放射工作人員職業(yè)健康檢查外周血淋巴細(xì)胞微核檢測(cè)與應(yīng)急劑量估算方法

1、Q/LB.XXXXX-XXXXICS 13.100CCS C 60GBZ中華人民共和國家職業(yè)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GBZ/T XXXXXXXXX代替 WS/T 1871999放射工作人員職業(yè)健康檢查外周血淋巴細(xì)胞微核檢測(cè)方法與受照劑量估算標(biāo)準(zhǔn)Standard for the method of micronucleus detection in lymphocytes on occupational health examination for radiation workers and exposure dose estimationXXXX - XX - XX發(fā)布XXXX - XX - XX實(shí)施中華人民

2、共和國國家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布GBZ/T XXXXXXXXX目次前言II1 范圍12 規(guī)范性引用文件13 術(shù)語和定義14 標(biāo)本采集與微量全血培養(yǎng)25 微核標(biāo)本制備26 微核分析27 檢測(cè)結(jié)果判斷38 檢測(cè)報(bào)告與歸檔39 劑量-效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立310 劑量估算411 質(zhì)量控制512 CB微核法估算劑量的原則5附錄A（規(guī)范性） 主要儀器設(shè)備和試劑配制6附錄B（資料性） 微核分析記錄表和微核檢測(cè)報(bào)告單7附錄C（資料性） 放射事故受照人員生物劑量估算應(yīng)用示例9附錄D（規(guī)范性） 正確使用本標(biāo)準(zhǔn)的說明10參考文獻(xiàn)1111前言本標(biāo)準(zhǔn)代替WS/T 1871999淋巴細(xì)胞微核估算受照劑量方法。與WS/T 187

3、1999相比，除結(jié)構(gòu)調(diào)整和編輯性改動(dòng)外，主要技術(shù)變化如下：a) 在范圍中增加了“放射工作人員職業(yè)健康檢查和受照劑量估算中，外周血淋巴細(xì)胞微核的標(biāo)本制備、微核檢測(cè)、結(jié)果評(píng)價(jià)、劑量估算方法和質(zhì)量控制?！边m用范圍增加了“放射工作人員職業(yè)健康檢查微核檢測(cè)”（見第1章）；b) 增加了規(guī)范性引用文件（見第2章）；c) 術(shù)語和定義中刪除了“生物劑量計(jì)”和“松胞素-B”（見WS/T 1871999的2.1和2.5），增加了 “生物劑量估算”、“常規(guī)培養(yǎng)微核法” 和“微核率”（見3.1、3.3和3.6），更改了“微核”（見3.2，見WS/T 1871999的2.3）d) 刪除了“劑量-效應(yīng)曲線的建立方法”（見W

4、S/T 1871999的第3章）；e) 增加了“標(biāo)本采集與微量全血培養(yǎng)”、“微核標(biāo)本制備”、“微核分析”、“檢測(cè)結(jié)果判斷”、“檢測(cè)報(bào)告與歸檔”、“劑量-效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立”、“劑量估算”和“質(zhì)量控制”（見第4章第11章）；f) 更改了“CBMN法估算受照劑量的原則”（見第12章，WS/T 1871999的第4章）g) 更改了正確使用本標(biāo)準(zhǔn)的說明（見附錄D，WS/T 1871999的附錄A）；h) 增加了附錄A主要儀器設(shè)備和試劑配制（見附錄A）；i) 增加了附錄B微核分析記錄表和微核檢測(cè)報(bào)告單（見附錄B）；j) 增加了附錄C放射事故受照人員生物劑量估算應(yīng)用示例（見附錄C）；k) 增加了參考文獻(xiàn)。

5、本標(biāo)準(zhǔn)由國家衛(wèi)生健康標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)放射衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)專業(yè)委員會(huì)負(fù)責(zé)技術(shù)審查和技術(shù)咨詢，由中國疾病預(yù)防控制中心負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)性和格式審查，由國家衛(wèi)生健康委職業(yè)健康司負(fù)責(zé)業(yè)務(wù)管理、法規(guī)司負(fù)責(zé)統(tǒng)籌管理。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所、中國疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)所、河南省職業(yè)病防治研究院、蘇州大學(xué)。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：劉強(qiáng)、劉青杰、呂玉民、郝建秀、王彥、李爽、韓林、陳娜、李旭光、姜恩海。本標(biāo)準(zhǔn)于1999年首次發(fā)布為WS/T 1871999，本次為第一次修訂。放射工作人員職業(yè)健康檢查外周血淋巴細(xì)胞微核檢測(cè)方法與受照劑量估算標(biāo)準(zhǔn)1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了放射工作人員職業(yè)健康檢查和受照劑量估算中，外周血

6、淋巴細(xì)胞微核的標(biāo)本制備、微核檢測(cè)、結(jié)果評(píng)價(jià)、劑量估算方法和質(zhì)量控制。本標(biāo)準(zhǔn)適用于放射工作人員職業(yè)健康檢查微核檢測(cè)和急性全身外照射受照人員的劑量估算。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本標(biāo)準(zhǔn)必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GBZ/T 248 放射工作人員職業(yè)健康檢查外周血淋巴細(xì)胞染色體畸變檢測(cè)與評(píng)價(jià)3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1 生物劑量估算 biological dose estimation用具有穩(wěn)定劑量-效應(yīng)關(guān)系的分子或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化等生物學(xué)指

7、標(biāo)定量估算受照射個(gè)體的輻射吸收劑量的方法。3.2 微核 micronucleus 由于基因組DNA損傷導(dǎo)致細(xì)胞分裂后期滯后的染色體斷片、一個(gè)或多個(gè)染色體不能隨有絲分裂進(jìn)入子細(xì)胞，而在細(xì)胞質(zhì)中形成直徑小于主核的三分之一且完全與主核分開的圓形或橢圓形小核。3.3 常規(guī)培養(yǎng)微核法 routine micronucleus method采用微量全血培養(yǎng)法培養(yǎng)淋巴細(xì)胞，培養(yǎng)結(jié)束后經(jīng)低滲、固定、制片和染色進(jìn)行觀察和分析微核的方法。3.4 胞質(zhì)分裂阻斷微核法 cytokinesis-block micronucleus method CB微核法在培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞完成第一次有絲分裂前，向培養(yǎng)體系中加入松胞素-B

8、，阻滯胞質(zhì)分裂，培養(yǎng)結(jié)束后經(jīng)低滲、固定、制片和染色，只計(jì)數(shù)和分析雙核淋巴細(xì)胞中微核的方法。3.5 微核細(xì)胞 micronucleus cell如采用常規(guī)培養(yǎng)微核法，指胞質(zhì)中含有微核的轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞；如采用CB微核法，指胞質(zhì)中含有微核的雙核淋巴細(xì)胞。3.6 微核率 micronucleus frequency如采用常規(guī)培養(yǎng)微核法，指每1000個(gè)轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞中含有的微核數(shù)；如采用CB微核法，指每1000個(gè)雙核淋巴細(xì)胞中含有的微核數(shù)。3.7 劑量-效應(yīng)曲線 dose-effect curve描述生物效應(yīng)依賴于劑量變化方式的曲線。4 標(biāo)本采集與微量全血培養(yǎng)4.1 主要儀器和試劑配制主要儀器和試劑配制參

9、見附錄A。4.2 外周靜脈血采集采集靜脈血約2mL，肝素抗凝，顛倒混勻，靜脈血保存最佳溫度是1824，72h內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。4.3 微量全血培養(yǎng)步驟4.3.1 將采集的靜脈血0.3mL0.5mL加入4mL5mL含植物血凝素和10%20%胎牛血清的洛斯維帕克紀(jì)念研究所-1640（RPMI-1640）培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)容器上編號(hào)并注明培養(yǎng)開始時(shí)間和日期，輕輕搖勻，370.5恒溫培養(yǎng)。4.3.2 如采用常規(guī)培養(yǎng)微核法，培養(yǎng)至68h72h收獲細(xì)胞。4.3.3 如采用胞質(zhì)分裂阻斷微核法，培養(yǎng)至40h44h，加入松胞素-B，使其終濃度為6g/mL，繼續(xù)培養(yǎng)至72h收獲細(xì)胞。5 微核標(biāo)本制備5.1 低滲吸棄培養(yǎng)

10、液上清，搖勻，每管加入4mL 37預(yù)溫的KCl低滲液（常規(guī)培養(yǎng)法低滲液濃度宜為0.075mol/L，CB微核法低滲液濃度宜為0.1mol/L），輕輕吹打均勻，立即加入新配制的固定液0.5mL1mL（甲醇：冰醋酸體積比3：1），混勻，移至10mL15mL離心管中，水平離心機(jī)離心8min10min，離心力為200g250g。5.2 固定棄上清，搖勻，加入4.5mL固定液，固定20min30 min，水平離心機(jī)離心8min10min，離心力為200g250g。離心后可用固定液洗滌細(xì)胞，以減少細(xì)胞懸液中的雜質(zhì)。5.3 制片棄上清，視細(xì)胞數(shù)量酌情加入固定液數(shù)滴，充分混勻，將細(xì)胞懸液均勻滴在潔凈干燥載玻片

11、上，室溫干燥。5.4 編號(hào)對(duì)每一張微核標(biāo)本玻片進(jìn)行編號(hào)，并做好記錄。5.5 染色用體積比為8%10%的瑞氏-吉姆薩染液或吉姆薩染液染色8min10min，輕輕沖洗，室溫干燥。6 微核分析6.1 閱片盲法閱片。按顯微鏡載物臺(tái)刻度坐標(biāo)，從右至左逐列或逐行對(duì)每張微核標(biāo)本玻片進(jìn)行掃描式閱片，常規(guī)培養(yǎng)微核法尋找轉(zhuǎn)化的單核淋巴細(xì)胞，如果采用CB微核法，即尋找雙核淋巴細(xì)胞，對(duì)每位受檢者至少分析1000個(gè)轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞。6.2 雙核淋巴細(xì)胞的判定標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞應(yīng)為雙核細(xì)胞，同一個(gè)雙核細(xì)胞中的兩個(gè)細(xì)胞核應(yīng)具有各自完整的核膜，并位于相同的細(xì)胞質(zhì)邊界內(nèi)，兩個(gè)細(xì)胞核大小、質(zhì)感和染色強(qiáng)度應(yīng)大致相等，兩個(gè)細(xì)胞核完全分離，或者可由

12、一個(gè)或多個(gè)核質(zhì)橋連接，核質(zhì)橋不超過核直徑的1/4，兩個(gè)細(xì)胞核重疊時(shí)，應(yīng)看到各自的完整核膜。雙核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)邊界或細(xì)胞膜應(yīng)完整，并與相鄰細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)邊界明顯區(qū)分。6.3 微核的判定標(biāo)準(zhǔn)微核應(yīng)游離于胞質(zhì)中，與主核完全分開，直徑為主核的1/161/3，與主核不連接，不重疊（重疊或相切時(shí)，應(yīng)看到各自的完整核膜），無折光性，與染料顆粒等雜質(zhì)相區(qū)別，著色深淺與主核相同或略淺。6.4 分析和記錄常規(guī)培養(yǎng)微核法觀察轉(zhuǎn)化的單核淋巴細(xì)胞，CB微核法觀察雙核淋巴細(xì)胞，如發(fā)現(xiàn)微核，應(yīng)在微核分析記錄表中記錄顯微鏡坐標(biāo)，有條件的機(jī)構(gòu)可拍照，在微核分析記錄表中記錄圖片文件名，以備復(fù)核。微核分析記錄表樣式參見附錄B。7 檢測(cè)

13、結(jié)果判斷7.1 常規(guī)培養(yǎng)法微核率的正常參考值范圍06；CB法微核率的正常參考值范圍030。7.2 對(duì)檢測(cè)結(jié)果超出正常參考值范圍者，可檢查外周血淋巴細(xì)胞染色體畸變。8 檢測(cè)報(bào)告與歸檔8.1 對(duì)每位受檢者應(yīng)出具外周血微核檢測(cè)報(bào)告單。檢測(cè)報(bào)告單樣式參見附錄B。8.2 檢測(cè)的微核標(biāo)本應(yīng)保存兩年。微核記錄表等原始資料應(yīng)建檔長(zhǎng)期保存，并建立電子檔案。9 劑量-效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立9.1 樣品要求采血前須獲取志愿者的知情同意。志愿者2名4名健康成年人，非放射工作者，男女各半，年齡在18歲60歲，無煙酒嗜好，半年內(nèi)無急慢性疾病史、無射線和化學(xué)毒物接觸史，近一個(gè)月內(nèi)無病毒感染史。抽取靜脈血6mL8mL，注入肝素抗

14、凝管。9.2 照射、培養(yǎng)和分析9.2.1 應(yīng)提供可靠的、明確的照射樣品的物理劑量。受照樣品應(yīng)與照射源保持一定的距離以達(dá)到均勻照射的目的。有條件的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立包括不同輻射類型(如X射線、射線、中子)、不同劑量率(低LET輻射)的劑量-效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)于低LET輻射，劑量范圍選擇0.25 Gy5.0Gy，劑量率介于0.3Gy/min1.OGy/min之間，選擇不少于8個(gè)劑量點(diǎn)，其中，0.25 Gy1.0Gy范圍內(nèi)刻度曲線的劑量點(diǎn)不少于4個(gè)。劑量點(diǎn)可選擇0.25 Gy、0.5 Gy、0.75 Gy、1.0 Gy、2.0 Gy、3.0 Gy、4.0 Gy和5.0 Gy。對(duì)于高LET輻射，劑量范圍選擇0

15、.05 Gy3.0Gy，劑量點(diǎn)可選擇0.05 Gy、0.1 Gy、0.5 Gy、1.0 Gy、1.5 Gy、2.0 Gy、2.5 Gy和3.0 Gy。9.2.2 培養(yǎng)方法同本標(biāo)準(zhǔn)第4章。9.2.3 微核標(biāo)本制備、分析和記錄按照本標(biāo)準(zhǔn)第5章和第6章中所述方法進(jìn)行。9.2.4 按照公式（1）計(jì)算各劑量點(diǎn)應(yīng)分析的細(xì)胞數(shù)。n=1-p96.04p()式中：n應(yīng)分析的細(xì)胞數(shù)；p微核率，可在計(jì)數(shù)分析一定數(shù)量的細(xì)胞后求得。9.3 劑量-效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合對(duì)X或射線誘導(dǎo)的微核與受照射劑量之間的劑量-效應(yīng)關(guān)系以擬合一次方程或二次多項(xiàng)式為宜，按照公式（2）或公式（3）進(jìn)行擬合。a) 一次方程模式y(tǒng)=a+bD（2）式中

16、：y微核率（）；a本底微核率；b回歸系數(shù)；D吸收劑量，單位為戈瑞（Gy）。b) 二次多項(xiàng)式模式y(tǒng)=a+bD+cD2（3）式中：y微核率（）；a本底微核率；b回歸系數(shù)；D吸收劑量，單位為戈瑞（Gy）；c回歸系數(shù)。10 劑量估算10.1 微核標(biāo)本的制備所要估算劑量樣品的微核標(biāo)本制備方法均應(yīng)與建立劑量-效應(yīng)曲線的方法相同。10.2 微核率、微核率的不確定度的計(jì)算當(dāng)觀察細(xì)胞數(shù)足夠多時(shí)（一般要求1000），微核檢測(cè)值符合泊松分布，微核率和微核率的不確定度分別按照公式（4）和公式（5）計(jì)算：p=xn1000（4）式中：p微核率（）；x檢測(cè)到的微核數(shù)；n觀察的細(xì)胞數(shù)。up=pn1000（5）式中：u(p)微

17、核率的不確定度（）；p微核率（）；n觀察的細(xì)胞數(shù)。10.3 微核率的置信限計(jì)算置信水平為95%時(shí)，微核率的置信限按照公式（6）計(jì)算：95%置信水平微核率的置信限=p1.96up（6）式中：p微核率（）；up微核率的不確定度（）。當(dāng)置信限下限0時(shí)，覆蓋區(qū)間下限默認(rèn)為0。10.4 受照劑量的估算將所要估算劑量的標(biāo)本中得到的微核率及95%置信限的上下限代入建立的劑量-效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，估算出受照劑量。放射事故受照人員生物劑量估算示例參見附錄C。11 質(zhì)量控制11.1 進(jìn)行微核標(biāo)本制備與分析的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有2名（含）以上專業(yè)技術(shù)人員，掌握電離輻射生物效應(yīng)和細(xì)胞遺傳學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)，熟練掌握顯微鏡下微核分析技術(shù)。每個(gè)

18、微核需2名專業(yè)技術(shù)人員相互確認(rèn)。11.2 標(biāo)本應(yīng)有唯一性編號(hào)，標(biāo)本分析完畢后，應(yīng)置于玻片盒內(nèi)保存，并做好記錄。11.3 分析細(xì)胞數(shù)應(yīng)滿足本標(biāo)準(zhǔn)第6.1條的要求。12 CB微核法估算劑量的原則12.1 事故后應(yīng)盡早取血，不宜超過4周。12.2 培養(yǎng)條件、制片方法和微核的判斷標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)與建立劑量-效應(yīng)曲線時(shí)相同。對(duì)估算劑量的個(gè)體，至少應(yīng)分析500個(gè)以上的雙核淋巴細(xì)胞。對(duì)受照劑量較大的個(gè)體，如達(dá)不到上述細(xì)胞數(shù)，可全片計(jì)數(shù)所有雙核淋巴細(xì)胞。12.3 應(yīng)選擇和事故條件接近的刻度曲線進(jìn)行劑量估算，在曲線劑量范圍內(nèi)應(yīng)用，不得外推。12.4 估算劑量時(shí)，除給出平均值以外，同時(shí)給出劑量的95%置信限。AA附錄A （

19、規(guī)范性）主要儀器設(shè)備和試劑配制A.1 主要儀器設(shè)備A.1.1 超凈工作臺(tái)：用于細(xì)胞接種。A.1.2 恒溫培養(yǎng)箱：用于細(xì)胞培養(yǎng)。A.1.3 普通水平式離心機(jī)：用于細(xì)胞分離。A.1.4 光學(xué)顯微鏡：帶坐標(biāo)刻度，用于細(xì)胞觀察。A.1.5 冰箱：至少具備-20和4條件，用于儲(chǔ)存實(shí)驗(yàn)用試劑。A.1.6 水浴鍋：用于細(xì)胞低滲。A.1.7 通風(fēng)櫥或通風(fēng)柜：用于實(shí)驗(yàn)中的排風(fēng)。A.2 主要試劑的配制A.2.1 RPMI-1640培養(yǎng)基、低滲液、固定液、磷酸鹽緩沖液和吉姆薩染液的配制參照GBZ/T 248的規(guī)定。A.2.2 松胞素-B儲(chǔ)存液：松胞素-B的分子式為C29H37NO5，不溶于水，易溶于二甲基亞砜，在培

20、養(yǎng)體系中適宜的濃度可以抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和胞質(zhì)分裂，而不影響胞核分裂。將松胞素-B溶于二甲基亞砜中，濃度為2mg/mL，-20儲(chǔ)存，用前融化，生理鹽水稀釋，加入培養(yǎng)體系后的終濃度為6g/mL。BB附錄B （資料性）微核分析記錄表和微核檢測(cè)報(bào)告單B.1 微核分析記錄表微核分析記錄表（樣式）見表B.1。表B.1 微核分析記錄表（樣式）顯微鏡編號(hào)： 第 頁，共 頁 檢測(cè)方法： 常規(guī)培養(yǎng)微核法 胞質(zhì)分裂阻斷微核法編號(hào)姓名分析細(xì)胞數(shù)微核坐標(biāo)或圖像文件名分析日期檢測(cè)單位： 分析人： 復(fù)核人： 檢測(cè)日期： 年 月 日 復(fù)核日期： 年 月 日填表說明：發(fā)現(xiàn)微核后需填寫微核細(xì)胞所在的橫縱坐標(biāo)刻度值和微核數(shù)量（如：6.

21、6/136.5,1?！?.6/136.5”為坐標(biāo)值，“1”為微核數(shù) ）。有圖像采集設(shè)備的機(jī)構(gòu)，可代之以圖片保存的文件名（命名格式：受檢者姓名+圖片編號(hào)，微核數(shù)。如：張三001,1），以便復(fù)核。B.2 微核檢測(cè)報(bào)告單微核檢測(cè)報(bào)告單（樣式）見表B.2。表B.2 微核檢測(cè)報(bào)告單（樣式）編號(hào)姓名性別 年齡周歲工種工齡檢測(cè)方法： 常規(guī)培養(yǎng)微核法 胞質(zhì)分裂阻斷微核法結(jié)果：微核數(shù)量： 個(gè)。微核率（）： 。結(jié)果評(píng)價(jià)：檢測(cè)單位： 分析人： 復(fù)核人： 檢測(cè)日期： 年 月 日 復(fù)核日期： 年 月 日CC附錄C （資料性）放射事故受照人員生物劑量估算應(yīng)用示例某人受60Co 射線一次全身照射，照后48h內(nèi)取血，采用微量

22、全血法培養(yǎng)淋巴細(xì)胞,分析800個(gè)雙核淋巴細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)微核514個(gè)，估算其生物劑量。每細(xì)胞微核數(shù)為0.64251000=642.5，微核率的不確定度為514/8001000=28.3。微核率的95%置信限為642.51.9628.3，即587.0698.0。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室所建立的60Co 射線照射離體血建立的CB微核劑量-效應(yīng)曲線：Y = 17.9119+33.383D+42.8809D2，該曲線的劑量范圍為0.1Gy5.0Gy，劑量率為0.38Gy/min，Y為微核率（），D為劑量（Gy）。將642.5、587.0和698.0分別代入Y項(xiàng)，解方程后求出平均劑量為3.45Gy，下限為3.27Gy，上限為3.61 Gy，估算劑量結(jié)果均值為3.45Gy，95%置信水平的劑量范圍為：3.27Gy3.61 Gy。DD附錄D （規(guī)范性）正確使用本標(biāo)準(zhǔn)的說明D.1 本標(biāo)