DNA提取方法和試劑作用詳解_第1頁
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文檔簡介

1、1試劑的作用氯仿的作用?氯仿:克服酚的缺點(diǎn);加速有機(jī)相與液相分層。最后用氯仿抽提:去除核酸溶液中的跡量酚。(酚易溶于氯仿中)用酚-氯仿抽提細(xì)胞基因組DNA時(shí),通常要在酚-氯仿中加少許異戊醇,為什么?異戊醇:減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力,從而減少氣泡產(chǎn)生。另外,異戊醇有助于分相,使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。用乙醇沉淀DNA時(shí),為什么加入單價(jià)的陽離子?用乙醇沉淀DNA時(shí),通常要在溶液中加入單價(jià)的陽離子,如NaCl或NaAcNa+中和DNA分子上的負(fù)電荷,減少DNA分子之間的同性電荷相斥力,而易于聚集沉淀。2DNA提取分為三個(gè)

2、基本步驟每個(gè)步驟的具體方法可根據(jù)樣品種類、影響提取的物質(zhì)以及后續(xù)步驟的不同而有區(qū)別。.細(xì)胞的破碎細(xì)菌有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁,首先要破碎經(jīng)胞。方法有三種;機(jī)械方法:超聲波處理法、研磨法、勻漿法;化學(xué)試劑法:用SDS處理細(xì)胞;酶解法:加入溶菌酶或蝸牛酶,都可使細(xì)胞壁破碎。利用研磨或者超聲破碎細(xì)胞,并通過加入去污劑以除掉膜脂。加入蛋白酶,醋酸鹽沉淀,或者酚/氯仿抽提,以除掉細(xì)胞內(nèi)的蛋白,如與DNA結(jié)合的組蛋白。將DNA在冷乙醇或異丙醇中沉淀,因?yàn)镈NA在醇中不可溶而黏在一起,這一步也能除掉鹽分。另外,目前也有利用吸附過柱的方法提取DNA的商業(yè)化試劑盒。A. DNA提取的幾種方法(1).濃鹽法利用RNA和DN

3、A在電解溶液中溶解度不同,將二者分離,常用的方法是用1M氯納抽提,得到的DNA粘液與含有少量蛋白質(zhì)氯仿一起搖蕩,使乳化,再離心除去蛋白質(zhì),此時(shí)蛋白質(zhì)凝膠停留在水相及氯仿相中間,而DNA位于上層水相中,用2倍體積95%乙醇可將DNA鈉鹽沉淀出來.B. 也可用0.15MNaCL液反復(fù)洗滌細(xì)胞破碎液除去RNA再以IMNaCL提取脫氧核糖蛋白,再按氯仿-異醇法除去蛋白.兩種方法比較,后種方法使核酸降解可能少一些.C. 以稀鹽酸溶液提取DNA時(shí),加入適量去污劑,如SDS可有助于蛋白質(zhì)與DNA的分離。在提取過程中為抑制組織中的DNase對DNA的降解作用,在氯化鈉溶液中加入檸檬酸鈉作為金屬離子的烙合劑通常

4、用.15MNaCL,0.015M檸檬鈉,并稱SSC溶液,提取DNA.(2)陰離子去污劑法;用SDS或二甲苯酸鈉等去污劑使蛋白質(zhì)變性,可以直接從生物材料中提取DNA由于細(xì)胞中DNA與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合,因?yàn)殛庪x子去污劑能夠破壞這種價(jià)鍵,所以常用陰離子去污劑提取DNA(3).苯酚抽提法:苯酚作為蛋白變性劑,同時(shí)抑制了DNase的降解作用.用苯酚處理勻漿液時(shí),由于蛋白與DNA聯(lián)結(jié)鍵已斷,蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相。離心分層后取出水層,多次重復(fù)操作,再合并含DNA的水相,利用核酸不溶于醇的性質(zhì),用乙醇沉淀DNA。此時(shí)DNA是十分粘稠

5、的物質(zhì),可用玻璃漫漫繞成一團(tuán),取出。此法的特點(diǎn)是使提取的DNA保持天然狀態(tài)(4).水抽提法:利用核酸溶解于水的性質(zhì),將組織細(xì)胞破碎后,用低鹽溶液除去RNA然后將沉淀溶于水中,使DNA充分溶解于水中,離心后收集上清液.在上清中加入固體氯化鈉調(diào)節(jié)至2.6M.加入2倍體積95%乙醇,立即用攪拌法攪出.然后分別用66%,80%和95%乙醇以及丙銅洗滌,最后在空氣中干燥,既得DNA樣品.此法提取的DNA中蛋白質(zhì)含量較高,故一般不用.為除蛋白可將此法加以改良,在提取過程中加入SDS.1.動(dòng)物來源的DNA的提取1.1經(jīng)典提取方法酚抽提法、異丙醇沉淀法以及甲酞胺裂解法是提取DNA最為經(jīng)典的方法,目前很多方法的

6、改進(jìn)都是在這些方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行的,這三種方法均利用蛋白酶K和十二烷基硫酸鈉(SDS)消化破碎細(xì)胞。在前兩種方法中裂解液先用酚/氯仿去除蛋白質(zhì),再分別用乙醇或異丙醇沉淀DNA。甲酞胺法是利用高濃度的甲酞胺解聚蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合,然后利用透析來處理DNA樣品。這些經(jīng)典方法獲得的DNA純度很高,能夠滿足各種試驗(yàn)的要求,但操作繁瑣,用時(shí)長,且所用試劑具有一定的毒性。玻璃棒纏繞法該法用鹽酸肌裂解細(xì)胞,然后將細(xì)胞裂解物小心鋪在離心管中的乙醇上,用一個(gè)帶鉤的或前端為U形的玻璃棒在這兩層液體的交界面慢慢攪動(dòng),沉淀出的膠狀DNA纏繞在玻璃棒上。玻璃棒上的DNA經(jīng)多次乙醇浸泡并于室溫下蒸干乙醇,由膠狀逐漸回縮,

7、然后浸人TE中過夜,使其重新吸水膨脹進(jìn)而和玻璃棒分離。這種方法對操作技術(shù)要求較高,但簡單快速。血細(xì)胞DNA的快速提取法采用非離子變性劑NP40(乙基苯基聚乙二醇)代替SDS裂解細(xì)胞,提取細(xì)胞核,然后用酚/氯仿抽提DNA。這樣從血液中分離獲得的DNA純度高,能夠滿足各種臨床檢驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)的需要。也可采用NP40和Tween-20同時(shí)作用破碎細(xì)胞膜,以避免SDS對以后步驟的負(fù)面作用。Basuni等采用了4種常用的從血液中提取DNA的方法:HighPureViralNucleic試劑盒法、QlAamp試劑盒法、Tri-PureTM試劑分離提取法以及經(jīng)典酚抽提法,對通常作拋棄處理的血凝塊進(jìn)行人DNA及病毒

8、DNA的抽提,發(fā)現(xiàn)前兩種方法可以迅速高效獲得目的DNA,從而建立了由血凝塊中提取DNA的方法,擴(kuò)大了臨床檢驗(yàn)樣本的來源。1.4玻璃顆粒吸附法在該法中首先利用含異硫氰酸肌的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞,然后加人含有能夠與DNA結(jié)合的玻璃顆粒的緩沖液,經(jīng)沉淀收集結(jié)合染色體DNA的玻璃顆粒,利用洗脫液進(jìn)行洗脫獲得DNA。不僅玻璃顆??梢耘cDNA進(jìn)行結(jié)合,一定大小的硅膠顆粒也可以與DNA進(jìn)行結(jié)合,據(jù)此,不少實(shí)驗(yàn)工作者實(shí)踐了很多利用顆粒結(jié)合DNA的提取方法。Pichler等2在從抹香鯨(Physetermacrocephalus)牙齒及骨骼中抽提DNA時(shí)采用了一種以二氧化硅為吸附介質(zhì)的方法,從抹香鯨標(biāo)本骨骼組織中

9、鉆取的少量粉末中獲得了足夠用于分析的DNA產(chǎn)物,此方法擴(kuò)大了對稀有哺乳動(dòng)物DNA研究的取材范圍。Caldarelli-stefano等3在從福爾馬林固定、石蠟包埋的人體組織標(biāo)本中提取DNA時(shí)利用小磁珠作為結(jié)合核,也獲得了理想的純化DNA。很多試劑公司也依此設(shè)計(jì)生產(chǎn)了許多顆粒提取試劑盒,Pint。等4就探討了采用Gibc。公司的GlassMAX系統(tǒng),對福爾馬林固定的組織進(jìn)行DNA提取的具體操作方法,目前這些試劑盒在臨床上廣為應(yīng)用,省時(shí)省力。1.5三乙醇胺月桂基硫酸鹽(TLS)法由于常規(guī)方法中使用的蛋白酶K的水解條件不好掌握,采用TLS來提取組織、細(xì)胞以及外周血DNA可以克服這一弊端。TLS是一種

10、較強(qiáng)的表面活性劑,將其直接作用于細(xì)胞或組織勻漿,可迅速溶解細(xì)胞膜、核膜,而且蛋白質(zhì)與其結(jié)合后即失去對DNA的結(jié)合,進(jìn)一步的純化可采用常規(guī)方法。1.6臨床病理標(biāo)本的DNA提取方法由于PCR技術(shù)不僅可用于基因分離、核酸序列分析,還可用于突變體和重組體的構(gòu)建、基因表達(dá)調(diào)控研究、基因病的診斷及腫瘤發(fā)生機(jī)理的探討等。近年來,PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于病理學(xué)研究,尤其對福爾馬林固定石蠟包埋病理標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)的研究更成為關(guān)注的焦點(diǎn)。對于從這些病理標(biāo)本中提取DNA的方法研究也很多。一般采用酚/氯仿抽提法,該法雖然效率較高,但費(fèi)時(shí)費(fèi)力,而且其操作中要求多次離心,增加了樣品污染的可能性。近年來很多高效靈敏的方法在實(shí)踐中

11、得以采用,這些方法通常采用加熱或微波法S去除包埋的石蠟,使用SephadexG-5。柱色譜或鹽析法s7等去除蛋白質(zhì)。高文濤71等在研究福爾馬林固定石蠟包埋組織DNA提取方法對PCR的影響時(shí),發(fā)現(xiàn)在組織切片中加人鰲合樹脂(ChelatingResin,亞氨基二乙酸)提取獲得的DNA可取得較好的PCR擴(kuò)增結(jié)果。Coombs等s則采用熱循環(huán)方法,將標(biāo)本上的蠟融人樣品溶液,在酶的作用下進(jìn)行裂解,然后用Chelex-100進(jìn)行吸附,離心去蠟,這種方法安全、簡便、有效、經(jīng)濟(jì)。1.7鹽析法該法用飽和氯化鈉代替有機(jī)溶劑去除蛋白質(zhì),所獲得的DNA質(zhì)量可以滿足PCR模板的要求,但產(chǎn)率相對較低,純度較差。譚建明等9

12、對上述鹽析法進(jìn)行了改進(jìn),即將處理過的樣本加人SDS和蛋白酶K后,在56'C消化1h,然后用飽和氯化鈉沉淀蛋白質(zhì),并經(jīng)離心除去,上清直接用乙醇沉淀DNA。該法簡化了DNA的抽提步驟,可用于人體各種樣本DNA的提取,所獲DNA的純度可以滿足各種檢測的需要。2植物來源的DNA提取利用基因工程手段對植物進(jìn)行定向改造,已成為當(dāng)今植物育種學(xué)發(fā)展的一個(gè)新領(lǐng)域,植物基因工程操作離不開植物基因組總DNA的制備,不同植物的核酸結(jié)合蛋白的情況各不相同,因而要采取不同的提取方法10。由于植物中次生代謝產(chǎn)物多酚類化合物可介導(dǎo)DNA降解,而多糖的污染也是影響植物DNA純度最常見的問題,這些多糖能抑制限制酶、連接酶

13、及DNA聚合酶等酶類的生物活性。因此要從富含多酚和多糖的植物組織中分離獲得高質(zhì)量的基因組DNA也并非易事111。目前采用的方法有以下幾種。2.1十六烷基三乙基澳化按(CTAB)法CTAB是一種陽離子去污劑,它能與核酸形成復(fù)合物,這些復(fù)合物在低鹽溶液中會(huì)因溶解度的降低而沉淀,而在高鹽溶液中可解離,從而使DNA和多糖分開,再用乙醇沉淀DNA而除去CTAB。在該法中使用的聚維酮(PVP)與多酚結(jié)合形成復(fù)合物,從而可有效避免多酚類化合物介導(dǎo)的DNA降解121。王卓偉等13在對桑葉DNA提取方法研究過程中發(fā)現(xiàn)PVI還能有效地去除多糖。羅志勇等14在研究中對這種方法進(jìn)行了幾點(diǎn)改進(jìn):提高CTAB的濃度;對于

14、含多酚類較多的植物,增加CTAB提取緩沖液中琉基乙醇的含量,同時(shí)加人PVP使其與多酚類物質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物;增加低鹽沉淀緩沖液的量;增加高鹽溶液中鹽的濃度。用改進(jìn)的方法從人參、西洋參、三七等藥用植物中分離獲得了高純度的DNA,使DNA在高鹽緩沖條件下優(yōu)先沉淀,可更有效地除去多糖。Stein等16對傳統(tǒng)的CTAB法進(jìn)行了優(yōu)化,創(chuàng)建了一種從新鮮草本植物樣本中提取DNA的方法。首先在特制的有96個(gè)孔的托盤上種植植物樣本,并依照不同樣本在托盤中的位置進(jìn)行編號(hào),然后取適量植物葉子分裝在充滿提取液的塑料袋中,除去袋中的空氣并封口,再用特制的手工勻化器將各袋中的樣本混勻,56'C孵育1h后將袋中的液體

15、取出進(jìn)行離心以及DNA的沉淀。Xin等17則采用簡易的96孔托盤作為提取時(shí)的容器,將多種植物樣本經(jīng)研磨處理后分別放在不同的孔中進(jìn)行提取,在一天內(nèi)由一人就可完成上千個(gè)樣本的DNA提取,為高通量植物基因分析及篩選提供了極大的便利。SDS法為了避免CTAB法試驗(yàn)步驟多、操作繁瑣的不足之處,近年來又提出了利用SDSTris-Cl-EDTA等直接裂解細(xì)胞使其釋放出DNA的方法。在該法后續(xù)的DNA純化過程中通常采用酚/氯仿處理,但對于植物DNA純化不是一個(gè)很好的選擇,因?yàn)榉拥氖褂每山档虳NA的提取效率和純度。在用該法提取DNA的過程中采用較大的離心力和較長的離心時(shí)間,然后用氯仿一異戊醇代替酚來去除變性蛋白

16、質(zhì),從而克服了由于酚的摻人及殘留對以后酶切帶來的困難。用琉基乙醇代替SDS,對大豆DNA分離提取能夠更有效地去除蛋白質(zhì),而且可以有效防止褐變,獲得天然雙鏈高分子量的DNA產(chǎn)物,并且減少了SDS對PCR、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)(RandomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)等操作的影響。在對辣椒DNA進(jìn)行提取時(shí)為了提高DNA的產(chǎn)率將待提取的植物材料首先在液氮中研磨成粉末,并且針對辣椒葉子中多酚類物質(zhì)極少的特點(diǎn)將其中的加人PVP的步驟省去,消除了PVP對以后操作的影響.氯化千法在對稱猴桃的基因組DNA提取過程中選用了氯化節(jié)法,與其他方法相比該法的得率較高,其原因可能是氯化

17、節(jié)不僅可與植物細(xì)胞壁上的多糖經(jīng)基反應(yīng)生成醚,而且與細(xì)胞液中多糖物質(zhì)的All基反應(yīng),起到破壞糖鏈的作用,利于DNA的釋放和提純。高鹽低pH法該法中所用的提純試劑僅為無機(jī)鹽和異丙醇。通常采用的無機(jī)鹽為醋酸鉀,低pH的醋酸鉀是有效的蛋白質(zhì)沉淀劑。與一般氯仿一異丙醇反復(fù)抽提去除蛋白質(zhì)的操作相比該法操作更方便省時(shí),所需樣品量少,適用于瀕危植物DNA的提取。果膠酶法Steven等2s采用果膠酶對植物細(xì)胞破碎后的抽提混合物進(jìn)行消化處理使與DNA共沉淀的膠狀物質(zhì)分解成小的片段,從而無法與DNA一起沉淀下來,降低了DNA的純化難度,提高純化效率。3微生物來源DNA的提取常規(guī)的微生物DNA提取多是根據(jù)某種微生物的

18、具體特點(diǎn)選擇合適的方法。在實(shí)際的科學(xué)研究過程中,很多科學(xué)工作者通過實(shí)踐總結(jié)出許多快速實(shí)用的提取方法,現(xiàn)擇其中比較典型的加以總結(jié)。3.1 細(xì)菌質(zhì)粒的提取方法質(zhì)粒是獨(dú)立于細(xì)菌染色體DNA之外的環(huán)狀DNA,它能攜帶外源基因進(jìn)人細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增,或表達(dá)外源基因,是基因工程中常用的載體,在DNA重組技術(shù)、DNA測序、轉(zhuǎn)基因等方面具有廣泛的應(yīng)用。對于細(xì)菌質(zhì)粒的提取比較經(jīng)典的方法有:堿裂解法、煮沸法、SDS裂解法以及Triton-溶菌酶裂解法等。這些方法的選擇取決于質(zhì)粒的大小、細(xì)菌菌株的性質(zhì)等。Keunosky等GE_發(fā)展了一種以Zn'+誘導(dǎo)DNA沉淀的方法,在該法中利用一定濃度的ZnCl:溶液使一定體

19、積的細(xì)菌菌液質(zhì)粒DNA大量沉淀,無需多次離心,大大簡化了抽提的步驟。近年來,一些生物技術(shù)公司,比如Promega公司及Qiagen公司等紛紛推出質(zhì)粒抽提試劑盒,這些試劑盒多運(yùn)用樹脂材料或硅膠來特異性的吸附質(zhì)粒DNA,提取過程用時(shí)少,效率高。真菌DNA提取方法對真菌DNA的提取關(guān)鍵是破碎細(xì)胞,通常采取酶解破壁法或以液氮冷凍處理增加細(xì)胞壁脆性的物理破壁法。在這兩種方法中酶解破壁法較為簡單,易于操作和控制,而物理破壁法在處理過程中容易造成細(xì)胞核的大量破損。在提取獲得核酸一蛋白質(zhì)復(fù)合物后,對其中蛋白質(zhì)的沉淀也多采用傳統(tǒng)的氯仿一異戊醇沉淀法或高鹽沉淀法。韓利剛等C25用CTA13法直接從絲狀真菌的新鮮菌

20、絲中提取DNA,并將所提取的DNA進(jìn)行RAPD,得到了較清晰的擴(kuò)增圖譜。Loeffler等Z6為滿足快速靈敏準(zhǔn)確的臨床檢驗(yàn)的需要,利用MagNAPureLC系統(tǒng)建立了一種實(shí)用的快速提取方法,該法自動(dòng)化程度高,避免了可能的交叉污染。Manian等z7在對真菌進(jìn)行DNA抽提時(shí)采用幾個(gè)循環(huán)的快速制冷、煮沸以破碎真菌細(xì)胞壁,并通過Qiagen公司的QIAquickDNA純化柱,迅速從極微量的真菌中獲得高純度的DNA大分子。結(jié)核桿菌DNA的提取方法利用PCR微孔板雜交技術(shù)檢測臨床標(biāo)本中結(jié)核桿菌DNA是診斷結(jié)核桿菌感染的一種快速靈敏和特異的方法。從不同的臨床標(biāo)本中獲得DNA是檢測準(zhǔn)確和成功的關(guān)鍵。而不同來

21、源的結(jié)核桿菌又分別受到不同來源材料的影響,所以提取方法各不相同。同時(shí)由于結(jié)核桿菌的細(xì)胞壁比較厚不易破碎,一般的微波法、異硫氰酸肌法、凍融法等難以破壞結(jié)核桿菌的細(xì)胞壁。通常采取的方法有:經(jīng)典酶一酚一氯仿法,堿一SDS裂解法,堿裂解煮沸法,超聲裂解法,Chelex-100法,玻璃粉一硅吸附法等。楊正林等28通過對以上幾種方法的比較發(fā)現(xiàn)玻璃粉一硅吸附法操作簡單,假陽性低,適合臨床檢測使用。土壤微生物總DNA的提取方法土壤中細(xì)菌的含量豐富,種類齊全,從中提取細(xì)菌DNA可用于檢測不可培養(yǎng)的細(xì)菌,跟蹤某些目標(biāo)菌或重組基因在自然環(huán)境中的行為,也可用來解釋土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)中的基因的多樣性及其隨環(huán)境的變化。從

22、土壤中提取和純化DNA是最關(guān)鍵的技術(shù)之一。Courtoi:等29對比了在土壤中直接裂解微生物體、然后提取DNA和先將微生物菌體通過梯度離心與土壤顆粒分開再進(jìn)行提取的方法,利用PCR技術(shù)以及雜交技術(shù)檢測不同方法獲得DNA的種類和純度,發(fā)現(xiàn)前一種方法具有更高的效率,能夠提取獲得較多微生物物種的DNA。張瑞福等30采用SDS高鹽提取法和透析袋回收法對9種不同來源的土壤進(jìn)行微生物DNA的提取,與通常采用的對菌體細(xì)胞的超聲破碎法以及對粗提DNA的微型柱純化法相比,既保證了一定提取與回收效率,又兼顧了DNA的質(zhì)量,使DNA在提取和純化過程中不會(huì)受到損傷。4海洋生物DNA的提取方法海洋是地球上最大的生物資源

23、庫,同時(shí)由于海水的保護(hù)使海洋生物變化很少,物種得到較好的保存,這樣就為研究生命現(xiàn)象的基本問題提供了豐富的資料。在利用這些資源探討諸如生命的起源、生物進(jìn)化、生物與環(huán)境的關(guān)系、改造海洋生物以為人類服務(wù)(如生產(chǎn)某種藥物)時(shí)離不開對生物核酸的研究。對于海洋來源的動(dòng)物、植物、微生物由于其不同于陸生生物的組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)特點(diǎn)往往采用不同的DNA提取方法。張海琪等31_在對不同方法保存的大黃魚(Pseudosciaenacrocea)肌肉樣品基因組DNA進(jìn)行提取時(shí)發(fā)現(xiàn),經(jīng)福爾馬林、乙醇及含有EDTA的乙醇保存的樣品可以同鮮活樣品和冷凍樣品一樣獲得基因組DNA,但相比之下采用乙醇作為固定劑更方便快速,所提取的D

24、NA用于RAPD分析,獲得了滿意的效果。楊文新等32利用75%的乙醇固定鮑魚(Haliotisdiscus)樣本并進(jìn)行DNA的提取,證明用乙醇固定海洋動(dòng)物組織是一種切實(shí)可行的方法,材料處理后可同步提取,增加了實(shí)驗(yàn)的同步性、可比性,適用于大量樣本的提取。由于組織中含有許多DNA酶,絕大多數(shù)DNA酶需要一個(gè)二價(jià)陽離子作為輔助因子,因此采用含適量EDTA的乙醇固定劑是野外標(biāo)本采集和運(yùn)輸?shù)囊环N更簡便有效的方法。韓兵社等33:針對傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑提取工藝進(jìn)行改進(jìn),應(yīng)用多種萃取液體系從廢棄物魷魚肝臟中提取核酸,與原工藝相比,核酸提取產(chǎn)量提高30%-60%,整體工藝得到簡化,而且避免了有機(jī)物的殘留。赤潮是在特

25、定的環(huán)境前提條件下,海水中的某些浮游生物、原生動(dòng)物或細(xì)菌爆發(fā)性增殖或高度聚集而引起水體變色的一種有害生態(tài)現(xiàn)象,對海洋漁業(yè)、水產(chǎn)資源以及人類的健康造成很大的威脅。發(fā)生赤潮的生物類型主要為藻類,銅綠微囊藻(Microcytisaeruginosa)是造成赤潮的藻類之一。陸源等34丨用乙醇乙醚混合液對純化的銅綠微囊藻作預(yù)處理,破壞了其膠質(zhì)鞘,從而使蛋白酶K和SDS能更好地直接作用于其細(xì)胞壁,細(xì)胞內(nèi)的DNA釋放完全,提高了總DNA的得率。通過提取獲得的DNA有助于開展對有害藻類的研究,為防范赤潮提供依據(jù)。在對紫菜(Porphyrasp.)進(jìn)行DNA提取時(shí),郭寶太等35先用海螺酶處理樣品制備紫菜體細(xì)胞,

26、然后用SDS和蛋白酶K裂解細(xì)胞提取總DNA,再用WizardDNAclean-up;樹脂進(jìn)行純化。經(jīng)海螺酶處理的紫菜細(xì)胞解決了通常采用的液氮破碎細(xì)胞后裂解物勃稠、DNA得率低且有嚴(yán)重的多糖污染等難題。但這種方法對植物組織需求量較多,不適于個(gè)體體積小的紫菜。劉必謙等36采用美國Roche公司的DNAIsolationKitforCellandTissue和上海生工公司的UNIQ-10小量柱式基因組DNA提取試劑盒對個(gè)體體積較小的圓紫菜(Porphyrasuborbiculato)、鐵釘菜(Ishigeokamurae)等進(jìn)行DNA的提取,獲得高純度的基因組DNA,完全能滿足酶切片段長度多態(tài)性(A

27、mplifiedFragmentLengthPolymorphism,AFLP)技術(shù)的需要。陳子桂等371以海洋尾絲蟲(Uronemamarinum)為材料,針對纖毛蟲難以建立培養(yǎng)以及個(gè)體豐度不高等特點(diǎn),就微量條件下提取DNA的方法進(jìn)行了探討,成功地獲得了活體直接提取、活體酚/氯仿抽提、固定標(biāo)本直接提取以及固定標(biāo)本酚/氯仿抽提等四種簡便有效的微量DNA提取方法,解決了纖毛蟲微量DNA提取的困難。綜合DNA的提取方法,雖然不同生物DNA的提取方法不盡相同,但各種提取方法也有很多相通之處,可以相互借鑒。隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展,對這一技術(shù)的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)將會(huì)越來越多,一些生物領(lǐng)域新的DNA提取方法也將逐漸

28、固定下來,更為簡捷、高效的方法也必將出現(xiàn),為基因工程提供更高純度的DNA.CTAB法原理(植物DNA提取經(jīng)典方法)CTAB(hexadecvltrimethylammoniumbromide十六烷基三甲基澡化錢).是一種陽離子去污劑,可溶解細(xì)胞膜,并與核酸形成復(fù)合物。該復(fù)合物在高鹽溶液中(07mol/LNaCI)是可溶的.通過右機(jī)溶劑抽提,去除蛋白、弟枷、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇或界內(nèi)醉沉淀即可使核酸分離出來。注:CTAB溶滋右低于15匸時(shí)會(huì)形成沉淀析出.因此右將貝加入冰冷的植物材料乙前必須預(yù)熱.離心時(shí)溫度不要低于15C除蛋白質(zhì):氯仿/異戊醉抽提(氯仿可使蚩門質(zhì)變性并有助于液相與右機(jī)宅相的分離:異戊醉則有助f消除抽提過程中出現(xiàn)的氣泡)。使用變性劑變性(SDS、異

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