成果3組文獻(xiàn)翻譯

1、目錄通過短、長和雙端揭示人胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)分化過程中的動態(tài)轉(zhuǎn)錄本組1通過小鼠腦部發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄本組鑒定功能參與神經(jīng)定型的長非編碼RNA13原文39北京航空航天大學(xué)畢業(yè)設(shè)計（譯文）第 1 頁通過短、長和雙端揭示人胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)分化過程中的動態(tài)轉(zhuǎn)錄本組為了探究調(diào)控神經(jīng)分化的功能機(jī)制，我們分析了人胚胎干細(xì)胞(hESCs)向神經(jīng)譜系分化過程中的轉(zhuǎn)錄本變化。以未分化的人胚胎干細(xì)胞以及處于早期分化的三個階段的細(xì)胞N1(早期起始), N2(神經(jīng)祖細(xì)胞), N3(早期膠質(zhì)樣細(xì)胞)進(jìn)行分析為研究對象，通過結(jié)合短，雙端，長三種方法進(jìn)行分析。結(jié)果顯示在神經(jīng)分化的過程中轉(zhuǎn)錄本組和動態(tài)剪切非常復(fù)雜。我們發(fā)現(xiàn)了之前沒

2、有被注釋的轉(zhuǎn)錄本和剪切亞型，它們在分化過程中的特定階段出現(xiàn)。有趣的是，剪切亞型多樣性在未分化的人胚胎干細(xì)胞中最顯著，而在分化過程中下降，我們把這一現(xiàn)象稱為亞型專一化。在神經(jīng)分化過程中，我們觀察了許多種的差異表達(dá)，包括參與關(guān)鍵信號通路和許多胞外受體的，發(fā)現(xiàn)許多是收到階段特異性調(diào)控的。這些結(jié)果對于研究神經(jīng)分化以及揭示體外人胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)分化的機(jī)制(如神經(jīng)元命運(yùn)決定，神經(jīng)祖細(xì)胞胞生成狀態(tài)過渡)提供了寶貴的資料。維持以及由前神經(jīng)祖細(xì)胞狀態(tài)向膠質(zhì)細(xì)RNA| 剪切亞型 | 未注釋的轉(zhuǎn)錄本 | 神經(jīng)元 | 膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)決定和后續(xù)的分化過程是一個復(fù)雜的過程。雖然我們已經(jīng)得知表達(dá)在神經(jīng)組織的 RNA 的復(fù)雜性

3、是非常高的(1，2)，但是對于在神經(jīng)細(xì)胞分化的不同階段表達(dá)的和 RNA 亞型的全面分析非常缺乏。這些信息將非常重要重要，可用于了解神經(jīng)細(xì)胞分化的機(jī)制以及最終為神經(jīng)退行性疾病(如帕金森氏癥和阿爾茨海默氏病)提供治療方案。我們目前對于神經(jīng)細(xì)胞形成的了解大多來自動物模型中發(fā)育中的胚胎干細(xì)胞形成神經(jīng)細(xì)胞的研究(3, 4)。但是動物體內(nèi)神經(jīng)發(fā)生是一個涉及許多種類型細(xì)胞的非同步分化復(fù)雜過程。這種不一致性的存在以及能夠獲得的細(xì)胞數(shù)量相對較少，使得對于單個細(xì)胞的時序分化分析非常。一種解決方式是分析在體外的向神經(jīng)分化不同階段的人胚胎干細(xì)胞，從而能夠使用相對較多的細(xì)胞數(shù)量(59)。對于這些細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本組分析將能夠

4、為深入了解參與早期細(xì)胞命運(yùn)決定(如神經(jīng)元生成潛能的獲得以及向膠質(zhì)細(xì)胞生成潛能的轉(zhuǎn)變)的機(jī)制和通路提供指導(dǎo)，同北京航空航天大學(xué)畢業(yè)設(shè)計（譯文）第 2 頁時最終對于篩選和神經(jīng)退行性疾病的治療具有重要意義。之前許多高通量方法被用于研究全組轉(zhuǎn)錄(1014)。最近由 mRNA獲得的 reads 的大規(guī)模平序不斷發(fā)展，使得以空前的靈敏性和準(zhǔn)確性進(jìn)行描繪全組的轉(zhuǎn)錄區(qū)域和定量分析 RNA 亞型提供了可能(1522)。盡管短 reads能夠檢測轉(zhuǎn)錄區(qū)域和被剪切的相鄰?fù)怙@子，這種方法存在一定的限制。尤其是非相鄰?fù)怙@子和在同一個轉(zhuǎn)錄本的許多個外顯子之間的關(guān)系無法被檢測到。在本項研究工作中我們結(jié)合了許多種大規(guī)模平序技

5、術(shù)的優(yōu)勢，包括Illumina 單端 reads、雙端 reads(從 cDN段的兩端進(jìn)序；35bp)和更長的Roche 454 FLX 和 Titaniumreads(250450bp)在空前的水平上進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)以及分析轉(zhuǎn)錄本組復(fù)雜度的研究(21, 23, 24)。這些技術(shù)應(yīng)用在人胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)分化早期階段的分析。我們的結(jié)果揭示了一個超乎尋常的階段特異性轉(zhuǎn)錄和剪切。使用超過 1.5 億個唯一回貼的reads，我們發(fā)現(xiàn)了數(shù)千個未注釋的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域(TAR)以及未注釋的亞型。一些未注釋 TAR 和剪切亞型只在特定的階段轉(zhuǎn)錄，這暗示它們在神經(jīng)分化的特定時期具有功能。同時，我們描述了一個我們稱之

6、為亞型專一化的現(xiàn)象，即剪切亞型多樣性在未分化的人胚胎干細(xì)胞中復(fù)雜性最高，而在細(xì)胞經(jīng)歷神經(jīng)分化的過程中降低。最后，轉(zhuǎn)錄水平的動態(tài)變化性對于揭示體外人胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)分化過程中的神經(jīng)元決定，神經(jīng)祖細(xì)胞維持和由前神經(jīng)祖細(xì)胞狀態(tài)向膠質(zhì)細(xì)胞生成狀態(tài)過渡提供了重要的思路。結(jié)果人胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)分化特定階段的 RNA我們使用 H1 hESCs 描述了在其早期神經(jīng)分化過程中的轉(zhuǎn)錄本組變化。一共采用了 2 種分化方法。方法 A: hESCs H1 細(xì)胞系在無滋養(yǎng)層的化學(xué)限定培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)和分化，共經(jīng)歷了 3 個過程：N1: 起始階段；N2: 神經(jīng)祖細(xì)胞(NPC)階段，只產(chǎn)生神經(jīng)元細(xì)胞；N3: 產(chǎn)生神經(jīng)元細(xì)胞和

7、膠質(zhì)細(xì)胞（圖 1A 和 B）。方法 B:利用未分化的 H1 hESCs 通過胚狀體樣神經(jīng)球形成神經(jīng)祖細(xì)胞(N2-B)。在每種情況下，我們使用標(biāo)準(zhǔn)方案包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號拮抗劑(Noggin)和成生長因子(bFGF)。細(xì)胞為了定性和定量分析，分化步驟是高度可重現(xiàn)的。從每種方法獲得的細(xì)胞群北京航空航天大學(xué)畢業(yè)設(shè)計（譯文）第 3 頁大量 marker 的免疫檢測和 FACS 分析以確保在不同階段的細(xì)胞是高都通過度一致的（圖 1 和 SI text）。(i) 未分化的 hESCs（在方法 A 和方法 B 中）表達(dá)所有的 hESCs 表面抗原（如 TRA-1-60/81 和 SSEA4）和轉(zhuǎn)錄因子 O

8、CT4 和SOX2(Fig. 1C 和 SI Text).；(ii) N1 起始階段細(xì)胞（只在方法 A 中）不再表達(dá) TRA- 1-60/81 但是仍然表達(dá) SSEA4，不過表達(dá)水平很低，同時開始表達(dá) SSEA1。OCT4 也在細(xì)胞中低表達(dá)；(iii) N2 NPCs 中來自于方法 A 的部分不再表達(dá) OCT4 和SSEA4，但是表達(dá) NESTIN，PAX6 和 SOX1。這些細(xì)胞顯示出了一個典型的 NPCs 形態(tài)：兩極化的小胞體。膠質(zhì) 酸性蛋白(GFAP)并不表達(dá)。在停止加入生長因子之后，N2 細(xì)胞主要分化為神經(jīng)元細(xì)胞而不是膠質(zhì)細(xì)胞，這被神經(jīng)元細(xì)胞 marker TUJ1 的表達(dá)所證實。類似

9、地，超過 95%的由方法 B 得到的 N2 神經(jīng)祖細(xì)胞表達(dá)一系列神經(jīng)元 marker（神經(jīng)上皮 marker PAX6，神經(jīng)干細(xì)胞 marker NESTIN 和SOX2 以及神經(jīng)元干細(xì)胞/祖細(xì)胞 marker MUSASHI）。N2 細(xì)胞群不表達(dá)全能性hESC marker 例如 OCT4；(iv) N3 階段細(xì)胞（只在方法 A 中）顯示出了明確的形態(tài)，并且表達(dá) GFAP。在停止加入 bFGF/EGF 后，產(chǎn)生了的膠質(zhì)細(xì)胞而不是神經(jīng)元細(xì)胞。這些在體外我們觀察到的現(xiàn)象令人聯(lián)想到了體內(nèi)的神經(jīng)元發(fā)育，在這過程中神經(jīng)元先于膠質(zhì)細(xì)胞形成。這些現(xiàn)象也在 H7 hESC 細(xì)胞系中被檢測到。通過短，長和雙端

10、解釋復(fù)雜的結(jié)構(gòu)為了描述細(xì)胞特定分化階段的轉(zhuǎn)錄情況，我們獲得了一個 35bp 單端 reads，35bp 雙端 reads 和 250450bp 長 reads 的集合。雙端 reads 來自不同長度(300 bp,300600 bp 和 6001000 bp)的 cDN段。在每個分化階段使用 2 到 3 個生物重復(fù)樣本得到唯一回貼的 reads 總數(shù)量：1.4 億單端 reads，1500 萬雙端 reads， 150 萬長 reads。在 1 倍平均覆蓋率下對于 hESC-B 和 N2-B 細(xì)胞中檢測到的部分趨向飽和。我們主要35bp 單端 reads 獲得了更高的深度；雙端 reads 和

11、250450bp 長 reads 能夠提供大范圍的外顯子連接信息同時輔助確定復(fù)雜的剪切亞型。更長的 reads，尤其是 450bp reads，能夠連接最多 8 個外顯子。圖 2C 展示了一個利用不同技術(shù)構(gòu)建的具有 16 個外顯子的。北京航空航天大學(xué)畢業(yè)設(shè)計（譯文）第 4 頁通過雙端 read 鑒定未注釋的轉(zhuǎn)錄區(qū)域并確定它們之間的與之前的研究一致，數(shù)千未注釋的 TARs 被鑒定。即如果一個 TAR 與加州大學(xué) Santa Cruz (UCSC)注釋匹配，那么它將被歸類為“已知”；如果沒有匹配，那么它將被歸類為“未注釋”。一個包含 40 鑒定的 TAR 的隨機(jī)樣本中 90%的未注釋的 TAR 被

12、 RT-PCR 驗證從我們 RNA-seq 方法發(fā)現(xiàn)的 TAR 和之前報導(dǎo)的通過 tiling 微陣列鑒定的表達(dá)在肝臟中的 TAR 做了對比。我們的研究發(fā)現(xiàn)了大量沒有被 tiling 微陣列鑒定的 hESC RNA，與之前所認(rèn)為的 RNA-seq 具有更高的靈敏度和更大的動態(tài)范圍一致。有趣的是，我們也發(fā)現(xiàn)了大量未注釋的 TAR (3565%) 特異表達(dá)在各個階段：624, 246, 300 和 353 唯一注釋的 TAR 被分別發(fā)現(xiàn)表達(dá)在 hESC，N1，N2，N3 階段的細(xì)胞，增加了這些 TAR 具有功能的可能性。序列和信號跟蹤文件能夠在 表達(dá)集合(GEO)中查到。（GEO;登記號GSE20

13、301）正如所預(yù)期的，大部分的雙端reads 落在相同的已知外顯子內(nèi)。但是，reads 連接未注釋的 TAR 和 UCSC 已知注釋的(0.35%,一小部分雙端0.46%, 1.03%和 0.58%分別對應(yīng) hESC, N1, N2 和 N3) 或連接未注釋的 TAR 和其他未注釋的 TAR(0.36%, 0.38%, 1.50%和 0.89%分別對應(yīng) hESC, N1, N2 和 N3)。盡管連接的 reads 比例很低，它們大量的明確連接的 TAR 和未注釋的剪切結(jié)構(gòu)能夠通過重疊組的雙端reads 鑒定。圖 3B 展示了一個未注釋的具有至少 5 個外顯子的轉(zhuǎn)錄本特定表達(dá)在 hESC 并且通

14、過一組重疊的雙端reads 進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄本構(gòu)建。這個轉(zhuǎn)錄本和表達(dá)模式通過 RT-PCR 進(jìn)行了驗證（圖 3C）。12個這樣的多外顯子的未注釋的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)一步通過 RT-PCR 進(jìn)行了驗證。其中 11個被驗證，6 分具有階段特異性。（圖 3C）hESC 早期神經(jīng)分化的可變剪切除了細(xì)胞特異性的表達(dá)（例如 OCT4 和 GFAP）之外，我們發(fā)現(xiàn)許多有趣的分化階段特異性的可變剪切亞型。例如，神經(jīng)細(xì)胞粘附1 (NCAM1)的一種亞型在 N3 階段高表達(dá)，在 N2 階段低表達(dá)，而在 N1 和 hESC 階段沒有檢測到。（圖 4A）另外，絲氨酸/蘇氨酸激酶 2 (SLK)的一種亞型特異性表達(dá)在 hESC階段，與

15、 Gage 及其同事觀察到的現(xiàn)象一致。盡管在我們的工作中檢測到已知的剪接點(diǎn)數(shù)量趨向飽和（圖 4B 上），未注釋的剪接點(diǎn)數(shù)量隨著深度的增大而持北京航空航天大學(xué)畢業(yè)設(shè)計（譯文）第 5 頁續(xù)增大，這表明仍舊有有待發(fā)現(xiàn)未注釋的亞型。（圖 4B 下）最令人感的是剪接異構(gòu)體的多樣性如何變化從而在細(xì)胞分化過程發(fā)揮功能，過去一直沒有被驗證。因此，我們每個分化階段量化每個復(fù)合模型的獨(dú)特剪接點(diǎn)的數(shù)量（詳細(xì)信息見 SI Test）。為了分析剪接點(diǎn)多樣性，我們選取了四個階段的表達(dá)量總和處于前 500 的。這些豐富的轉(zhuǎn)錄被選中是因為它們提供了大量 reads 并且能夠檢測剪切的顯著性差異。我們的分析顯示，與神經(jīng)元階段相

16、比，在人胚胎干細(xì)胞具有更高的亞型多樣性（人類胚胎干細(xì)胞，N1， N2 和 N3 的剪接點(diǎn)數(shù)量的中值分別是 3.1，2.2，1.9 和 2.1）。有趣的是，所選擇的集合內(nèi)，這個現(xiàn)象與轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量無關(guān)（圖 4C）。這些數(shù)據(jù)表明，亞型的多樣性在分化過程中簡化，這一現(xiàn)象我們稱為亞型專一化(isoform specialization)。神經(jīng)分化過程中差異性轉(zhuǎn)錄的的分類接著我們使用 Gene Ontology 分析檢驗了轉(zhuǎn)錄差異的類型。我們發(fā)現(xiàn)與hESC 相比 N2-B 細(xì)胞中上調(diào)的中存在大量神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，神經(jīng)元分化，腦發(fā)育，調(diào)控和模式特異化有關(guān)的。（圖 5A）根據(jù)四個階段中兩兩過程（ESN1, N1N

17、2 和 N2N3）轉(zhuǎn)錄本組的動態(tài)變化對進(jìn)行聚類。（圖 5B）我們發(fā)現(xiàn)了一組包括 SOX1, SOX2, PAX6, MAP2,DCX, ZIC1, NOTCH2, HES1, 和 OLIG2 的在 N2 階段表達(dá)量最高，并別被qPCR 驗證。（圖 5C）qPCR 結(jié)果顯示 H7 hESC 表現(xiàn)出了相似的表達(dá)模式。(SI Test) KEGG 通路分析顯示在 N1 和/或 N2 階段上調(diào)卻在 N3 階段下調(diào)的許多這些以一個星號標(biāo)記與神經(jīng)活性配體 - 受體相互作用途徑有關(guān)。許多受體在 N1 和 N2 細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄，暗示這些細(xì)胞具有分化為谷氨酸能，GABA能，多巴胺能，膽堿能，腎上腺素能，血清素能神經(jīng)

18、元亞型的能力。盡管在含有bFGF/ EGF 的培養(yǎng)條件下 N2 和 N3 細(xì)胞之間的整體增殖率相似，但是在 N3 階段受體減少。這與 N3 階段細(xì)胞表達(dá)膠質(zhì) marker 并且在撤去 bFGF/EGF 后分化為膠質(zhì)細(xì)胞的偏向性的事實一致。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的協(xié)調(diào)相互作用，如 Wnt 和 FGF 之間的作用是神經(jīng)定型的關(guān)鍵。部分 Wnt 信號通路中之前被認(rèn)為參與非經(jīng)典 Wnt 信號 FZD5（卷翅的同源物 5，果蠅），WNT5A 和 WNT5B的被發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)細(xì)胞分化過程中下調(diào)。北京航空航天大學(xué)畢業(yè)設(shè)計（譯文）第 6 頁這些與 Wnt 信號通路在維持干細(xì)胞未分化狀態(tài)的功能一致。有趣的是，一組 FGF在

19、 N2 階段表達(dá)量升高而在 N3 階段降低。這組包括 FGF11, FGF13和 FGF14，這些并不與 FGF 受體結(jié)合。（圖 5D） 它們在神經(jīng)分化過程中的功能有待進(jìn)一步研究。討論我們的工作揭示了 hESC 向神經(jīng)細(xì)胞分化過程中高度的轉(zhuǎn)錄本組復(fù)雜性和動態(tài)性?？勺兗羟锌赡茏鳛橐环N促進(jìn)真核生物表型復(fù)雜性的驅(qū)動力，同時大約 94%的人類存在可變剪切。之前的研究表明大規(guī)模平序技術(shù)能夠在剪接點(diǎn)水平上揭示可變剪切亞型。我們的工作包括在不同法樂階段的雙端。未來技術(shù)的發(fā)展，包括更長的 reads，更高的通量，更低的費(fèi)用將進(jìn)一步有助于在特定時空的轉(zhuǎn)錄本組和可變剪切的定義。材料與方法使用兩種方法進(jìn)行 hESC

20、 培養(yǎng)和神經(jīng)分化。方法 A H1 hESC 培養(yǎng)在明膠包被的培養(yǎng)皿中，使用小鼠胚胎成細(xì)胞條件培養(yǎng)基，正如之前一樣添加 8 ng/mL bFGF。細(xì)胞使用 200 U/mL 胰蛋白酶 IV 處理并機(jī)械切割，以 1:3 的比例進(jìn)行擴(kuò)增。神經(jīng)分化沿用之前描述的方法進(jìn)行。簡單地講，使用 EDTA 將 hESC 以 1:5 的比例轉(zhuǎn)移至聚賴氨酸/層粘連蛋白(Sigma- Aldrich)包被的培養(yǎng)皿中，使用 N2B27 培養(yǎng)基并添加 100 ng/mL 小鼠重組蛋白因子 Noggin(R&D Systems)。在這一時期，細(xì)胞被定義為第一代(P1)，N1 細(xì)胞在分化的第 11 天收樣。第一代和第

21、二代的細(xì)胞使用膠原酶分離為小的簇，與 hESC 培養(yǎng)相似，并且在含有 Noggin 的 N2B27 培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)。從第三始，在使用 TrypLE express(Invitrogen)分離為單細(xì)胞后，細(xì)胞以 5 × 104 cells/cm2 的密度進(jìn)行培養(yǎng)，使用 N2B27 培養(yǎng)基并且添加 20 ng/mL bFGF 和 EGF。細(xì)胞能夠在培養(yǎng)條件中維持很長一段時間，從而保持穩(wěn)定地能力。N2 細(xì)胞在 P9 收樣，N3細(xì)胞在 P22 收樣。為了誘導(dǎo)后細(xì)胞的類型，撤去 bFGF 和 EGF，神經(jīng)祖細(xì)胞持續(xù)培養(yǎng)在 N2B27 培養(yǎng)基中 7 天。處于不同時期的細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行同源

22、性分析。處于 N2 和 N3 時期的細(xì)胞使用 anti-SOX1 (Abcam), SOX2 (Abcam)和北京航空航天大學(xué)畢業(yè)設(shè)計（譯文）第 7 頁MUSASHI (Chemicon)抗體進(jìn)行染色；我們共使用 102000 個細(xì)胞進(jìn)行了分析。方法 B 所有涉及 hESC 的實驗均被耶魯胚胎干細(xì)胞督查委員會批準(zhǔn)。hESC H1 細(xì)胞系(WA01, WiCell)培養(yǎng)在明膠包被的培養(yǎng)皿，處于無滋養(yǎng)層，無血清，組分限定的環(huán)境下。簡單地說，細(xì)胞培養(yǎng)在 DMEM/F12 (Invitrogen)培養(yǎng)基并加入 1% MEM-非必需氨基酸(Invitrogen)，1 mM L-谷氨酰胺，1% 青霉素-鏈

23、霉素，50 ng/mL bFGF (FGF-2) (Millipore)，1× N2 添加物以及 1× B27 添加物 (Invitrogen)，每天更換一次培養(yǎng)基。H1 細(xì)胞每隔 46 天使用 1 mg/mL 膠原酶 IV 進(jìn)行分離。使用的 hESC 處于 30 代到 70 代之間，核型正常并且表達(dá)傳統(tǒng)的 hESC marker。通過形成神經(jīng)球從而使 hESC 分化，這里對之前的方法進(jìn)行了一些修改。通過標(biāo)準(zhǔn)的免疫染色技術(shù)對細(xì)胞進(jìn)行染色和分析。RNASolexa。建庫 根據(jù)生產(chǎn)商的說明書(Qiagen)使用 Oligotex Direct mRNA 試劑盒和 Oligote

24、x mRNA 試劑盒提取 mRNA 樣品并進(jìn)行雙聚腺苷酸純化。每個庫使用 500ng mRNA。使用 10× 斷裂 buffer(Ambion)進(jìn)行 mRN段化，使用SuperScript II (Invitrogen)逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物雙鏈 cDNA。如之前描述，根據(jù) mRNA樣品試劑盒(Illumina)的說明進(jìn)行 DNA。454庫如上所述mRNA。使用熱能僅限 mRNA 樣品(200500 ng)片段化。根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行單鏈 cDNA 庫，連接接頭，并且使用 emPCRII 試劑盒(Amplicon A)在 454組設(shè)備 FLX 進(jìn)序。在 454 生命科學(xué)測序中心進(jìn)行 GS

25、 FLX Titanium cDNA 建庫和。RT-PCR and 實時定量 RT-PCR 入之前所述進(jìn)行 RT-PCR。逆轉(zhuǎn)錄處理的RNA 作為對照。參看 SI Text 了解引物和細(xì)節(jié)。生物信息學(xué)分析 請參看 SI Text致謝我們感謝 S. Marjani 對于草稿的悉心閱讀和修改；H. Monahan, A. Urrutikoetxea- Uriguen, G. Zhong, K. Nelson 和 P. Zumbo 的技術(shù)支持，以及 W. Zhong, J. Rozowsky,J. Du 和 T. Gianoulis 的討論。J.Q.W., A.S, S.W., M.G. and M

26、.S.受到美國國立衛(wèi)生和康涅狄格州的資金支持。P.N.和 W.C.受到施會基金(IOG)的部分支北京航空航天大學(xué)畢業(yè)設(shè)計（譯文）第 8 頁持。圖 1.神經(jīng)分化細(xì)胞培養(yǎng)的界定。（A）神經(jīng)分化步驟和通過方法 A 得到的 4 個階段：hESC，N1，N2 和 N3 的示意。（B）特異性表達(dá)在通過方法 A 得到的 N2 和 N3 細(xì)胞（H1 hESC）在加入或不加入生長因子條件下的免疫染色標(biāo)記。在加入生長因子 bFGF/EGF 條件下，SOX1, NESTIN 和 PAX6 表達(dá)在 N2 細(xì)胞；在不加入生長因子時，TUJ1 表達(dá)在 N2 細(xì)胞，GFAP 不表達(dá)。在撤去生長因子后 GFAP表達(dá)在 N3

27、細(xì)胞，但是 TUJ1 的表達(dá)仍舊可以觀察到。：使用 DAPI 染核。（C）方法 B 得到的細(xì)胞(H1 hESCs)的免疫染定。SOX2 表達(dá)但是 NESTIN不表達(dá)。NESTIN 和 SOX2 都表達(dá)在 N2 細(xì)胞。更高分辨率的圖片參見 SI Text。北京航空航天大學(xué)畢業(yè)設(shè)計（譯文）第 9 頁圖 2.通過 RNA-seq 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本鑒定的概述。（A）隨深度變化的檢測到的的分?jǐn)?shù)。（B）通過 450-bp reads 連接的外顯子的數(shù)量。（C）通過結(jié)合使用短和雙端揭示轉(zhuǎn)錄本的復(fù)雜度。這里只展示了單端reads 和長reads，長中發(fā)生剪切的 reads。對于雙端接的垂直線。reads，同樣的 R

28、N段顯示為 2 個單線連北京航空航天大學(xué)畢業(yè)設(shè)計（譯文）第 10 頁圖 3.通過雙端reads 得到的階段特異性的未注釋的 TAR 以及它們的。（A）（上）在每個階段尋找到的未注釋的，已知的以及唯一的 TAR。與 UCSC重疊的 TAR 歸類為“已知”。沒有重疊的歸類為“未注釋”。不與其他階段的TAR 重疊的 TAR 被稱為在那個特定的階段“唯一”。（下）已知類和未注釋類分別在兩個階段之間共同出現(xiàn)的分?jǐn)?shù)。（B）使reads 重建的一個未注釋的reads 鑒定的未注釋的轉(zhuǎn)端轉(zhuǎn)錄本(Transcript 1)的結(jié)構(gòu)。（C）對通過幾組雙端錄本進(jìn)行 RT-PCR 驗證。轉(zhuǎn)錄本 1 和它的 RT-PCR

29、 引物展示在 B 中。轉(zhuǎn)錄本 13特異性表達(dá)在 hESC，轉(zhuǎn)錄本 4 表達(dá)在 N1N3 細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄本 5 表達(dá)在 ESN2 細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄本 6 表達(dá)在 ES，N1 和 N3 細(xì)胞。北京航空航天大學(xué)畢業(yè)設(shè)計（譯文）第 11 頁圖 4.剪切分析。（A）細(xì)胞粘附1(NCAM1)（通過方框和箭頭標(biāo)記）的轉(zhuǎn)錄本亞型之一主要表達(dá)在 N3，微弱表達(dá)在 N2，不在 N1 和 hESC 階段表達(dá)。RNA-seq 信號軌的y 軸代表每個階段中通過每百萬reads 中回貼的reads 數(shù)量歸一化后的reads 密度可變剪切外顯子和相鄰的恒定表達(dá)外顯子設(shè)計了兩套 RT-PCR引物，生成了 2 個稍微不同的產(chǎn)物。DNA

30、梯度 marker 和 RT-PCR 產(chǎn)物來自同一塊膠。（B）（上）檢測到的已知剪接點(diǎn)數(shù)量趨向飽和。（下）檢測到的未注釋剪接點(diǎn)數(shù)量并未飽和。（C）hESC 階段的剪切多樣性最高，并且在細(xì)胞神經(jīng)分化過程中降低。表達(dá)量處于前 500 的通過剪接點(diǎn)多樣性進(jìn)行聚類（k 代表聚類，k=3）。剪接點(diǎn)多樣性值定義為給定所有回帖的剪接點(diǎn)的唯一的剪接點(diǎn)的數(shù)量；因此剪切多樣性值通過復(fù)合reads，復(fù)合中檢測到模型中已注釋的剪接點(diǎn)的數(shù)量和每百萬回帖的 reads 進(jìn)行了歸一化。這套表達(dá)量無關(guān)。中剪接點(diǎn)多樣性與轉(zhuǎn)錄本北京航空航天大學(xué)畢業(yè)設(shè)計（譯文）第 12 頁圖 5.神經(jīng)分化過程中的動態(tài)表達(dá)。（A）與 hESC 相比

31、在 N2 細(xì)胞中上調(diào)的（>2 倍）富集的本體論(GO)分類。（B）動態(tài)轉(zhuǎn)錄本組的定量值在神經(jīng)分化過程中變化x 軸：分化階段 hESC，N1，N2 和 N3；y 軸：log2(通過 RNA-seq 得到的表達(dá)量值)。通過對 UCSC注釋集的表達(dá)進(jìn)行聚類，27 個模式被鑒定。U，上調(diào)；D，下調(diào)；F，不變（<2 倍）。（C）在 N2 階段表達(dá)量最高的 qPCR 驗證。y 軸：log2(每個階段的使用 HPRT 歸一化的相對的表達(dá)水平)。（D）FGF表達(dá)的 qPCR 驗證。（注意：qPCR 驗證了 FGF13 的 2個亞型。）qPCR 并未在 N3 檢測到 FGF12 和 FGF13a。北

32、京航空航天大學(xué)畢業(yè)設(shè)計（譯文）第 13 頁通過小鼠腦部發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄本組鑒定功能參與神經(jīng)定型的長非編碼 RNA成體干細(xì)胞和它們的后代的轉(zhuǎn)錄本組分析是鑒定組織形成過程中新的控制分化或者增殖的因素的基礎(chǔ)。這里我們創(chuàng)造出了一株雜合的熒光報告小鼠系用于分離正在增殖的神經(jīng)元干細(xì)胞，正在分化的祖細(xì)胞和新生的神經(jīng)元，在腦部發(fā)育過程中這三種細(xì)胞是共存的，組成了混合的細(xì)胞群。轉(zhuǎn)錄本組揭示了許多新的長非編碼 RNA (lncRNA)和編碼轉(zhuǎn)錄本。重要的是，大多數(shù) lncRNA乎完全相同的表達(dá)模式，這表明 lncRNA描述的確定為神經(jīng)定型標(biāo)志的蛋白與神經(jīng)元重疊并且與它們具有近通過改變附近的細(xì)胞命運(yùn)決定子的表達(dá)從而

33、大腦皮層。我們通過lncRNA 和至今被認(rèn)為與大腦皮層無關(guān)的蛋白編碼轉(zhuǎn)錄本從而評估了我們的方法的功效。這在神經(jīng)定型和神經(jīng)元存活中產(chǎn)生了幾種明確的表型。這說明我們的研究向許多描述的轉(zhuǎn)錄本提供了迄今為止在腦部發(fā)育中毫無疑問扮演重要的證明。最后，焦點(diǎn)集中在一個 lncRNA, Miat, 我們發(fā)現(xiàn)它的變化能夠誘發(fā)對腦部發(fā)育和 Wnt7b.的反常剪切產(chǎn)生效應(yīng)。因此，我們的研究說明 lncRNA 介導(dǎo)的細(xì)胞命運(yùn)決定子的可變剪切在神經(jīng)元發(fā)生過程中的干細(xì)胞定型。The EMBO Journal 提前doi:10.1038/emboj.2013.245主題分類： RNA；神經(jīng)科學(xué)，2013 年 9 月 15

34、日；： cortical 發(fā)育；lncRNA；Miat；神經(jīng)發(fā)生；剪切介紹技術(shù)使得組分析和轉(zhuǎn)錄本組分析在空前的覆蓋度和速度下成為了可能，并且非常便利地被許多應(yīng)用，包括組范圍的表觀遺傳修飾定性，組學(xué)和物種（Metzker, 2010）。對于干細(xì)胞研究，新一代技術(shù)已經(jīng)被大部分用于全能干細(xì)胞的研究（Mikkelsen 等人, 2007; Meissner, 2010），因為其能夠以相對較高的同源性在培養(yǎng)基中生長。相反，由于在其他組織中轉(zhuǎn)錄本組的使用限制，成體干細(xì)胞與許多經(jīng)過分化的祖細(xì)胞和許多種終末分化的細(xì)胞混合，使得分離單個細(xì)胞類型的高度富集物非常。特別地，在哺乳動物的胚胎發(fā)育過程中皮質(zhì)神經(jīng)上皮干細(xì)

35、胞通過在腦室區(qū)北京航空航天大學(xué)畢業(yè)設(shè)計（譯文）第 14 頁（VZ）的根尖區(qū)域經(jīng)歷有絲進(jìn)行擴(kuò)張；因此，它們被稱為根尖祖細(xì)胞（APs）。隨著發(fā)育過程的進(jìn)行，更大比例的 APs 由增殖態(tài)轉(zhuǎn)換為分化態(tài)，從而產(chǎn)生基底祖細(xì)胞（BPs），它們離開 VZ 并形成室管膜下區(qū)（SVZ），或者產(chǎn)生神經(jīng)元細(xì)胞。大多數(shù) APs 繼續(xù)增殖，而大部分 BPs 經(jīng)歷神經(jīng)元發(fā)從而產(chǎn)生兩個后神經(jīng)元細(xì)胞，它們將穿過中間帶（IZ）從而形成外板（CP）（Go¨tz and Huttner, 2005）。值得注意的是，APs 和 BPs 都能夠進(jìn)行增殖和分化，但程度不同。有研究表明在胚胎 14.5 天大約有 60%的 APs

36、是態(tài)祖細(xì)胞（PPs），而只有大約 20%的 BPs仍然是 PPs（Attardo 等人, 2008; Arai 等人, 2011）。與之對應(yīng)，保留下來的 APs 和BPs 將命運(yùn)轉(zhuǎn)變?yōu)榉只瘧B(tài)祖細(xì)胞（DPs）從而分別產(chǎn)生神經(jīng)定型的 BPs 和后神經(jīng)元細(xì)胞（Go¨tz 和Huttner, 2005）。因此，PPs 代表對稱擴(kuò)張細(xì)胞的集合，它們將產(chǎn)生生物學(xué)性質(zhì)與母代相同的子代。相反，DPs 產(chǎn)生至少一種更有限的潛能和衰竭的子代的集合。為了理解從增殖態(tài)到分化態(tài)轉(zhuǎn)變的機(jī)制，系統(tǒng)需要考慮從祖細(xì)胞到神經(jīng)元細(xì)胞時間段的鑒定，同時分辨出混合在一起的 PPs 和 DPs。雖然概念上很簡單，實現(xiàn)這樣的特異

37、性是一項。許多研究都通過產(chǎn)生報告小鼠來解決這個問題，例如， BPs (Kwon 和Hadjantonakis, 2007), DPs (Haubensak 等人, 2004) 或者神經(jīng)元細(xì)胞 (Attardo 等人, 2008) 通過在 marker 特異性啟動子（例如分別為 Tbr2/Eomes, Btg2 或 Tubb3）之下的內(nèi)源性熒光蛋白（通常為 GFP）的表達(dá)進(jìn)行了確定。但是，這些細(xì)胞群的短暫性以及從的母代細(xì)胞到它的子代過程中報告蛋白的遺傳通常限制了組織部分的分析，即哪個部位（VZ, SVZ 或 IZ/CP）被用作細(xì)胞鑒別的代表特征。由于這些，使用單個報告系的轉(zhuǎn)錄本組分析需要以多種策

38、略補(bǔ)充從而盡量增大細(xì)胞的同源性。例如，不同發(fā)育階段的比較（Matsuki 等人, 2005; Hartl 等人,2008; Ling 等人, 2009），微切割隨機(jī)選擇細(xì)胞去回顧推斷細(xì)胞（Kawaguchi等人, 2008）或者特定分析在 S 期的細(xì)胞（Arai 等人, 2011）。此外，之前的比較干細(xì)胞和祖細(xì)胞（Pinto 等人, 2008）或神經(jīng)元細(xì)胞（Faux 等人, 2010）表達(dá)的描述，在發(fā)育過程中大多數(shù)來自于 mRNA 微陣列，這受到轉(zhuǎn)錄本組覆蓋度，靈敏度和轉(zhuǎn)錄本定量的限制。據(jù)我們所知，只有四個研究將新一代技術(shù)用于生理大腦皮層，期間采取不同的策略，試圖富集特定的細(xì)胞類型，包括選擇顯

39、微切割細(xì)胞的小集合（Ayoub 等人, 2011），比較不同發(fā)育階段（Han 等人, 2009; Yao 等北京航空航天大學(xué)畢業(yè)設(shè)計（譯文）第 15 頁人, 2012）或不同物種（Fietz 等人, 2012）。這里，我們試圖將直接嚴(yán)格地分離 PPs, DPs 和神經(jīng)元細(xì)胞與深度結(jié)合起來，從而探究特異于分化起始的轉(zhuǎn)錄本組標(biāo)志。為此目的，我們推出了一個結(jié)合RFP 和 GFP 的報告小鼠系并且對在大腦皮層發(fā)生過程中時空混集的 PPs (RFP/GFP), DPs (RFP+/GFP) 和神經(jīng)元細(xì)胞(GFP+)的三種細(xì)胞亞群進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本組測序。結(jié)果Btg2RFP 和 BtgRFP/Tubb3GFP 報

40、告系的產(chǎn)生為了通過 RFP 的表達(dá)鑒別 DPs，我們選擇 Btg2 啟動子（也被稱為 Tis21 或PC3），因為這個特異性表達(dá)在 DPs 的早期 G1 階段而不是 PPs 或者神經(jīng)元（Iacopetti 等人,1999）并且之前 Btg2GFP 系被證明對于大量胚胎大腦皮層發(fā)生，包括利用延時顯微鏡對 DPs 的譜系追蹤是有幫助的（Haubensak 等人, 2004; Arai等人, 2005; Calegari 等人, 2005; Attardo 等人, 2008）。我們把一種核RFP 的編碼序列到這個的在一種細(xì)菌人工編碼的第一個外顯子上（圖1A）并且使用結(jié)果結(jié)構(gòu)用于細(xì)胞原核注射。雜合Bt

41、g2RFP小鼠胚胎沿著神經(jīng)管顯示內(nèi)源性RFP熒光：在E9.5開始于脊髓/后腦，在E10.5延伸到中腦，在E11.5在到達(dá)端腦的水平，這如實地顯示了從尾到喙的神經(jīng)形成梯度（圖1B）。在E14.5，腦部原位雜交顯示RFP轉(zhuǎn)錄本在VZ和SVZ大量表達(dá)但是在IZ/CP幾乎沒有表達(dá)（圖1C）。與之相比，熒光顯微鏡顯示RFP+核沿著整個E14.5外側(cè)皮質(zhì)的根尖-基底軸，零散的細(xì)胞出現(xiàn)在VZ，更稠密地分布在SVZ并且在IZ/CP中大多數(shù)細(xì)胞是RFP+ （圖1D和F，紅色）。利用Pax6，Tbr2（例如Eomes）和Tbr1分別作為APs，BPs和神經(jīng)元細(xì)胞的marke（r Hevner等人, 2006），我

42、們發(fā)現(xiàn)大約60%的Pax6+/Tbr2 APs在VZ是RFP-，大約80%的Tbr2+ BPs在VZ和SVZ是RFP+，本質(zhì)上所有（>95%）Tbr1+神經(jīng)元細(xì)胞在SVZ，IZ或CP也是RFP+（補(bǔ)充圖S1A）。在發(fā)育過程中Btg2RFP的梯度表達(dá)（圖1B）以及在APs，BPs，神經(jīng)元細(xì)胞中Btg2RFP+細(xì)胞的比例（補(bǔ)充圖S1A）與已知的Btg2 mRNA和蛋白表達(dá)模式（Iacopetti等人, 1999)）和Btg2RFP報告小鼠的數(shù)據(jù)（Haubensak等人, 2004; Arai等人, 2011）高度一致，這表明在Btg2RFP胚胎中RFP mRNA的表達(dá)起始于DPs但是北京航空

43、航天大學(xué)畢業(yè)設(shè)計（譯文）第 16 頁RFP蛋白隨后被新生的神經(jīng)元細(xì)胞繼承。同樣與的在成年組織中Btg2的表達(dá)一致（Terra等人, 2008; Attardo等人, 2010），零散的RFP+細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)在成年海馬體（補(bǔ)充圖S1B），室管膜下區(qū)和其他組織包括數(shù)據(jù)未出示）。，骨骼肌和腎（補(bǔ)充圖S1C，為了進(jìn)一步確認(rèn)我們的Btg2RFP系，我們采用廣泛表征的Btg2RFP敲除報告（Haubensak等人, 2004; Calegari等人, 2005; Attardo等人, 2008; Arai等人, 2011）和雜交的Btg2RFP和Btg2GFP小鼠去定量這2種轉(zhuǎn)在VZ和SVZ的共區(qū)域程度，即P

44、Ps和DPs存在的區(qū)域。雙雜合Btg2RFP/Btg2GFP E14.5胚胎的冰凍切片顯示非常高的共區(qū)域程度，非常大部分（大約90%）熒光細(xì)胞是兩種報告共陽性并且剩余的RFP+/GFP or RFP/GFP+細(xì)胞數(shù)目相同（每種大約5%）（圖1D）。雙RFP+/GFP+細(xì)胞已經(jīng)在有絲 中觀察到（圖1D）并且遍布VZ和SVZ，盡管兩種報告的強(qiáng)度水平是不相關(guān)的。相反，IZ/CP顯示出一個相當(dāng)?shù)腞FP留存繼承在新生神經(jīng)元細(xì)胞（圖1F，紅色），這似乎比Btg2驅(qū)動的GFP更加顯著。顯然，在子代細(xì)胞中強(qiáng)度和熒光持久性的差異歸因于兩種報告的成熟/降解的不同時間以及用于獲得2種小鼠系的不同策略（分別為原核注射

45、和knock-in）。不過，Btg2驅(qū)動deRFP和GFP以及許多證實Btg2RFP系的使用的報告Calegari等人, 2005;Attardo等人, 2008; Arai等人, 2011）的高度共區(qū)域使我們推斷我們的新的BtgRFP報告真正地非常適合可靠地鑒定DPs；至少對于RFP+細(xì)胞在VZ和SVZ是可行的。為了鑒別繼承的但不表達(dá)RFP的神經(jīng)元細(xì)胞，我們雜交Btg2RFP小鼠和一個已（Haubensak等人, 2004;被描述的Tubb3GFP報告，這里GFP選擇性表達(dá)在新生神經(jīng)元細(xì)胞，是一種神經(jīng)元性祖細(xì)胞（ Attardo 等人, 2008 ）的有絲的早期之一。雙雜交Btg2RFP/T

46、ubb3GFP胚胎（圖1E和F）顯示了幾乎完全的（>95%）GFP與早期神經(jīng)元marker Tubb3和Tbr1的共區(qū)域（未出示）。綜上所述，我們的結(jié)果和之前的報告（Haubensak等人, 2004; Attardo等人, 2008）確認(rèn)了Btg2RFP/Tubb3GFP胚胎的使用嚴(yán)密地區(qū)分了 PPs (RFP/GFP), DPs (RFP+/GFP) 和神 經(jīng)元細(xì)胞(RFP+/GFP+)（之后分別被稱為RFP, RFP+和GFP+）。PPs, DPs和神經(jīng)元細(xì)胞的分選和轉(zhuǎn)錄本組北京航空航天大學(xué)畢業(yè)設(shè)計（譯文）第 17 頁在雜交雙雜合的Btg2RFP/Tubb3GFP和野生型C57/B

47、l6小鼠之后進(jìn)行細(xì)胞分選，根據(jù)整裝熒光立體顯微鏡識別的它們的顏色選擇E14.5胚胎。RFP+和/或GFP+胚胎的孟德爾比例被觀察到并且它們的腦部被收集，在解剖側(cè)腦室并且去除腦膜后獲得單細(xì)胞懸液。FAC分選顯示了RFP表達(dá)的連續(xù)梯度以及GFP-和GFP+2個明確的細(xì)胞群（圖2A）。因此，RFP的臨界值選為模仿通過熒光顯微鏡進(jìn)行的在VZ和SVZ中的RFP-和RFP+祖細(xì)胞的比例（即在排除GFP+神經(jīng)元細(xì)胞后）（圖1D；補(bǔ)充圖S1A）并且對于RFP-和RFP+細(xì)胞分別對應(yīng)大約30%和40%，去除剩余的30% 處于中間水平熒光強(qiáng)度的 可疑的細(xì)胞（圖2A；補(bǔ)充數(shù)據(jù)；補(bǔ)充圖2A）。驗證了我們的閾值參數(shù)，免

48、疫印跡分析新分選的細(xì)胞后顯示PPs, DPs和神經(jīng)元細(xì)胞中已知的marker（Sox2, Tbr2和Tubb3）分別顯著富集在RFP, RFP+和GFP+細(xì)胞中（補(bǔ)充圖S2C）。此外，之前的報導(dǎo)顯示系中DPs相比PPs具有更長的G1（Calegari, 2005; Arai, 2011），F(xiàn)ACS分析顯示RFP+與RFP-相比具有更高的比例（增加了大約10%）處于G1（補(bǔ)充圖S2A和B）。利用三個生物重復(fù)樣本中對每個細(xì)胞群進(jìn)行了用于大規(guī)模平序的文庫的構(gòu)建。在Illumina HiSeq2000平臺進(jìn)行，對于每個樣本產(chǎn)生了3000萬到4000萬個reads，這個深度足以達(dá)到高轉(zhuǎn)錄本組覆蓋從而用于

49、穩(wěn)健的差異表達(dá)分析（Tarazona等人, 2011）。對應(yīng)每個樣本約20000其中7080%的reads唯一地回貼了小鼠組上，（圖2B）。另外通過貼合的reads中的冗余情況對文庫差異性也進(jìn)行了評估，結(jié)果表明對于1個隨機(jī)的100萬個reads的亞樣本具有起始于幾乎90%的高度的覆蓋率（補(bǔ)充圖S2D）。在3個細(xì)胞群中的轉(zhuǎn)錄本長度分布沒有發(fā)現(xiàn)差異（補(bǔ)充圖S2E和E）。對于歸一化的表達(dá)水平，樣本與樣本之間的關(guān)聯(lián)表明生物重復(fù)樣本之間具有高度的重復(fù)性(r=0.98 ± 0.02)。同時和其他兩種細(xì)胞分別與GFP+細(xì)胞的關(guān)聯(lián)相比(r=0.65±0.02和 r=0.79±0.

50、02)，RFP-細(xì)胞與RFP+細(xì)胞(r=0.89 ± 0.05) 更接近（圖2C），這與譜系PPSDPs神經(jīng)元細(xì)胞一致。作為我們數(shù)據(jù)的第一個驗證過程，我們深入查閱了文獻(xiàn)并且分析了幾種廣泛地能夠標(biāo)記胚胎皮質(zhì)中的不同細(xì)Go¨tz和Huttner, 2005; Hevner等人, 2006; Guillemot, 2007）的表達(dá)。胞類型的對于APs/PPs，它們包括nestin, Glast (Slc1a3), vimentin, Fabp7, Pax6以及增殖態(tài)神北京航空航天大學(xué)畢業(yè)設(shè)計（譯文）第 18 頁經(jīng)干細(xì)胞（和其他體細(xì)胞）的marker例如Notch1, noggin

51、, Nanog, Sox2和musashi， 相對RFP-細(xì)胞，它們在RFP+細(xì)胞中2倍以上下調(diào)，并且在GFP+細(xì)胞中幾乎檢測不到（即10到100倍下調(diào)）（圖2D，左）。相反地，BPs/DPs的marker，包括Tbr2, Insm1, Neurog2, Emx1,Dll1和Btg2自身以及早期神經(jīng)定型的marker例如Neurod1, Insc, Numbl和Ascl1（普遍被稱作Mash1）相對RFP+細(xì)胞，也在RFP-細(xì)胞和GFP+細(xì)胞中2倍以上下調(diào)（圖2D，中）。此外，經(jīng)過廣泛描述的神經(jīng)元marker例如Tubb3, Tbr1, Dcx以及神經(jīng)元特異性細(xì)胞骨架和突觸 ，泵，通道和受體（

52、Nefm, Eno2, Elavl3, Snap25, Gabrg2, Syp和Chgb）相對于GFP+細(xì)胞都在RFP-和RFP+中幾乎檢測不到（即下調(diào)了10到100倍）（圖2，右）。對于另外一個特征，APs/PPs的細(xì)胞周期長度被認(rèn)為比BPs/DPs更短（(Salomoni和Calegari, 2010），因此RFP+細(xì)胞與RFP-細(xì)胞相比顯示關(guān)鍵周期蛋白，大多數(shù)突出周期蛋白D1/D2(Ccnd1/2)表達(dá)的減少。同時包括Rb1, Cdkn1a(p21)和Cdkn1b (p27)的抗增殖表達(dá)量的增加（圖2D，左；補(bǔ)充材料1）。綜上所述，組織切片（圖1D和F；補(bǔ)充圖S1A），細(xì)胞分選（圖2A；

53、補(bǔ)充圖S2AC）和超過50個廣泛建立marker的轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平（圖2D）的分析證明Btg2RFP / Tubb3GFP胚胎能夠用于高度分離PPs，DPs和神經(jīng)元細(xì)胞的富集區(qū)，從而使我們能夠得到一個轉(zhuǎn)錄性質(zhì)的全面的描述（補(bǔ)充材料1 ；原始數(shù)據(jù)GSE51606）。差異表達(dá)的在GEO接著我們嘗試確認(rèn)在1個祖細(xì)胞區(qū)域中相對于另一個區(qū)域上調(diào)大于50%的（即RFP-相對于RFP+，或者互相地RFP+相對于RFP-）（后者意味著下調(diào)）（FDR5%）。相似的準(zhǔn)則用于確認(rèn)DP細(xì)胞相對神經(jīng)元細(xì)胞上調(diào)或下調(diào)的（補(bǔ)充材料1）。考慮到從PPs到神經(jīng)元細(xì)胞的譜系規(guī)定，根據(jù)定義，DPs細(xì)胞群為過渡過程，我們認(rèn)為PPs和

54、神經(jīng)元細(xì)胞之間的差異并非生物相關(guān)對此進(jìn)行進(jìn)一步地討論。理解干細(xì)胞定型，我們發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)變過程中一大部分的轉(zhuǎn)錄本并沒有差異性改變（PPs到DPs(90%)，DPs到神經(jīng)元細(xì)胞(75%)）（圖3A和B）。并且在差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本中一個類似的比例上調(diào)或下調(diào)，對于6%轉(zhuǎn)錄本在PPs向DPs，13%轉(zhuǎn)錄本從DPs向神經(jīng)元細(xì)胞（圖3B）。有趣的是，我們也發(fā)現(xiàn)大部分在PPs向DPs過渡過程中上調(diào)的繼續(xù)北京航空航天大學(xué)畢業(yè)設(shè)計（譯文）第 19 頁上調(diào)，或者保持恒定，同樣在DPs向神經(jīng)元細(xì)胞的轉(zhuǎn)變中如此。相反地，在DPs中下調(diào)的繼續(xù)下調(diào)，或者保持恒定在神經(jīng)元細(xì)胞中（約85%在其中1中情況）（圖3B）。在這3中細(xì)胞類型

55、中上調(diào)/下調(diào)的模式顯示出高度的對稱性（圖3B）。對于RFP+相對RFP-或者GFP+細(xì)胞的差異表達(dá)的的功能富集的本源分析（DAVID）顯示出大多數(shù)項與神經(jīng)分化，軸-/樹發(fā)生，突觸傳導(dǎo)，離子轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞周期（圖3C和D，上；補(bǔ)充材料2）有關(guān)。比預(yù)期要少的是發(fā)現(xiàn)功能富集分析不能確認(rèn)對于RFP-相對于RFP+和RFP+相對于GFP+中的任何主要區(qū)別，大多數(shù)項（神經(jīng)分化，遷移，軸-，樹-和突觸發(fā)生）在兩者中通用和普遍（圖3C和D，中；補(bǔ)充材料2），這似乎能夠被大量同時在DPs和神經(jīng)元細(xì)胞中上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本（在接下來進(jìn)行了討論）解釋。另一方面，下調(diào)的功能注釋更明顯和特異于黏附，極化和細(xì)胞外基質(zhì)，這描繪了從RFP-向RFP+的過渡，同時明顯和特異于細(xì)胞周期，DNA和細(xì)胞骨架，這描述了從RFP+向GFP+（圖3C和D，底；補(bǔ)充材料2）。這些本源項與下調(diào)極性將離開VZ并且形成SVZ的DPs以及下調(diào)細(xì)胞周期和DNA開關(guān)將變?yōu)橛薪z后的神經(jīng)元細(xì)胞是一致的。確定神經(jīng)定型的標(biāo)志和包括許多描述的蛋白編碼轉(zhuǎn)錄本下一步我們嘗試確認(rèn)在DPs中相對于PPs和神經(jīng)元細(xì)胞特異性上調(diào)或下調(diào)的集合。這非常重要因為大多數(shù)富集在GFP+神經(jīng)元細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本，包括Tubb3和其他軸突，突觸和細(xì)胞骨架marker，開始在DPs水平上調(diào)（圖2D，右）。更普