組定稿的學(xué)位和答辯博士

1、Britton Chance Center for Biomedical Photonics - -分泌酶活性及其二聚化的動分泌酶活性及其二聚化的動態(tài)光學(xué)成像研究態(tài)光學(xué)成像研究 學(xué)位申請人：學(xué)位申請人： 陸陸 錦錦 玲玲學(xué)學(xué) 科科 專專 業(yè)：業(yè)：生物醫(yī)學(xué)工程指指 導(dǎo)導(dǎo) 教教 師：師： 曾紹群 教 授2007911博士學(xué)位論文答辯Briton Chance Center for Biomedical Photonics提綱提綱n研究背景研究背景n研究目的、意義及主要內(nèi)容研究目的、意義及主要內(nèi)容n構(gòu)建用于檢測構(gòu)建用于檢測分泌酶活性的分泌酶活性的FRETFRET探針及探針及其鑒定其鑒定 n活細胞內(nèi)活

2、細胞內(nèi)分泌酶活性的分泌酶活性的FRETFRET成像研究成像研究 n利用受體漂白利用受體漂白FRETFRET技術(shù)研究活細胞內(nèi)技術(shù)研究活細胞內(nèi)分分泌酶的二聚化泌酶的二聚化 n總結(jié)與展望總結(jié)與展望n主要創(chuàng)新點主要創(chuàng)新點n致謝致謝Briton Chance Center for Biomedical Photonics提綱提綱n研究背景研究背景n研究目的、意義及主要內(nèi)容研究目的、意義及主要內(nèi)容n構(gòu)建用于檢測構(gòu)建用于檢測分泌酶活性的分泌酶活性的FRETFRET探針及探針及其鑒定其鑒定 n活細胞內(nèi)活細胞內(nèi)分泌酶活性的分泌酶活性的FRETFRET成像研究成像研究 n利用受體漂白利用受體漂白FRETFRET技

3、術(shù)研究活細胞內(nèi)技術(shù)研究活細胞內(nèi)分分泌酶的二聚化泌酶的二聚化 n總結(jié)與展望總結(jié)與展望n主要創(chuàng)新點主要創(chuàng)新點n致謝致謝Briton Chance Center for Biomedical Photonics阿爾茨海默癥阿爾茨海默癥 (AD)(AD)n阿爾茨海默癥阿爾茨海默癥（AlzheimerAlzheimers Disease, ADs Disease, AD）是）是一種常一種常見中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是老年癡呆的一個主要見中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是老年癡呆的一個主要類型；類型；n臨床表現(xiàn)為記憶喪失、性格改變、認知障礙和功能損臨床表現(xiàn)為記憶喪失、性格改變、認知障礙和功能損害等，后期甚至呈嚴(yán)重

4、癡呆以至植物人狀態(tài)；害等，后期甚至呈嚴(yán)重癡呆以至植物人狀態(tài)；n患病率隨年齡增長而指數(shù)上升，患病率隨年齡增長而指數(shù)上升，6565歲以上發(fā)病率為歲以上發(fā)病率為2%-2%-10%10%，而，而8585歲以上就上升到歲以上就上升到20%-50%20%-50%； n19061906年，年，德國精神病學(xué)家德國精神病學(xué)家Alois AlzheimerAlois Alzheimer首次描述了首次描述了該?。辉摬。籲19661966年，發(fā)現(xiàn)兩個顯著病理特征年，發(fā)現(xiàn)兩個顯著病理特征: :神經(jīng)纖維纏結(jié)和淀粉神經(jīng)纖維纏結(jié)和淀粉樣斑塊沉積。樣斑塊沉積。Briton Chance Center for Biomedica

5、l Photonics C ADAD最顯著的病理特征：最顯著的病理特征：（1 1）淀粉樣斑塊沉積，俗稱老年斑）淀粉樣斑塊沉積，俗稱老年斑( (senile plaques, SP) 1985 1985年發(fā)現(xiàn)，主要成分：年發(fā)現(xiàn)，主要成分：-淀粉樣蛋白（淀粉樣蛋白（AA），淀粉樣前體），淀粉樣前體 蛋白（蛋白（APPAPP）的水解產(chǎn)物）的水解產(chǎn)物（2 2）神經(jīng)纖維纏結(jié)）神經(jīng)纖維纏結(jié)(neuroflibrillary tangles，NFT ) 1985 1985年發(fā)現(xiàn)，主要成分：異常高度磷酸化的微管年發(fā)現(xiàn)，主要成分：異常高度磷酸化的微管tautau蛋白，形蛋白，形 成雙股螺旋微絲成雙股螺旋微絲(P

6、HF)(PHF)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)Westmeyer G. G, Ph.D thesis, 2006 ）Briton Chance Center for Biomedical Photonics老年斑與神經(jīng)纖維纏結(jié)的關(guān)系老年斑與神經(jīng)纖維纏結(jié)的關(guān)系 n淀粉樣蛋白是淀粉樣蛋白是AD的發(fā)生必要條件，的發(fā)生必要條件，AD中中的神經(jīng)纖維纏結(jié)是神經(jīng)元對淀粉樣蛋白的神經(jīng)纖維纏結(jié)是神經(jīng)元對淀粉樣蛋白(A)逐逐漸積累的一種細胞反應(yīng)，是淀粉樣級聯(lián)病理變漸積累的一種細胞反應(yīng)，是淀粉樣級聯(lián)病理變化的一個結(jié)果化的一個結(jié)果;n已有多種證據(jù)證明已有多種證據(jù)證明A的產(chǎn)生積累產(chǎn)生細胞毒性，的產(chǎn)生積累產(chǎn)生細胞毒性，導(dǎo)致導(dǎo)致Tau蛋白磷酸化

7、蛋白磷酸化;n因此，因此，A在在AD的發(fā)病機理中起著十分關(guān)鍵的的發(fā)病機理中起著十分關(guān)鍵的作用，了解作用，了解A的產(chǎn)生以及其在的產(chǎn)生以及其在AD的發(fā)生發(fā)展的發(fā)生發(fā)展中的作用及機制具有重要的意義。中的作用及機制具有重要的意義。Briton Chance Center for Biomedical PhotonicsAA的產(chǎn)生及淀粉樣蛋白假說的產(chǎn)生及淀粉樣蛋白假說nAA是由其前體蛋白是由其前體蛋白淀粉樣前體蛋白淀粉樣前體蛋白(amyloid (amyloid precursor protein, APP)precursor protein, APP)經(jīng)兩種蛋白酶經(jīng)兩種蛋白酶(-(-分泌酶和分泌酶和-

8、分泌酶分泌酶) )依次酶切水解而產(chǎn)生依次酶切水解而產(chǎn)生; ;n淀粉樣蛋白假說（淀粉樣蛋白假說（Amyloid hypothesis） Schenk D., Nature reviews, 2002Briton Chance Center for Biomedical Photonics淀粉樣前體蛋白（淀粉樣前體蛋白（APPAPP）及其水解）及其水解 n主要有三種分泌酶參與主要有三種分泌酶參與APPAPP的水解過程，分別的水解過程，分別稱為稱為、和和分泌酶分泌酶 n分泌酶是一個鋅依分泌酶是一個鋅依賴的金屬蛋白酶。賴的金屬蛋白酶。n-分泌酶是一個蛋白分泌酶是一個蛋白復(fù)合物，其中早老素復(fù)合物，其中早

9、老素（presenilinspresenilins，PSPS）為主要的催化組分為主要的催化組分Selkoe D，Phy.Rev.2001 Esler W. P., Science , 2001nAPPAPP是一個是一個I I型跨膜蛋白。型跨膜蛋白。主要有三個亞型主要有三個亞型APP695APP695、APP751APP751、APP770APP770；nAPPAPP基因有基因有1616種點突變種點突變n早發(fā)性家族早發(fā)性家族ADAD（FADFAD）Briton Chance Center for Biomedical Photonics分泌酶（分泌酶（BACEBACE）n19991999年年,

10、-, -分泌酶的基因被鑒定出來分泌酶的基因被鑒定出來n命名為命名為beta-site APP cleaving enzyme beta-site APP cleaving enzyme （BACEBACE） Fischer F.，J. Neurochemistry, 2002Briton Chance Center for Biomedical PhotonicsADAD的診斷與治療的診斷與治療 nADAD主要通過臨床癥狀觀察和記憶、智力測試等方法進主要通過臨床癥狀觀察和記憶、智力測試等方法進行診斷；確診行診斷；確診ADAD的依據(jù)是神經(jīng)纖維纏結(jié)及老年斑的病的依據(jù)是神經(jīng)纖維纏結(jié)及老年斑的病理學(xué)活

11、檢或尸檢；理學(xué)活檢或尸檢；nADAD治療的藥物：（治療的藥物：（1 1）乙酰膽堿脂酶抑制劑；（）乙酰膽堿脂酶抑制劑；（2 2）腦）腦代謝類藥；（代謝類藥；（3 3）防治）防治ADAD的中藥天然活性成分；的中藥天然活性成分；nADAD治療的新方向：開發(fā)針對治療的新方向：開發(fā)針對AA的各種藥物，包括的各種藥物，包括AA疫苗、針對產(chǎn)生疫苗、針對產(chǎn)生AA的兩個水解酶（的兩個水解酶（-分泌酶和分泌酶和-分分泌酶）的抑制劑、阻止泌酶）的抑制劑、阻止AA聚集的藥物等；聚集的藥物等；n除了除了APPAPP外，調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育的外，調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育的NotchNotch蛋白也是蛋白也是-分泌酶分泌酶的作用底物；的作用底

12、物；n因此，因此，BACEBACE成為了首選的成為了首選的ADAD藥物治療靶標(biāo)。藥物治療靶標(biāo)。Briton Chance Center for Biomedical Photonics本文研究對象：本文研究對象：-分泌酶（分泌酶（BACEBACE）Mudher A., Lovestone S. Trends in neurosciences, 2002Briton Chance Center for Biomedical Photonics研究手段：熒光能量共振轉(zhuǎn)移（研究手段：熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRETFRET）Bastiaens P. I., Trends in cell biology,

13、1999熒光能量共振轉(zhuǎn)移（Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET）是指兩個攜帶不同熒光基團的分子在相互間距離足夠近時(1-10 nm)發(fā)生的能量非放射性地由一個熒光基團向另一個熒光基團轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。FRETFRET原理原理FRETFRET熒光對熒光對Yang.F.,et al.,1996Briton Chance Center for Biomedical PhotonicsFRETFRET的生物學(xué)應(yīng)用的生物學(xué)應(yīng)用Miyawaki A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci., (1999)（1）蛋白質(zhì)的相互作用（2）檢測蛋白

14、酶活性Zhang J. et al. Nat. Rev. Mol. Cell Biol (2002)（3）鈣離子濃度檢測Miyawaki A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci.,2002（4）蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化Miyawaki A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci.,2002Briton Chance Center for Biomedical Photonics提綱提綱n研究背景研究背景n研究目的、意義及主要內(nèi)容研究目的、意義及主要內(nèi)容n構(gòu)建用于檢測構(gòu)建用于檢測分泌酶活性的分泌酶活性的FRETFRET探針及探針及其鑒定其鑒定 n活細胞內(nèi)活細胞

15、內(nèi)分泌酶活性的分泌酶活性的FRETFRET成像研究成像研究 n利用受體漂白利用受體漂白FRETFRET技術(shù)研究活細胞內(nèi)技術(shù)研究活細胞內(nèi)分分泌酶的二聚化泌酶的二聚化 n總結(jié)與展望總結(jié)與展望n主要創(chuàng)新點主要創(chuàng)新點n致謝致謝Briton Chance Center for Biomedical Photonics研究目的、意義及主要內(nèi)容研究目的、意義及主要內(nèi)容n分泌酶在阿爾茨海默癥（分泌酶在阿爾茨海默癥（ADAD）的發(fā)生、發(fā)展中起）的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用，是著重要的作用，是ADAD藥物治療的重要靶點；藥物治療的重要靶點；n發(fā)展檢測發(fā)展檢測分泌酶活性的技術(shù)和對分泌酶活性的技術(shù)和對分泌酶結(jié)構(gòu)分泌酶

16、結(jié)構(gòu)的了解對于藥物的開發(fā)和篩選都具有重要意義；的了解對于藥物的開發(fā)和篩選都具有重要意義；n然而傳統(tǒng)的生化方法難以實現(xiàn)在活細胞生理條件下對然而傳統(tǒng)的生化方法難以實現(xiàn)在活細胞生理條件下對BACEBACE的酶活性和結(jié)構(gòu)的實時動態(tài)研究；的酶活性和結(jié)構(gòu)的實時動態(tài)研究；n本文利用熒光能量共振轉(zhuǎn)移（本文利用熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRETFRET）光學(xué)成像技術(shù)，）光學(xué)成像技術(shù)，結(jié)合基因工程技術(shù)合成的結(jié)合基因工程技術(shù)合成的FRETFRET探針和熒光標(biāo)記蛋白，探針和熒光標(biāo)記蛋白，在活細胞水平檢測了在活細胞水平檢測了BACEBACE的活性及其二聚化結(jié)構(gòu)。的活性及其二聚化結(jié)構(gòu)。Briton Chance Center f

17、or Biomedical Photonics第一章： 緒 論第二章：構(gòu)建用于檢測-分泌酶活性的FRET探針及其鑒定第五章：總結(jié)及展望第三章：活細胞內(nèi)-分泌酶活性的FRET成像研究第四章：利用受體漂白FRET技術(shù)研究活細胞內(nèi)-分泌酶的二聚化論文結(jié)構(gòu)論文結(jié)構(gòu)Briton Chance Center for Biomedical Photonics提綱提綱n研究背景研究背景n研究目的、意義及主要內(nèi)容研究目的、意義及主要內(nèi)容n構(gòu)建用于檢測構(gòu)建用于檢測分泌酶活性的分泌酶活性的FRETFRET探針及探針及其鑒定其鑒定 n活細胞內(nèi)活細胞內(nèi)分泌酶活性的分泌酶活性的FRETFRET成像研究成像研究 n利用受體

18、漂白利用受體漂白FRETFRET技術(shù)研究活細胞內(nèi)技術(shù)研究活細胞內(nèi)分分泌酶的二聚化泌酶的二聚化 n總結(jié)與展望總結(jié)與展望n主要創(chuàng)新點主要創(chuàng)新點n致謝致謝Briton Chance Center for Biomedical Photonics引言引言nBACEBACE是是AA產(chǎn)生的關(guān)鍵酶，被認為是產(chǎn)生的關(guān)鍵酶，被認為是ADAD藥物治療的重要藥物治療的重要靶標(biāo)；靶標(biāo)； n為了篩選為了篩選BACEBACE的抑制劑，已發(fā)展了一些化學(xué)合成探針；的抑制劑，已發(fā)展了一些化學(xué)合成探針；n但是，這些化學(xué)合成的探針無法實現(xiàn)在體研究；但是，這些化學(xué)合成的探針無法實現(xiàn)在體研究；n通過基因工程技術(shù)，構(gòu)建基于通過基因工程技

19、術(shù)，構(gòu)建基于GFPGFP的可遺傳編碼的的可遺傳編碼的FRETFRET探針；探針；n利用熒光光譜掃描和利用熒光光譜掃描和SDSSDSPAGEPAGE對對FRETFRET探針的熒光特性探針的熒光特性和酶切效果進行體外分析，為利用和酶切效果進行體外分析，為利用FRETFRET探針在活細胞探針在活細胞水平檢測水平檢測BACEBACE活性提供依據(jù)。活性提供依據(jù)。 Briton Chance Center for Biomedical PhotonicsNLDAFRETNLDA515nmBACE cleavingBSSFRETFRET探針檢測探針檢測 分泌酶的工作原理分泌酶的工作原理Briton Chan

20、ce Center for Biomedical Photonics技術(shù)流程技術(shù)流程探針的構(gòu)建探針的構(gòu)建質(zhì)粒的鑒定質(zhì)粒的鑒定表達和純化表達和純化光譜特性分析光譜特性分析實時檢測實時檢測BACE活性活性將YFPlinkerCFP構(gòu)建到帶His純化標(biāo)簽的原核表達載體pET28a（）中所構(gòu)建質(zhì)粒通過酶切和測序鑒定將構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，IPTG誘導(dǎo)探針表達，純化利用熒光光譜儀分析探針的熒光特性利用熒光光譜儀及SDSPAGE檢測體外BACE對探針的酶切Briton Chance Center for Biomedical Photonics探針的構(gòu)建探針的構(gòu)建YcC：對照探針YCwt：野生

21、型BSSYCSweS：瑞典突變的短鏈BSSYCSweL：瑞典突變的長鏈BSSYCNFEV：NFEV突變的BSSBSS：BACE substrate site Briton Chance Center for Biomedical Photonics質(zhì)粒鑒定質(zhì)粒鑒定1234Briton Chance Center for Biomedical Photonics探針的表達和純化探針的表達和純化ABCYcCYCwtYCSweSYCSweLYCNFEVBriton Chance Center for Biomedical Photonics光譜特性分析光譜特性分析BACE酶切20 min后的FRET

22、探針的熒光比率值（527/477 nm）變化 FRET探針的熒光光譜，433nm激發(fā) Briton Chance Center for Biomedical Photonics利用利用Y Y C CNFEVNFEV實時檢測實時檢測BACEBACE的活性的活性 SDS-PAGE電泳分析BACE 對YCNFEV的酶切反應(yīng) 利用熒光光譜儀檢測BACE對YCNFEV的酶切反應(yīng)。（A）YCNFEV的熒光光譜隨酶切時間的變化；（B）YCNFEV和YcC的歸一化熒光強度比率(527 nm/477 nm)隨反應(yīng)時間的變化 Briton Chance Center for Biomedical Photonic

23、s利用利用Y Y C CSweLSweL實時檢測實時檢測BACEBACE的活性的活性 利用熒光光譜儀和SDSPAGE電泳檢測YCSweL被BACE的酶切過程 Briton Chance Center for Biomedical Photonics本章小節(jié)本章小節(jié)n通過基因工程技術(shù)構(gòu)建了五個基于通過基因工程技術(shù)構(gòu)建了五個基于GFPGFP的可遺的可遺傳編碼的傳編碼的FRETFRET探針，包括對照探針探針，包括對照探針YcCYcC和和BACEBACE的的FRETFRET探針探針Y Y C Cwtwt、Y Y C CSweSSweS、Y Y C CSweLSweL、Y Y C CNFEVNFEV；n

24、利用熒光光譜掃描和利用熒光光譜掃描和SDSSDSPAGEPAGE凝膠電泳分析凝膠電泳分析比較了五種探針的體外熒光特性和酶切效果；比較了五種探針的體外熒光特性和酶切效果；n選擇選擇Y Y C CSweLSweL用于在活細胞水平下檢測用于在活細胞水平下檢測BACEBACE活性?；钚浴?Briton Chance Center for Biomedical Photonics提綱提綱n研究背景研究背景n研究目的、意義及主要內(nèi)容研究目的、意義及主要內(nèi)容n構(gòu)建用于檢測構(gòu)建用于檢測分泌酶活性的分泌酶活性的FRETFRET探針及探針及其鑒定其鑒定 n活細胞內(nèi)活細胞內(nèi)分泌酶活性的分泌酶活性的FRETFRET成

25、像研究成像研究 n利用受體漂白利用受體漂白FRETFRET技術(shù)研究活細胞內(nèi)技術(shù)研究活細胞內(nèi)分分泌酶的二聚化泌酶的二聚化 n總結(jié)與展望總結(jié)與展望n主要創(chuàng)新點主要創(chuàng)新點n致謝致謝Briton Chance Center for Biomedical Photonics引言引言n雖然化學(xué)雖然化學(xué)FRET探針已經(jīng)被廣泛用于體外檢測探針已經(jīng)被廣泛用于體外檢測BACE的活性，但是這些化學(xué)合成的探針均不的活性，但是這些化學(xué)合成的探針均不能用于活細胞檢測；能用于活細胞檢測； n雖然已經(jīng)清楚雖然已經(jīng)清楚APP水解會產(chǎn)生水解會產(chǎn)生A，但是對于，但是對于A產(chǎn)生的亞細胞區(qū)域還不是很清楚；產(chǎn)生的亞細胞區(qū)域還不是很清楚；

26、n以前以前BACEBACE切割的證據(jù)通過免疫化學(xué)等傳統(tǒng)生化切割的證據(jù)通過免疫化學(xué)等傳統(tǒng)生化方法得到的，無法提供活細胞證據(jù)。方法得到的，無法提供活細胞證據(jù)。 Briton Chance Center for Biomedical Photonics實驗流程實驗流程真核表達探針真核表達探針的構(gòu)建的構(gòu)建探針在動物細探針在動物細胞中的表達胞中的表達活細胞水平檢活細胞水平檢測測BACE酶切酶切檢測檢測BACE在分在分泌途徑的酶切泌途徑的酶切將探針構(gòu)建到真核表達載體pDisplay中，使其能進入分泌途徑并表達在細胞膜上。dYC,displayed YC; dYcC,displayed YcC將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染動物

27、細胞，用共聚焦熒光顯微鏡觀察探針在細胞中的表達將探針質(zhì)粒與BACE共轉(zhuǎn)染HeLa細胞，利用三通道、光譜掃描、受體漂白FRET方法及Western blot方法檢測BACE酶切利用受體漂白FRET方法檢測BACE在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中的酶切Briton Chance Center for Biomedical Photonics真核表達真核表達FRETFRET探針的構(gòu)建探針的構(gòu)建Briton Chance Center for Biomedical PhotonicsFRETFRET探針在動物細胞中的表達探針在動物細胞中的表達 共聚焦成像pDisplay載體中目標(biāo)蛋白的表達 探針表達到細胞表面 B

28、riton Chance Center for Biomedical Photonics利用利用FRETFRET探針檢測活細胞中探針檢測活細胞中BACEBACE的活性的活性 Briton Chance Center for Biomedical Photonics利用受體漂白利用受體漂白FRETFRET和和Western blottingWestern blotting檢測檢測BACEBACE酶切酶切Briton Chance Center for Biomedical Photonics利用利用FRETFRET探針檢測探針檢測BACEBACE在分泌途徑的酶切在分泌途徑的酶切 利用受體漂白檢測

29、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中BACE的活性 利用受體漂白檢測高爾基體中BACE的活性 Briton Chance Center for Biomedical Photonics本章小結(jié)本章小結(jié)n為了檢測活細胞中的為了檢測活細胞中的BACEBACE活性，構(gòu)建了一個遺活性，構(gòu)建了一個遺傳編碼的真核表達傳編碼的真核表達FRETFRET探針探針dYCdYC和對照探針和對照探針dYcCdYcC。該探針能夠進入分泌途徑，并展示在細。該探針能夠進入分泌途徑，并展示在細胞膜。胞膜。ndYdY C C可在活細胞中被可在活細胞中被BACEBACE有效酶切，可用于動有效酶切，可用于動態(tài)檢測活細胞內(nèi)的態(tài)檢測活細胞內(nèi)的BACEBACE活性

30、，為活性，為BACEBACE抑制劑的抑制劑的開發(fā)提供了一個活細胞篩選的平臺。開發(fā)提供了一個活細胞篩選的平臺。n利用該探針分析了利用該探針分析了BACEBACE在分泌途徑中具備酶活在分泌途徑中具備酶活性的起始位點，證實性的起始位點，證實BACEBACE早在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中就具有早在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中就具有酶活性，能夠?qū)ζ涞孜镞M行酶切。酶活性，能夠?qū)ζ涞孜镞M行酶切。Briton Chance Center for Biomedical Photonics提綱提綱n研究背景研究背景n研究目的、意義及主要內(nèi)容研究目的、意義及主要內(nèi)容n構(gòu)建用于檢測構(gòu)建用于檢測分泌酶活性的分泌酶活性的FRETFRET探針及探針及其鑒定其鑒

31、定 n活細胞內(nèi)活細胞內(nèi)分泌酶活性的分泌酶活性的FRETFRET成像研究成像研究 n利用受體漂白利用受體漂白FRETFRET技術(shù)研究活細胞內(nèi)技術(shù)研究活細胞內(nèi)分分泌酶的二聚化泌酶的二聚化 n總結(jié)與展望總結(jié)與展望n主要創(chuàng)新點主要創(chuàng)新點n致謝致謝Briton Chance Center for Biomedical Photonics引言引言nBACE的活性部位的活性部位,即截去跨膜序列的可溶性即截去跨膜序列的可溶性BACE (BACE-NT, 對應(yīng)于氨基酸殘基對應(yīng)于氨基酸殘基1-454), 已經(jīng)被克隆和純已經(jīng)被克隆和純化，廣泛應(yīng)用于體外化，廣泛應(yīng)用于體外-分泌酶抑制劑的篩選；分泌酶抑制劑的篩選；n在

32、基于可溶性在基于可溶性BACEBACE結(jié)構(gòu)來設(shè)計抑制劑的過程中遇到了結(jié)構(gòu)來設(shè)計抑制劑的過程中遇到了困難困難, , 因為其晶體結(jié)構(gòu)中有一個異常的大縫隙；因為其晶體結(jié)構(gòu)中有一個異常的大縫隙；n最近最近, Haass C., Haass C.小組利用非變性凝膠電泳和免疫共沉小組利用非變性凝膠電泳和免疫共沉淀的方法淀的方法, , 發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)BACEBACE以同源二聚體的形式存在；以同源二聚體的形式存在；n本文利用本文利用FRETFRET技術(shù)在活細胞條件下無損傷地研究技術(shù)在活細胞條件下無損傷地研究BACEBACE的二聚化。的二聚化。 Briton Chance Center for Biomedical

33、Photonics實驗流程實驗流程FPs標(biāo)記蛋白標(biāo)記蛋白的構(gòu)建的構(gòu)建質(zhì)粒的鑒定質(zhì)粒的鑒定融合蛋白的表融合蛋白的表達和定位達和定位分別用CFP和YFP標(biāo)記全長的BACE（BACEFL）和BACE的活性部分（BACENT）所構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)酶切和測序鑒定利用受體漂白FRET方法分別檢測BACEFL和BACENT在活細胞中的存在形式二聚化檢測二聚化檢測利用共聚焦熒光顯微鏡分別檢測BACEFL和BACENT在活細胞中的表達和定位Briton Chance Center for Biomedical Photonics質(zhì)粒的構(gòu)建質(zhì)粒的構(gòu)建PCR products of mCerulean or mCitri

34、ne Cleaved by XhoI and AgeILigated by T4 DNA ligaseBriton Chance Center for Biomedical Photonics質(zhì)粒鑒定質(zhì)粒鑒定1 2 3重組質(zhì)粒的酶切鑒定電泳圖譜。pBACE-FL/CFP的測序結(jié)果 Briton Chance Center for Biomedical Photonics熒光融合蛋白在熒光融合蛋白在HeLaHeLa細胞中的表達及定位細胞中的表達及定位 轉(zhuǎn)染24小時后 BACE-FL和BACE-NT在HeLa細胞的表達。（A） pBACE-FL/CFP 和pEYFP-ER共轉(zhuǎn)染的HeLa細胞；（B

35、） pBACE-NT/CFP和 pEYFP-ER共轉(zhuǎn)染的HeLa細胞。 Briton Chance Center for Biomedical Photonics受體漂白受體漂白FRETFRET檢測檢測BACEBACE二聚化二聚化 利用apFRET檢測BACEFL的二聚化 利用受體漂白檢測BACE-NT/CFP和 BACE-NT/YFP之間的FRET效率 Briton Chance Center for Biomedical Photonics利用公式EF= (I-I) 100 /I計算FRET效率（EF）(n16)。BACE-FL組與對照組存在顯著差異（* *P0.05). Control，

36、單轉(zhuǎn)染pBACE-FL/CFP的細胞；BACE-NT， pBACE-NT/CFP和 pBACE-NT/YFP共轉(zhuǎn)染的細胞；BACEFL，pBACE-FL/CFP和 pBACE-FL/YFP共轉(zhuǎn)染的細胞 Briton Chance Center for Biomedical Photonics本章小結(jié)本章小結(jié)n基因工程技術(shù)分別構(gòu)建了基因工程技術(shù)分別構(gòu)建了CFPCFP和黃色熒光蛋白和黃色熒光蛋白YFPYFP標(biāo)記標(biāo)記的全長的全長BACEBACE（BACE-FLBACE-FL）和）和BACEBACE活性部分活性部分(BACE-NT)(BACE-NT)； n應(yīng)用共聚焦熒光顯微鏡和受體漂白應(yīng)用共聚焦熒光顯

37、微鏡和受體漂白FRETFRET技術(shù)研究了技術(shù)研究了BACE-FLBACE-FL和和BACE-NTBACE-NT在細胞中的表達和定位，以及它們在細胞中的表達和定位，以及它們在活細胞內(nèi)的存在結(jié)構(gòu)；在活細胞內(nèi)的存在結(jié)構(gòu)；nBACE-FLBACE-FL能夠定位到高爾基體、質(zhì)膜、內(nèi)體等細胞器中，能夠定位到高爾基體、質(zhì)膜、內(nèi)體等細胞器中，而而BACE-NTBACE-NT則被滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)里；則被滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)里；nBACE-NTBACE-NT是單體結(jié)構(gòu)，而是單體結(jié)構(gòu)，而BACE-FLBACE-FL在活細胞內(nèi)則以二聚在活細胞內(nèi)則以二聚體的形式存在；體的形式存在；n證明證明BACEBACE的跨膜序列和的跨膜序列和

38、C-C-末端對末端對BACEBACE的轉(zhuǎn)運和定位具的轉(zhuǎn)運和定位具有重要作用，其二聚體結(jié)構(gòu)由這些序列決定，而不由有重要作用，其二聚體結(jié)構(gòu)由這些序列決定，而不由酶的活性位點決定酶的活性位點決定 Briton Chance Center for Biomedical Photonics總結(jié)和展望總結(jié)和展望n構(gòu)建了構(gòu)建了5 5個熒光探針：個熒光探針：YcCYcC、Y Y C Cwtwt、Y Y C CSweSSweS、Y Y C CSweLSweL、Y Y C CNFEVNFEV，并在體外分析了其熒光特性和酶切效果；，并在體外分析了其熒光特性和酶切效果； n構(gòu)建了能進入分泌途徑的真核表達構(gòu)建了能進入分泌途徑的真核表達FRETFRET探針探針dYdY C C，dYdY C C可在活細胞中被可在活細胞中被BACEBACE有效酶切，可用于實時檢測有效酶切，可用于實時檢測活細胞中的活細胞中的BACEBACE活性，為活性，為BACEBACE抑制劑的開發(fā)提供了一抑制劑的開發(fā)提供了一個在體篩選的平臺；個在體篩選的平臺； n利用利用dYdY C C探針分析了探針分析了BACEBACE在分泌途徑中的活性，證實在分泌途徑中