酶聯(lián)免疫吸附實驗講義

1、2010年呂梁市獸醫(yī)實驗室培訓酶聯(lián)免疫吸附試驗Enzyme linked immunosorbent assayELISA呂梁市動物疫病預防控制中心 劉裕田1、酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）簡介n1.1、基本概念：抗原、抗體、抗原抗體的特性n1.2、ELISA方法簡介：n1.3、ELISA方法的原理n1.4、ELISA方法的分類2、ELISA試劑的組成n2.1、 ELISA試劑盒的組成n2.1.1、已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑，俗稱酶標板）；2.1.2、酶標記的抗原或抗體（酶標記物）；2.1.3、酶的底物；2.1.4、參考標準品（定量測定）；2.1.5、酶標記物及樣本的稀釋液；2.

2、1.6、洗滌液；2.1.7、酶反應終止液。3、ELISA實驗過程n3.1 、試劑的準備3.2 、加樣3.3 、保溫3.4、 洗滌3.5 、顯色和比色4、ELISA試驗的質(zhì)量控制n4.1 分析前質(zhì)控4.1.1 人員培訓 4.1.2 儀器質(zhì)控n4.1.3 標本采集及處理過程的質(zhì)控n4.2 分析中質(zhì)控2、ELISA試劑的組成n2.1、 ELISA試劑盒的組成n2.1.1、已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑，俗稱酶標板）；2.1.2、酶標記的抗原或抗體（酶標記物）；2.1.3、酶的底物；2.1.4、參考標準品（定量測定）；2.1.5、酶標記物及樣本的稀釋液；2.1.6、洗滌液；2.1.7、酶反應終

3、止液。n3、ELISA實驗過程n3.1 、試劑的準備3.2 、加樣3.3 、保溫3.4、 洗滌3.5 、顯色和比色n4、ELISA試驗的質(zhì)量控制n5、膠體金試紙、膠體金試紙n5.1、免疫層析法簡介及特點、免疫層析法簡介及特點n5.2、免疫層析法的結(jié)構及原理、免疫層析法的結(jié)構及原理n二、培訓內(nèi)容（操作部分）二、培訓內(nèi)容（操作部分）n6、操作過程演示n7、計算軟件應用說明1、酶聯(lián)免疫吸附反應法（、酶聯(lián)免疫吸附反應法（ELISA）n1.1、基本概念：、基本概念：n抗原：抗原是指進入人或動物機體后，可刺激機體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應答，從而引起動物產(chǎn)生抗體或形成致敏淋巴細胞，并能和抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生特異

4、性反應的物質(zhì)。n抗體：是由抗原刺激動物的免疫系統(tǒng)后，由免疫系統(tǒng)產(chǎn)生分泌的能和相應抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。n抗原抗體的基本特性：a、反應的特異性；b、反應的等比例性1.2、ELISA方法簡介方法簡介 ELISA屬于標記免疫學技術的一種，1971年由荷蘭和瑞典的學者提出，由于其操作過程簡單易行并可以定量，從而使其在食品安全和微生物檢測中得到了廣泛的應用。目前市場上有多種基于ELISA方法開發(fā)的用于病原微生物以及食品中抗生素檢測的試劑盒產(chǎn)品。 1.31.3、ELISAELISA方法的原理方法的原理n基于抗原抗體反應的特異性和等比例性，以基于抗原抗體反應的特異性和等比例性，以96孔的聚苯乙烯塑

5、料微孔孔的聚苯乙烯塑料微孔板（又稱酶標板）為載體，在適當?shù)募夹g條件下使抗原或抗體包被（吸板（又稱酶標板）為載體，在適當?shù)募夹g條件下使抗原或抗體包被（吸附）在酶標板微孔的內(nèi)壁上成為所謂的包被（固相）抗體或抗原，沒有附）在酶標板微孔的內(nèi)壁上成為所謂的包被（固相）抗體或抗原，沒有被吸附（游離）的抗原或抗體通過洗滌除去，然后直接加入酶標記抗體被吸附（游離）的抗原或抗體通過洗滌除去，然后直接加入酶標記抗體或抗原（或先加入適當?shù)目贵w或抗原與包被抗原或抗體反應后，再加入或抗原（或先加入適當?shù)目贵w或抗原與包被抗原或抗體反應后，再加入相應的酶標記抗體或抗原），形成酶標記的抗原相應的酶標記抗體或抗原），形成酶標記

6、的抗原抗體復合物固定在微抗體復合物固定在微孔內(nèi)，沒有吸附的酶標記物洗滌去除，加入底物溶液于微孔中，復合物孔內(nèi)，沒有吸附的酶標記物洗滌去除，加入底物溶液于微孔中，復合物上的酶催化底物使其水解、氧化或還原成為有色的底物。在一定的條件上的酶催化底物使其水解、氧化或還原成為有色的底物。在一定的條件下，復合物上酶的量（也反映了固定化的抗原抗體復合物的量）和酶產(chǎn)下，復合物上酶的量（也反映了固定化的抗原抗體復合物的量）和酶產(chǎn)物呈現(xiàn)的色澤成正比，因此可以用分光光度計進行測定，從而計算出參物呈現(xiàn)的色澤成正比，因此可以用分光光度計進行測定，從而計算出參與反應的抗原和抗體的量。這就是與反應的抗原和抗體的量。這就是E

7、LISA的原理。的原理。1.41.4、ELISAELISA方法的分類方法的分類n直接法：n直接法是指酶標抗原或抗體直接與包被在酶標板上的抗體或抗原結(jié)合形成酶標抗原抗體復合物，加入酶反應底物，測定產(chǎn)物的吸光值，計算出包被在酶標上的抗體或抗原的量。見圖2-17（a）n間接性間接性ELISAn是將酶標記在二抗上，當抗體（一抗）和包被在酶標板的抗原結(jié)合形成復合后，再以酶標二抗和復合物結(jié)合，通過測定酶反應產(chǎn)物的顏色可以（間接）反應一抗和抗原的結(jié)合情況，進而計算出抗原或抗體的量。間接性間接性ELISA原理：原理：夾心法n是先將未標記的抗體包被在酶標板上，用于捕獲抗原，在用酶標的抗體與抗原反應形成抗體-抗原

8、-酶標抗體復合物；也可以象間接法一樣應用酶標二抗和抗體-抗原-抗體復合物結(jié)合，形成抗體-抗原-抗體-酶標二抗復合物。前者稱為直接夾心法，后者稱為間接夾心法。包被雞抗包被雞抗NPNP蛋白蛋白IgGIgGIBV加加IBVIBV或被檢或被檢加兔抗加兔抗IBVIgGIBVIgG加羊抗兔加羊抗兔IgG-HRPIgG-HRP加底物顯色加底物顯色加終止液加終止液雙抗體夾心雙抗體夾心ELISA檢測傳染檢測傳染性支氣管炎病毒（性支氣管炎病毒（IBV ）雙抗原夾心法測抗體(抗HIV、Tp) 洗板待測抗體底物溫育顯色酶標抗原EE洗板固相抗原EEEEEEE液相阻斷ELISA n用于檢抗體，得到的結(jié)果比間接ELISA可

9、靠。其過程如下：n抗原包被酶標板，加待檢血清，后加酶標抗體，底物顯色，終止。n如果待檢樣陽性則與酶標板上包被的抗原結(jié)合，阻斷酶標抗體與其反應。n結(jié)果OD越高，為陰性，低為陽性n實驗中用標準陰性和陽性血清阻斷率來判斷實驗精確度，得到的結(jié)果有較好的線形關2 2、ELISAELISA試劑的組成試劑的組成n2.1、完整的、完整的ELISA試劑盒應包含以下：試劑盒應包含以下：（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑，俗稱酶標板）；（2）酶標記的抗原或抗體（酶標記物）；（3）酶的底物；（4）系列參考標準品（定量測定）；（5）酶標記物及樣本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）反應終止液。n2.2.1、固相載體

10、：、固相載體：n固相載體在ELISA測定過程中作為吸附劑和容器，不參與化學反應?？勺鱁LISA中載體的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。ELISA載體的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板最為常用，專用于EILSA的產(chǎn)品稱為ELISA板，國際上標準的微量滴定板為812的96孔式。n2.2、免疫吸附劑：、免疫吸附劑：n已包被抗原或抗體的固相載體，是ELISA方法中的核心試劑。2.32.3、酶標記物、酶標記物：n即酶標記的抗原或抗體，是ELISA中最關鍵的試劑。良好的酶標記物應該是既保有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性。酶標記物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當?shù)姆肿颖壤?/p>

11、在酶標記物中應盡量不含有或少含有游離的（未結(jié)合的）酶或游離的抗體（或抗原）。此外酶標記物還要有良好的穩(wěn)定性。在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和堿性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。2.4、酶的底物、酶的底物n2.4.1、HRP的底物的底物HRP催化過氧化物的氧化反應，最具代表性的過氧化物為H2O2，其反應式如下：DH2+ H2O2 D+ H2O上式中，DH2為供氫體，H2O2為受氫體。在ELISA中，DH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物，以便作比色測定。常用的供氫體有鄰苯二胺(OPD)、四甲

12、基聯(lián)苯胺(TMB) nOPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結(jié)合物最常用的底物。OPD本身難溶于水，OPD2HCL為水溶性。曾有報道OPD有致異變性，操作時應予注意。OPD見光易變質(zhì)，與過氧化氫混合成底物應用液后更不穩(wěn)定，須現(xiàn)配置現(xiàn)用。在試劑盒中，OPD和H2O2一般分成二組分，OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式，片劑中含有發(fā)泡助溶劑，使用更為方便。過氧化氫則配入底物緩沖液中，有制成易保存的濃縮液，使用時用蒸餾水稀釋。先進的ELISA試劑盒中則直接配成含保護劑的工作濃度為0.02% H2O2的應用液,只需加入OPD后即可作為底物應

13、用液nTMB經(jīng)HRP作用后產(chǎn)物顯藍色，目視對比鮮明。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有無致癌性等優(yōu)點，因此在ELISA中應用日趨廣泛。酶反應用HCL或H2SO4終止后，TMB產(chǎn)物由藍色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為450nm。2.52.5、洗滌液、洗滌液n洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質(zhì)的疏水基團借疏水鍵結(jié)合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復到水溶液狀態(tài)，從而脫離固

14、相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。n2.6酶反應終止液酶反應終止液常用的HRP反應終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。n2.7參考標準品參考標準品定量測定的ELISA試劑盒應含有制作標準曲線用的參考標準品，應包括覆蓋可檢測范圍的4-5個濃度，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中。3、ELISA實驗過程實驗過程n3.1 試劑的準備試劑的準備按試劑盒說明書的要求準備實驗中需用的試劑。ELISA實驗中應用蒸餾水或去離子水。自

15、配的緩沖液的PH應用pH計進行較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時放回冰箱保存。3.2 加樣加樣 在ELISA實驗中一般有5次加樣步聚，即加標準品、加樣本、加酶標記物、加底物、加反應終止液。加樣時應將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。加樣時一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標本應更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染。加酶結(jié)合物應用液和底物應用液時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成。3.3 保溫保溫 在ELISA中一般加標本和加酶標記物后會有一次抗原抗體反應?？乖贵w反應的完成需要有一定的溫

16、度和時間，這一保溫過程稱為溫育(incubation)。 ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機會，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需經(jīng)擴散才能達到反應的終點。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應總是需要一定時間的溫育。溫育常采用的溫度有43、37、室溫和4（冰箱溫度）等。為了便于操作目前絕大部分的試劑盒均采用室溫進行溫育反應，操作時的室溫應嚴格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標準室溫溫度是指20-25，但具體操作時可根據(jù)說明書的要求控制溫

17、育。室溫溫育時，ELISA板只要平置于操作臺上即可。應注意溫育的溫度和時間應按規(guī)定力求準確。3.4 洗滌洗滌n洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應步驟，但卻也決定著實驗的成敗。ELSIA就是靠洗滌來達到分離游離的和結(jié)合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來?？梢哉f在ELISA操作中，洗滌是最主要的關鍵技術，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴格按要求洗滌，不得馬虎。n洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外

18、，手工操作主要為浸泡式，過程如下： a.吸干或甩干孔內(nèi)反應液；b.用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注滿板孔后，即甩去）；c.浸泡，即將洗滌液注滿板孔，放置1-2分鐘，間歇搖動，浸泡時間不可隨意縮短；d.吸干孔內(nèi)液體。吸干應徹底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干；e.重復操作c和d，洗滌3-4次（或按說明規(guī)定）。在間接法中如本底較高，可增加洗滌次數(shù)或延長浸泡時間。3.5 顯色和比色顯色和比色n3.5.1、 顯色顯色顯色是ELISA中的最后一步溫育反應，此時酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在定量測定中，加入底物后的反應溫度和時間應按規(guī)定力求

19、準確。n底物顯色一般在室外溫或37反應20-30分鐘后即不再加深，約40分鐘將達到顯色的頂峰，再延長反應時間，可使本底值增高。底物液受光照會自行變色，顯色反應應避光進行，顯色反應結(jié)束時加入終止液終止反應。產(chǎn)物用各類酸性終止液終止后會使藍色轉(zhuǎn)變成黃色，此時可用特定的波長（450nm）測讀吸光值。3.5.2 比色比色 比色前應先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標比色儀的比色架中。比色結(jié)果的表達以往通用光密度（oplical density，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于A字母的右下角，如TMB的吸收波長為450

20、nm，表示方法為A450nm或OD450nm。n測讀A值時，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，用單波長進行測讀。也可用雙波長進行測讀，即每孔先后測讀兩次，第一次在最適波長（W1），第二次在不敏感波長（W2），兩次測定間不移動ELISA板的位置。例如TMB用450nm為W1，625nm為W2，最終測得的A值為兩者之差（W1-W2）。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。各種酶標儀性能有所不同，使用中應詳細閱讀使用說明書。3.6.3 酶標比色儀酶標比色儀n酶標比色儀簡稱酶標儀，通常指專用于測讀ELISA結(jié)果吸光度的光度計。針對固相載體形式的不同，有特制的適用于板、珠和小試管的設計。許多試劑公

21、司配套供應酶標儀。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數(shù)的準確性、重復性、精確度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標儀的讀數(shù)一般可精確到0.001，準確性為1%，重復性達0.5%。舉例說，若某孔測得的A值為1.083，則該孔相對于空氣的真實A值應為1.0830.01（1.0731.093），重復測定數(shù)次，其A值均應1.0830.05（1.0781.088）在之間。酶標儀的可測范圍視各酶標儀的性能而不同。酶標儀的檢測范圍一般在0.0003.000之間，甚至更高。超出可測上限的A值常以*或over或其它符號表示。酶標儀不應安置在陽光或強光照射下，操作時室溫宜在1530，使用前先預熱儀器15-30分鐘，

22、測讀結(jié)果更穩(wěn)定。4.ELISA4.ELISA試驗的質(zhì)量控制試驗的質(zhì)量控制n4.14.1、分析前質(zhì)控、分析前質(zhì)控n4.1.1、人員培訓、人員培訓 n實驗人員操作的技巧及熟練程度直接影響到檢驗結(jié)果，因此檢驗人員需經(jīng)過培訓，熟練掌握相關的技術知識和操作要點：檢驗項目的基本原理 （ELISA原理）；熟悉檢測技巧，了解實驗的關鍵環(huán)節(jié)及操作要點；熟悉檢測試劑性能（包括試劑盒組成，包被片段及其組成）；4.1.2、儀器質(zhì)控、儀器質(zhì)控n4.1.2、儀器質(zhì)控、儀器質(zhì)控 為使儀器保持最佳工作狀態(tài)應建立維護和校正儀器的標準操作程序（SOP），所要控制的儀器包括移液器（加樣槍），水浴箱（溫箱），洗板機和酶標儀。移液器：

23、ELISA加樣量?。?-100l），其準確性直接影響實驗結(jié)果，利用稱重法檢查：吸取刻度指示量的水，萬分之一天平稱重后計算吸量是否準確，一般應在2%以內(nèi)；水浴箱：經(jīng)常檢查水浴箱溫度計所示的溫度和水中（或溫箱內(nèi)）實測溫度是否一致，允許有1的誤差；洗板機：每個廠家設置洗板后的殘留液有各自的規(guī)定一般不超過2ul ，人工扣板時，墊紙不濕，定期檢查管孔是否堵塞；酶標儀：經(jīng)常維護其光學部分，防止濾光片霉變，定期檢測校正，使其保持良好的工作性能。 4.1.3、標本采集及處理過程的質(zhì)控、標本采集及處理過程的質(zhì)控n取樣：保證取樣有代表性，即要遵循一定的取樣方法又要保證一定的取樣比例（如：隨機多點取樣、四分法等）n

24、樣品選取過程中需要避免產(chǎn)生交叉污染。如：處理不同批次的樣品時應更換使用的工器具或?qū)κ褂玫墓ぞ哌M行徹底的清洗。4.2、分析中質(zhì)控、分析中質(zhì)控nELISA實驗的結(jié)果受操作影響很大，每個步驟包括加樣，溫育，洗滌，顯色，酶標儀讀數(shù)均應認真負責才能充分發(fā)揮ELISA的高靈敏，強特異的優(yōu)點。因此,應建立實驗項目的標準操作程序(SOP)。n加樣加樣應用微量移液器（加樣槍)按規(guī)定的量加入微孔板的底部避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。加樣槍的槍頭不要觸及微孔的內(nèi)壁。每次加樣應更換吸嘴，做到一樣一吸頭，以免發(fā)生交叉污染。n溫育大多數(shù)的試劑盒抗原抗體反應需要在室溫度下，經(jīng)過一定的時間才能達到反應的平衡

25、點ELISA邊緣效應是由溫育形成的。所以溫育一般采用能 使反應液溫度迅速達到平衡的水浴法。一種放在水浴箱的隔板上，另一種是放在溫箱的濕盒里。水要浸至板條的1/3處，不可將板條疊加放置。洗滌nELISA是靠洗滌來達到分離結(jié)合與未結(jié)合抗原抗體復合物及酶標記物的目的，同時洗滌也可將非特異吸附的蛋白質(zhì)的干擾以及血球、細菌中的酶干擾清除掉。手工洗滌一般采用浸泡方法：1）甩去孔內(nèi)反應液； 2）用洗滌液過洗一遍（即注滿孔后即甩去）； 3）微孔重新注滿洗液后浸泡2-3分鐘，間歇搖動； 4）甩去孔內(nèi)液體，拍板，用紙吸干。重復以上操作至少5次。注意各種試劑盒的洗滌液盡量不要混用。洗板機洗板一定要預先把板架放平，使

26、洗板機上的每個放液和吸液纖孔都能一致地插入孔底，將孔內(nèi)液體全部吸干，同時要設置一定的浸泡時間。如出現(xiàn)機洗后拍板有較多殘留液時應再用手工洗2次以上。關機前要用蒸溜水沖洗管道，避免堵孔。顯色nHRP催化底物是一步呈色反應，同樣需要一定的時間和溫度，一定要按照說明書規(guī)定的時間溫度（一般為室溫C，15-20分鐘）。達到規(guī)定的反應時間后需要立即終止。n酶標儀判讀結(jié)果顯色反應終止后應立刻比色（一般在30分鐘內(nèi)有效）。 常見的顯色系統(tǒng)有OPD和TMB二種，以后者最為常見，而TMB酸不易終止因此必須盡快比色以免影響結(jié)果。 TMB終止后顯黃色，測定波長為450nm， 參比波長為630nm。 使用雙波長的優(yōu)點可以消除反應板條上的劃痕手印的干擾。同時要注意反應孔底部應用紙吸干后才能置酶標儀中比色，否則吸光度易出現(xiàn)負值或損壞濾光片。5 5、膠體金試紙簡介：、膠體金試紙簡介：n5.1、免疫層析法簡介：、免疫層析法簡介：n免疫層析法 (Immunochromatography)是九十年代興起的一種基于免疫膠體金技術的快速診斷技術，其原理是將特異的抗體先固定于硝酸纖維膜的某一區(qū)帶，當該干燥的硝酸纖維素膜一端浸入樣品(尿液)