，特別是NCOA 1基因的有利基因型AA在大白和長白中有較高頻率（大白豬中為0.59，長白豬中為0.67），能較方便地用于標記輔助選擇。隨后的跟蹤調(diào)查也證實了這種效應。2生長速度和背膘厚是瘦肉型豬選育的主選性狀，基因效應分析表明，PITPIT-1-1基因的CC型、HDACHDAC 1 1基因的GG型、IGFIGF-II-II基因的AA型、MC4RMC4R基因的AA型均有顯著提高生長速度效應，達100kg活重日齡與相反基因型相比，一般都能縮短6-9天。PITPIT

24、-1-1基因的CC型、HDAC HDAC 1 1基因的GG型、IGFIGF-II-II基因的BB型有顯著降低活體背膘厚效應，降低幅度為降低幅度為1-2mm1-2mm。上述基因型的生長性能指數(shù)相應地有顯著提高，上述基因型的生長性能指數(shù)相應地有顯著提高，提高幅度在提高幅度在10%10%左右。左右。 3提高瘦肉率、降低背膘厚始終是瘦肉型豬選育的主攻目標。本研究篩選的3個基因均有顯著提高瘦肉率、降低背膘厚的效應。HDACHDAC 1 1基因的GG型、PITPIT-1-1基因的BB、IGFIGF-II-II基因的CC型的瘦肉率分別比相反基因型提高3-5個百分點，實測背膘厚降低2-3mm，眼肌面積和后腿比

25、例也有相應提高。4瘦肉型豬的豬肉粗硬、口味差，沒有本地豬肉好吃，其原因與肌纖維粗、肌內(nèi)脂肪少有關。本項研究篩選的H-FABPH-FABP基因有顯著提高肌內(nèi)脂肪含量、嫩度和口味的效應，杜長大商品豬Hae III dd型的肌內(nèi)脂肪含量平均達2.579%，而Dd型平均只有1.682%，顯然，選擇dd型豬，提高dd型豬在群體中的比例，將可大大改善瘦肉型豬的肉質(zhì)。5氟烷敏感基因（HalHaln n）純合子Haln Haln引發(fā)應激綜合征。本課題組在瘦肉型豬選育中對可疑帶有Haln基因的豬群如杜洛克、美系長白、大白等品種公豬，普遍進行了氟烷敏感基因檢測與淘汰，杜絕了應激綜合征的發(fā)生。在腸毒素大腸桿菌F18

26、的候選基因篩選上已證實FUT 1FUT 1基因的AA型為ETEC F18的抗性型，可用于標記輔助選擇。根據(jù)我室對ETEC F4受體的研究結(jié)果，可望將ASIP、PMCA 1 和 GPI 1基因作為F4受體的候選基因，應用于標記輔助選擇，具有廣闊的應用前景。 v在研究深度上，不僅要研究候選基因多態(tài)性與性能的相關，還應研究其遺傳機理，找尋更多可用于選擇的單核苷酸多態(tài)，還要從控制基因表達、調(diào)控角度深入探討基因到性狀的關系，并研究基因與基因間互作及基因與環(huán)境的互作關系。可采用基因芯片、RNAi及多基因SNP聯(lián)合分析法。v在研究的廣度上，可以肯定除了現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)與有關的主效基因外，還有一些基因尚未被發(fā)現(xiàn)，應繼

27、續(xù)運用候選基因法和基候選基因法和基因組掃描法，篩選更多與相關的基因，為分子標記輔助選擇因組掃描法，篩選更多與相關的基因，為分子標記輔助選擇、分子標記輔助選配及分子育種、分子標記輔助選配及分子育種提供更多更有效的分子標記，使豬的重要數(shù)量性狀得到更快提高。 豬相關候選基因研究存在的不足：一些研究的樣本數(shù)較少樣本數(shù)較少，有的只有數(shù)十頭豬的資料， 經(jīng)分型后一種基因型往往只有幾頭或10多頭樣本，導 致出現(xiàn)統(tǒng)計誤差。這也是某些基因效應出現(xiàn)相反結(jié)果 的原因之一。 根據(jù)正虹種豬場豬群情況，最后確定多種來源長白豬為基礎選育形成的親本系作為配套系中的母系；多種來源大白豬為基礎選育形成的親本系作為配套系中的第一父系

28、（父I系），用于與母系雜交生產(chǎn)二元雜母豬；多種來源杜洛克為基礎選育形成的親本系作為配套系中的第二父系（父II系），用于與二元雜母豬雜交，形成三元雜種商品豬。這個體系正式命名為湘虹配套系。長白(母系)大白(父I系)杜洛克(父I系)大長雜雜優(yōu)豬（杜大長）臺系杜洛克美系杜洛克 -3.5-3-2.5-2-1.5-1-0.500.51200020012002200320042005出生年度EBV杜洛克豬長白豬大白豬杜洛克、長白、大白后備豬達杜洛克、長白、大白后備豬達100kg體重日齡的遺傳趨勢體重日齡的遺傳趨勢 -0.2-0.15-0.1-0.0500.050.1200020012002200320042005出生年度EBV杜洛克豬長白豬大白豬 杜洛克、長白、大白后備豬杜洛克、長白、大白后備豬100kg體重背膘厚的遺傳趨勢體重背膘厚的遺傳趨勢 00.020.040.060.080.10.120.14200020012002200320042005出生年度EBV長白豬大白豬長白、大白母豬總產(chǎn)仔數(shù)的遺傳趨勢長白、大白母豬總產(chǎn)仔數(shù)的遺傳趨勢 主要經(jīng)濟性狀選育進展 杜洛克豬949698100102104106108110200020012002200320042005出生年度EBV杜洛克豬 杜洛克豬父系指數(shù)遺傳趨勢圖杜洛克豬父系指數(shù)遺傳趨勢圖